全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（2）：357–364 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–09–04；修回日期：2013–12–25
基金项目：河南省科技攻关项目（092102110128）；郑州市科技计划项目（112PPTGY250-3）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yeyzh@163.com）
文心兰开花相关 OnAP1-like 基因的克隆及表达
分析
崔 波 1,2，武振江 2，刘 佳 2，张国付 2，袁秀云 1，叶永忠 2,*
（1 郑州师范学院生物工程研究所，郑州 450044；2 河南农业大学生命科学学院，郑州 450002）
摘 要：以南茜文心兰（Gower Ramsey）盛花期花葶提取的总 RNA 为模板，通过 RT-PCR 与 RACE
扩增，获得一个 958 bp 的 AP1（APETALA1）-like 基因的 cDNA 全长序列，其基因编码区 690 bp，共编
码氨基酸 229 个，命名为 OnAP1-like（登录号：KC426946）。蛋白质二级结构分析表明，该蛋白质 48.91%
为 α 螺旋，10.92%为 β 折叠，40.17%为无规则卷曲，为亲水性蛋白质。蛋白序列比对和进化树分析表明，
OnAP1-like 蛋白与蕙兰 AP1-like 蛋白一致性最高，进化距离最近。利用 RT-qPCR 对从文心兰不同时期不
同器官中的 OnAP1-like 基因表达量进行分析，结果表明，同一器官不同发育时期比较，在叶中，花蕾期
的表达量最高；在根中，随发育时间推移，表达量逐渐升高，至花后期达到最高；在花葶中的表达量的
趋势与根相同。同一时期不同器官比较，抽葶前，根中表达量高于叶片；花蕾期，花瓣中的表达量最高；
盛花期和花后期，花葶中的表达量最高。推测该基因在花的发育及形成中发挥作用。
关键词：文心兰；MADS-box 基因 AP1-like；RT-qPCR；克隆；表达分析
中图分类号：S 682.31 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）02-0357-08

Cloning and Expression Analysis of OnAP1-like Gene from Oncidium
‘Gower Ramsey’
CUI Bo1,2，WU Zhen-jiang2，LIU Jia2，ZHANG Guo-fu2，YUAN Xiu-yun1，and YE Yong-zhong2,*
（1Institute of Biotechnology，Zhengzhou Normal University，Zhengzhou 450044，China；2College of Life Science，Henan
Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）
Abstract：A full-length 958 bp cDNA of AP1（APETALA1）-like was obtained by RT-PCR and RACE
amplification the total RNA extracted from the scapes of Oncidium‘Gower Ramsey’（Orchidaceae）at
flowering stage. The gene consisted of 690 bp gene encoding region which encoding a protein of 229
amino acids，was designated as OnAP1-like（accession number：KC426946）. The analysis of secondary
structure of protein showed that the protein was hydrophilic，and it contained 48.91% of α-helix，10.92%
of β-sheet and 40.17% of random coil. The analysis of protein sequence alignment and cluster showed that
the OnAP1-like was close to AP1-like of Cymbidium faberi with an overall sequence similarity. Using
RT-qPCR to analysis the expression quantity of OnAP1-like of different organs from Oncidium in different
stages，the results showed that in different development stages，the expression level of leaves was the highest

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in flower budding stage，that of root and scapes gradually increased with development and obtained the
highest expression level at post-flowering stage. In different organs，the expression level of roots was
higher than that of leaves before reproductive growth stage；The expression level of petals was the highest
in flower budding stage，and that of scapes was the highest in flowering and post-flowering stage. The
results suggest that OnAP1-like gene play a significant role in the development and formation of flowers in
Oncidium‘Gower Ramsey’.
Key words：Oncidium；MADS-box gene AP1-like；RT-qPCR；clone；expression analysis

