全 文 ：基因工程是培育花卉新品种的重要方法，也为兰花的
品种改良提供了广阔的前景。目前报道的关于兰花转基因
方面的研究较多地涉及兰花受体材料的类型、转化的目的
基因等[1]。兰花遗传转化主要以原球茎、愈伤组织或幼胚作
为受体材料，且多以GUS基因为报告基因[2]。GUS基因具有
良好的稳定性，灵敏度高，易于检测，是目前植物基因工程
研究工作中使用最广泛的一种报告基因[3]。为此，笔者以蝴
蝶兰和文心兰为材料，对其遗传转化体系进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物受体材料。以培养2周的蝴蝶兰原球茎和培养
3周的文心兰愈伤组织为试验材料。
1.1.2 菌株与质粒。试验所用的菌株与质粒见表1。该研究
所用质粒为pBI121，以卡那霉素抗性基因为选择标记基因，
启动子为CaMV35S，终止子为胭脂碱终止子NOS!term。
1.1.3 培养基。大肠杆菌（E.coli）生长培养基；农杆菌培养基。
1.2 方法
1.2.1 菌种培养条件及菌种保存。
1.2.1.1 培养条件。大肠杆菌：在LB培养基中培养，液体培
养于37℃摇床振荡培养（250r/min），平板培养于37℃恒温
箱倒置培养。
根癌农杆菌：在YEB或YEP培养基中培养，液体培养
于28℃摇床振荡培养（200r/min），平板培养于28℃恒温箱
倒置培养。
1.2.1.2 菌种保存。短期保存：大肠杆菌划线培养于含适当
抗生素的LB培养基平板上，4℃存放约4周。农杆菌培养
于含适当抗生素的YEB培养基平板上，4℃存放约4周。
长期保存：1.0ml过夜培养的菌液培养物与0.5ml60%
灭菌甘油充分混合后，保存于-80℃冰箱。
1.2.2 材料预培养。取培养3周的蝴蝶兰原球茎和培养3
周的文心兰愈伤组织，切割成小块后将受体材料置入预培
养培养基中。预培养时间分别为0、1、2、3、4、5d。
1.2.3 农杆菌培养。从上述转化的农杆菌（EHA105、AGL1、
LBA4404）中，随机挑选单菌落，在5ml附加相应抗生素的
YEB液体培养基中于28℃、250r/min振荡培养过夜。以OD
值分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5时的浓度作为侵染菌液的浓度。
1.2.4 侵染。于超净工作台上，将农杆菌置于20℃平衡几
分钟，然后从培养瓶中取出蝴蝶兰原球茎和文心兰愈伤组
织，侵入菌液中分别侵染5、10、15、20、25、30min，取出放入
垫有数层无菌滤纸的培养皿中，以吸去多余的菌液。
1.2.5 酚类诱导物（AS）对转化的影响。将 AS加入共培养
培养基中，记录产生的蓝斑数。AS浓度分别为 0、50、100、
150、200μmol/L。
1.2.6 共培养转化。将侵染后的蝴蝶兰原球茎和文心兰愈
表1 试验中使用的菌株和质粒
Table1 Plasmidsandbacterialstrainsusedinthetest
菌株或质粒
Strainsorplasmids
有关特性
Specialty
来源
Source
pBI121 植物表达载体，
CaMV35S启动子
广西作物遗传改良生物技
术重点开放实验室
大肠杆菌JM109 用于兰花遗传转化 广西大学生命科学院
EHA105 用于兰花遗传转化 广西大学生命科学院
AGL1 用于兰花遗传转化 广西大学生命科学院
LBA4404 用于兰花遗传转化 广西大学生命科学院
基金项目 广西科学基金项目（桂科回0575005）。
作者简介 满若君（1981-），女，黑龙江哈尔滨人，硕士，副研究员，从
事作物遗传育种方面的研究。*通讯作者，E!mail：yangnv@
126.com。
收稿日期 2007!12!21
蝴蝶兰·文心兰遗传转化体系的初步研究
满若君 1，3，卜朝阳 2*，李杨瑞 3 （1.广西民族大学，广西南宁 530007；2.广西农业科学院生物所，广西南宁 530007；3.广西作物遗传改良
生物技术重点开放实验室，广西南宁 530007）
摘要 [目的]优化蝴蝶兰和文心兰的遗传转化条件。[方法]以培养3周的蝴蝶兰原球茎和文心兰愈伤组织为试材，以大肠杆菌为生
长培养基，研究3种农杆菌菌株的侵染力，以及菌液浓度、侵染时间、酚类诱导物（AS）和共培养时间对转化的影响。[结果]以蝴蝶兰
原球茎为农杆菌介导的外植体进行遗传转化的优化条件为：预培养时间3d，菌液侵染浓度OD600=0.3，菌液侵染时间10min，pH值
5.4，菌液侵染后，与农杆菌共培养5d并添加100μmol/LAS，此条件下的瞬间表达率最高。将蝴蝶兰遗传转化的条件运用于文心兰，
得到的转化率较低。3种农杆菌菌株中，EHA105菌株侵染力最强，其次是AGL1，LBA4404最弱。[结论]该研究为进一步研究蝴蝶兰和
文心兰的遗传转化体系提供理论依据。
关键词 蝴蝶兰；文心兰；农杆菌介导；遗传转化
中图分类号 S682.31 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2008）08-03129-03
PreliminaryStudyontheGeneticTransformationSystemsofPhalaenopsisandOncidium
MANRuo!junetal(GuangxiUniversityforNationalities,Nanning,Guangxi530007)
Abstract [Objective]ThepurposewastooptimizethegenetictransformationconditionofPhalaenopsisandOncidium.[Method]With
PhalaenopsisprotocormsandOncidiumcaliculturedfor3weeksastestedmaterials,Escherichiacoliasgrowthmedium,theinfectivityof3
agrobacteriumstrains,theefectsofbacteriumconcn.,infectingtime,phenolsinducer(AS)andco!culturetimeonthetransformationwere
studied.[Result]WithPhalaenopsisprotocormsasexplantsfortheagrobacterium!mediatedtransformation,theoptimizingconditionforgenetic
transformationwaspre!culturetimeof3d,bacteriumconcn.ofOD600=0.3,infectingtimeof10minandpHvalueof5.4,theinfectedbacterium
solutionbeingco!culturedwithagrobacteriafor5dandadded100μmol/LAS,underwhichtherateofinstantaneousexpressionwashighest.The
transformationrateobtainedbyapplyingthegenetictransformationconditionofPhalaenopsisonOncidiumwaslower.Amongthe3agrobacterium
strains,theinfectivityofstrainEHA105wasthestrongest,thatofAGL1wassecondaryandthatofLBA4404wasweakest.[Conclusion]Thestudy
providedtheoreticalfoundationforfurtherstudyingthegenetictransformationsystemsofPhalaenopsisandOncidium.