植物由营养生长转向生殖生长的过程受 CONSTANS（CO）、FLOWERING LOCUS C（FLC）等
成花计时基因的调控；通过 CO 和 FLC 的作用激活花分生组织特异基因，引起茎分生组织分化特征
的改变，不再产生叶原基而代之以花原基（Long & Barton，2000）。花分生组织特异基因包括 LEAFY
（LFY）、APETALA1（AP1）和 CAULIFLOWER （CAL），表达于花发育的早期阶段并最终决定花发
育的命运（Lohmann & Weigel，2002）。其中 AP1 基因是植物特有的 MIKCC-Type MADS-box 基因
（Becker & Theiβen，2003），具有高度的保守性。AP1 基因即是花分生组织特征基因，又是花器官
形态特征基因（Irish & Isussex，1990；Mandel et al.，1992），在花发育的 ABC 模型、ABCD 模型和
ABCDE 模型中，AP1 基因属于 A 类基因（Mandel & Yanofsky，1995；Thomas，2004），是萼片和
花瓣正常发育所必需的。近年来研究者已经从多种植物中分离得 AP1 同源基因，并对其表达特征和
功能进行了研究（Sung et al.，1999；Kim et al.，2005；Adam et al.，2006，2007；Fernando & Zhang，
2006；Song et al.，2008），但有关文心兰 AP1（APETALA1）基因的克隆和研究还未见报道。
文心兰为兰科（Orchidaceae）文心兰属（Oncidium）植物的总称，又名舞女兰（卢思聪，1994）、
跳舞兰，原产于中南美洲和北美洲南部。其花序分枝性良好，花形优美，花色亮丽，具有良好的观
赏价值（Prasshart & Madhuri，1997；Santana & Chaparro，1997）。文心兰以切花消费为主，主要集
中于美国、日本市场，泰国、新加坡是主要的生产国。目前以传统杂交育种的方法只能有效改变花
色，而对文心兰的生长习性、开花时间、花期长短并无多大影响。本研究中以文心兰的花葶为试验
材料，用 RT-PCR 与 RACE 方法克隆了 OnAP1-like 基因的序列全长，使用 RT-qPCR 对文心兰不同
时期不同器官中的 OnAP1-like 表达量进行定量分析，为研究其生理功能及其该基因在文心兰中的表
达和调控奠定基础，为构建 OnAP1-like 基因的表达载体，培育早花文心兰品种提供条件。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验所用文心兰为南茜文心兰（Gower Ramsey），来自郑州师范学院智能温室。2011 年 10—
12 月分别取抽葶前期、花蕾期、盛花期、花后期的叶片、根、花葶、花瓣、柱头、萼片等材料进行
特异表达分析。所有材料均在液氮中速冻后存于–80 ℃冰箱保存备用。
用文心兰盛花期的花葶提取 RNA 进行基因克隆。
TaqDNA 聚合酶、T4-DNA 连接酶、DNA Marker 等工具酶均为宝生物工程（大连）有限公司产
品；新型植物 RNA 提取试剂盒（Invitroigen 公司）。质粒小提试剂盒、普通琼脂糖 DNA 回收试剂
盒、dNTP为天根生化科技（北京）有限公司产品。所用质粒 pMD19-T和大肠杆菌DH5α均购自TaKaRa
公司。
2 期 崔 波等：文心兰开花相关 OnAP1-like 基因的克隆及表达分析 359

1.2 总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成
将文心兰花期花葶在液氮中研磨至粉状，用 Trizol（Invitroigen 公司）试剂提取其总 RNA，用
琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA 的完整性。以提取的总 RNA 为模板，用 M-MLV 反转录酶（TaKaRa 公
司）合成第一链；反转录反应参照 Ferrnentas RevertAidTM First strand cDNA synthesis Kit 使用说明。
1.3 OnAP1-like 基因序列的克隆与分析
根据 GenBank 中已登录的 AC092556.8（水稻）、NM_105581.2（拟南芥）、FJ687750.1（大麦）、
EF591648.1（大麦）、AY747604.1（小麦）、AY747598.1（圆锥小麦）、AY747599.1（小麦）、
DQ146421.1（一粒小麦）、AY747606.1（小麦）AP1 保守序列，设计 1 对简并引物用于 AP1 保守
序列的扩增。上游引物 F：CTGAAG（A\C\G）GGATMGAGAACAAGAT；下游引物 R：CAAGC
TGCTGCTC（C\A\T）A（A\G）GTGTTG。以文心兰花期花葶 RNA 反转录的 cDNA 为模板进行 PCR
扩增。
基于OnAP1-like基因片段序列测定结果，分别设计了 3′和 5′端引物AP-3：TCAGGCAGGGGAAA
GCTCTACG 和 AP-5：TCCTGAGGCTGGGATTCGTTTA；UPM 通用引物由 RACE 试剂盒提供。根
据试剂盒说明，OnAP1-like 基因片段的 3′末端用 AP-3 和 UPM 引物扩增，其 PCR 反应条件为：
94℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，58 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环，最后 72 ℃延伸
10 min。OnAP1-like 基因片段的 5′末端用 AP-5 和 UPM 引物扩增，其 PCR 反应条件为：94 ℃预变
性 3 min，94 ℃变性 30 s，68 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min。
PCR 产物经过回收、纯化，与 pMD19-T vector（购自宝生物工程公司）连接，转化 DH5α 感受态细
胞，蓝白斑筛选后送去测序。根据 DNAMAN 和 Primer Premier 5.0 软件拼接得到 OnAP1-like 基因序
列全长并设计 1 对引物 APF 和 APR，用于完整开放阅读框（ORF）的扩增。以文心兰总 RNA 的 cDNA
为模板，PCR 反应程序为：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，57 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 3 min，
30 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min。
已有序列的检索使用 GenBank 的 Blast（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/），引物设计采用
Primer Premier 5.0，序列拼接及分析采用 DNAMAN 软件。蛋白质亲疏水性采用 ProtScale 程序（http：//
expasy.org/tools/protscale.html/）分析；蛋白质二级结构预测采用 ExPASy 网站上的 GOR（Protein
secondary structure prediction）；系统进化树使用 MEGA4.0 软件的 Neighbor-joining 法建成。
1.4 RT-qPCR 分析
采用 Trizol（Invitroigen 公司）方法分别提取文心兰抽葶前期、花蕾期、盛花期、花后期等的叶、
根、花葶、花瓣、花萼和蕊柱的总 RNA，用微量分光光度计进行检测，参照 PrimeScript® RT reagent
Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）使用说明进行反转录反应。反应结果再用微量分光光度计
检测浓度，检测结果显示纯度较高，可以用于进行 RT-qPCR 试验。根据所测浓度将反转录的 cDNA
第一链稀释 5 倍备用。
参照 SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ（购自宝生物工程有限公司）使用说明，用 RT-qPCR（Real-time
quantitative PCR，RT-qPCR）的方法，检测基因的相对表达量。分别设计上游和下游引物 WXTAP1-qF：
AACTACTTGATTCCATTGCCGAG 和 WXTAP1-qR：GTTTATGGAGGAGACGGTTAGTG，预测产
物长度为 185 bp，以适用于 RT-qPCR。以文心兰（Oncidium Gower Ramsey）的 GAPDH 基因（GenBank
登录序列号为：JN981141）作为内参基因，其引物设计为 WXTGAPDH-qF：AGATGCCCCAATGTT
CGTT 和 WXTGAPDH-qR：GAGTAGCCGTCATTGCGTG 预测产物长度是 176 bp，以适用于荧光定
量 PCR。
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图 2 OnAP1-like 基因的 3′RACE 和 5′RACE PCR 扩增结果
M：Marker；1：5′RACE PCR 产物；2：3′RACE PCR 产物。
Fig. 2 The PCR results of 3′RACE and 5′RACE for OnAP1-like
M：Marker；1：PCR product of 5′RACE；2：PCR product of 3′RACE.
OnAP1-like 基因的反应体系为 20 µL，其中 SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ10 µL，cDNA 2 µL，引物
WXTAP1-qF（10 µmol · L-1）和 WXTAP1-qR（10 µmol · L-1）各 0.8 µL，6.4 µL ddH2O。反应程序为：
94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 15 s，56 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 20 s，40 次循环，每次循环的第 3
步进行荧光采集，绘制熔点曲线。内参基因GAPDH 的反应体系为 20 µL，其中 SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ
10 µL，cDNA 2 µL，引物 WXTGAPDH-qF（10 µmol · L-1）和 WXTGAPDH-qR（10 µmol · L-1）各
0.8 µL，6.4 µL ddH2O。其反应程序与 OnAP1-like 基因的反应程序相同。OnAP1-like 基因和内参基
因 GAPDH 的所有样品均做 3 次重复，并分别对两个基因各做 1 个空白对照，对照同样重复 3 次。
2 结果与分析
2.1 OnAP1-like 基因的克隆与序列分析
以文心兰盛花期花葶总 RNA 反转录的 cDNA 为模板，扩增出 1 条长度为 376 bp 的特异性片段
（图 1）。经过琼脂糖凝胶回收纯化产物测序并在 NCBI 上 Blast 分析，该蛋白与多种植物的 AP1 序
列有较高的同源性，证明该扩增产物是 AP1（APETALA1）基因片段。
根据扩增出的基因片段分别进行 3′-RACE和 5′-RACE的扩增（图 2）并进行测序，利用DNAMAN
和 Primer5.0 生物软件拼读出 OnAP1-like 基因的全长，全长序列为 958 bp，命名为 OnAP1-like（登
录号：KC426946）。对获得该基因全长进行分析表明，其含有 1 个编码 229 个氨基酸的完整开放阅
读框，包含起始密码子和终止密码子。



2.2 OnAP1-like 基因氨基酸序列的同源性比较
OnAP1-like 基因的氨基酸列分析结果表明，该氨基酸序列属于植物特有的 MIKC 型 MADS-box
基因，包含典型的 MADS 盒和 K 盒，其中 MADS 盒包含 61 个氨基酸组成的高度保守的结构域，中
度保守的 K 盒包含 91 个氨基酸（图 3）。蛋白质亲疏水性分析结果表明，该蛋白属于亲水性蛋白，
其二级结构预测结果表明，二级结构中 48.91%为 α 螺旋，10.92%为 β 折叠，40.17%为无规则卷曲
状态。
将 OnAP1-like 基因与其它植物 AP1 基因的的氨基酸序列进行同源性比对（图 3），发现它们有
较高的同源性。一致性分析表明，OnAP1-like 与萼脊兰（Sedirea japonica，AFI93492.1）、蕙兰
（Cymbidium faberi，AEX86945.1）、玉米（Zea mays，AFW67591.1）、油棕（Elaeis guineensis，
图 1 OnAP1-like 基因片段的 PCR 扩增结果
M：Marker；1：PCR 产物。
Fig. 1 The PCR result based on OnAP1-like gene fragment
M：Marker；1：Product of PCR.
2 期 崔 波等：文心兰开花相关 OnAP1-like 基因的克隆及表达分析 361

ABC73604.1）、水稻（Oryza sativa，AAF19047.1）的一致性分别为 69%、67%、69%、67%、66%。

图 3 OnAP1-like 基因 main ORF 推导的氨基酸序列的多重比对分析
Fig. 3 Alignment of the predicted amino acid sequence of OnAP1-like gene ORF in Oncidium and those of several other plants

在 NCBI 上用 OnAP1-like 的氨基酸序列进行 Blast，选取几种有代表性植物的序列，利用
MEGA4.0 软件对其进行进化树分析（图 4），结果表明，该 OnAP1-like 基因属于 A 类 MADS-box
基因，与单子叶植物进化距离较近。其中 OnAP1-like 与兰科植物蕙兰（Cymbidium faberi）AP1-like
亲缘关系最近，与蝴蝶兰（Phalaenopsis amabilis）AP1-related、萼脊兰（Sedirea japonica）AP1-like
的亲缘关系较远，与石斛兰（Dendrobium nobile）MADS-box 的亲缘关系最远。基于氨基酸序列的
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系统进化树可以看出其氨基酸的进化与植物的进化基本一致。


图 4 OnAP1-like 基因与不同来源 AP1 基因氨基酸序列的聚类分析
Fig. 4 Phylogenetic tree of amino acid sequence of AP1 gene from various species including OnAP1-like
2.3 OnAP1-like 基因的时空表达分析
OnAP1-like 和内参基因 GAPDH 的熔点曲线显示两者分别只有 1 个 Tm值，表明 OnAP1-like 和
GAPDH 所用引物具有高度特异性，并且将 PCR 产物连接到 PMD19-T（TaKaRa 公司）后转化到大
肠杆菌 DH5α（TaKaRa 公司）中进行测序，发现其 PCR 扩增产物确实为目的片段，且不含引物二
聚体。
自然条件下生长的文心兰不同时期不同器官中 OnAP1-like 的表达量如图 5 所示。以表达量最低
的抽葶前期的叶片定为“1”，以相对定量公式 2-∆∆Ct 计算并作图，由图 5 可以看出，OnAP1-like 随


图 5 不同时期和器官中 OnAP1-like 的时空表达分析
Fig. 5 The expression analysis in different period and tissue of OnAP1-like gene

2 期 崔 波等：文心兰开花相关 OnAP1-like 基因的克隆及表达分析 363

着发育时间的推移和生殖生长的进行，花葶中的表达量变化最为显著，并且呈逐渐升高的趋势，在
根中的表达量也逐渐升高，花蕾期花瓣中和盛花期花葶中表达量最高。
3 讨论
为了探讨 OnAP1-like 基因在文心兰中的功能，本试验中对该基因序列进行了同源性比对和进化
分析，并对其在不同时期不同器官中的表达进行了 RT-qPCR 检测。结果显示：该基因与萼脊兰的同
源性最高，为 69%，可见 OnAP1-like 基因与典型的 AP1 基因有一定区别。从进化角度分析，物种
从低等到高等进化的过程中，基因也随形态逐渐完成了不同程度的分化过程。Hasebe 等（1998）对
低等蕨类植物的研究发现大多数 MADS-box 基因在生殖器官及营养器官中都有表达，而种子植物绝
大多数 MADS-box 基因只专一在花器官内表达，只有少数在生殖器官和营养器官中都表达，因此推
测专一在生殖器官中表达的基因是由普遍表达的基因进化而来的，后者产生一些同源异型基因专一
负责生殖器官的发育，并且它们的表达也限制在专一的花器官组织中。如拟南芥典型的 AP1 基因，
在花发育的早期调节花分生组织特性，在花原基中可以检测到 AP1 RNA，在随后花的发育中，AP1
负责萼片和花瓣的发育，这时 AP1 RNA 只在第 1 轮和第 2 轮中即萼片和花瓣中存在（Jofuku et al.，
1994）。这种基因表达的限制可能发生在蕨类植物和种子植物分离之后。由图 5 看出，OnAP1-like
基因在文心兰各个器官中都有表达，与蕨类植物有相似之处，而与典型的 AP1 基因只专一在花器官
中表达不同，这种不同也与同源性序列的分析一致。多项研究表明 AP1 在植物的生殖生长过程中对
花的发育起至关重要的作用，是影响花的形态建成的关键基因（丁峰 等，2011）。该基因的转基因
植株多表现为提早开花的特性（Weigel & Ove，1995；Sarah et al.，1999；吕晋慧 等，2007），说明
了 AP1 基因对花的影响巨大。从图 5 可看出 OnAP1-like 基因在文心兰花葶中表达非常显著，与双子
叶植物不同，兰科植物中花葶作为介于营养器官与生殖器官之间的重要器官，其 OnAP1-like 基因的
高表达量正是该基因对生殖阶段发育影响的一种体现。此外，分析图 5 有如下推测：从文心兰同一
器官发育的不同时期看：在叶片中，抽葶前表达量最低，但是在花蕾期突然升高，再次说明 OnAP1-like
基因确实和花的发育有关，有可能是促使开花的信号，证明该基因的高表达可能是文心兰开花的信
号；花瓣中，花蕾期 OnAP1-like 的表达量大于盛花期，由于花蕾期是花器官形态建成的重要时期，
推测 OnAP1-like 基因对花的形态建成有影响。MADS-box 基因广泛存在于高等植物，几乎涉及植物
发育的整个过程，包括参与营养生长的调节、子房和种皮发育、根形成、胚形态建成、共生诱导等
（黄方 等，2012）。随着 ABC 模型的发展及四因子模型的建立，认为植物 MADS-box 基因之间往往
形成二聚体直接或者间接发挥作用，因此推断，OnAP1-like 基因主要影响文心兰花的发育，同时也
间接调控植株整体的生长发育。
目前对 AP1 基因以及与 AP1 同源的 MADS-box 基因的克隆已有大量报道（黄方 等，2012），
关于 AP1 基因的研究在双子叶植物中报道较多，在兰科植物中少见报道。为进一步确定 OnAP1-like
在文心兰花发育过程中的功能，正在构建 OnAP1-like 基因的过表达载体，进行遗传转化，期望通过
分析转基因植株的表型最终确定 OnAP1-like 基因的功能。MADS-box 基因家族是 1 个庞大的家族，
其对花的形成与发育的作用是毋庸置疑的，其具体功能与调控方式尚不明了，研究有待进一步深入。

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