Keywords Phalaenopsis;Oncidium;Agrobacterium!mediatedtransformation;Genetictransformation
安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2008,36(8):3129-3131 责任编辑 姜 丽 责任校对 王 淼
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.08.108
伤组织放入共培养基上，放到暗培养箱中，于25℃下将细菌
和外植体分别共培养1、2、3、4、5、6d，之后进行GUS检测。
1.2.7 GUS活性检测。参照《植物基因工程》[4]，稍有改进。
（1）将共培养后的蝴蝶兰原球茎和文心兰愈伤组织用
增殖液体培养基+Cef200mg/L液冲洗3次，然后用无菌水
冲洗3次，将共培养时沾染的菌体洗掉。
（2）将洗净的受体材料浸泡在GUS染液中，于37℃下
温育过夜。将没有转化的原球茎作为阴性对照。
（3）将温育后的受体材料转入70%乙醇中脱色2~3次，
至阴性对照材料呈白色。
（4）在显微镜下或肉眼观察，白色背景下的蓝色斑点即
为GUS表达位点。
2 结果与分析
2.1 不同预培养时间对转化的影响 从表2可以看出，预
培养在兰花的遗传转化过程中是必要的。蝴蝶兰原球茎在
预培养3d后的瞬时表达效果最好，表达率达到40.0%；预
培养5d后再作转化，GUS基因的瞬时表达率下降，表达率
为30.0%。文心兰愈伤组织在预培养 2d时的瞬时表达率
最大，为20.7%。
2.2 3种菌株侵染性比较 试验采用了3种农杆菌菌株，
即 EHA105、AGL1和LBA4404。其中，EHA105属于农杆碱
（Agr）型，特点是生长快，侵染力强。LBA4404属于章鱼碱
（Oct）型，特点是生长较缓慢，菌株培养过程中结球，但侵
染范围广。由表 3可以看出，无论是蝴蝶兰还是文心兰，
EHA105菌株侵染力都最强，其次是 AGL1，最弱的是
LBA4404。因此选EHA105菌株作为工程菌株。
2.3 菌液浓度对转化的影响 由图1可知，蝴蝶兰原球茎
的GUS瞬时表达率在OD600=0.3时达到最高，但侵染菌液的
OD600值在0.1~0.5时，对文心兰愈伤组织的GUS瞬时表达
率影响很小。
2.4 不同侵染时间对转化的影响 从图2可以看出，侵染
时间在 10min之内蝴蝶兰原球茎和文心兰愈伤组织的
GUS瞬间表达率较高；而侵染时间达到20min以后时，外
植体的表达率则降低。说明此时的外植体已经受到毒害而
开始缺氧、软腐。因此，蝴蝶兰原球茎在转化过程中的侵染
时间应为10min，文心兰愈伤组织的侵染时间应为5min。
2.5 不同浓度AS侵染对转化的影响 从表4可以看出，
添加AS有利于GUS瞬时表达阳性外植体。当AS浓度为100
μmol/L时，GUS瞬间表达比例最高，蝴蝶兰原球茎和文心
兰愈伤组织产生的蓝斑数均达到最高，分别是20、14个。随
着AS浓度继续升高，蓝斑数有所减少，AS表现出抑制作用。
2.6 共培养时间对农杆菌转化的影响 由图3可知，共培
养3d时文心兰的瞬时表达率最高；而共培养5d时蝴蝶兰
原球茎瞬时表达率最高。从外观上看，文心兰共培养3d和
蝴蝶兰共培养5d切口处接触的培养基上有明显可见的菌
丝出现，此时GUS的表达率最高。
3 结论与讨论
3.1 预培养对遗传转化的影响 外植体在转化前进行预
培养可以促进细胞分裂，分裂状态的细胞更容易整合外源
DNA，因而提高外源基因的瞬时表达和转化率[4]。外植体的
预培养时间与效果有明显关系，每一种外植体均有最佳预
表2 不同预培养时间对转化的影响
Table2 Efectsofdiferentpre!culturetimeon
transformationeficiency
预培养时间
Preculturetime
d
接种数
Inoculantnumber
个
0 30 3.3 6.7
1 30 13.3 10.0
2 30 26.6 20.7
3 30 40.0 16.7
4 30 33.3 16.7
5 30 30.0 13.3
表达率Expressionrate∥%
蝴蝶兰
Phalaeanopsis
文心兰
Oncidium
表3 不同农杆菌菌株侵染后GUS瞬间表达效率的比较
Table3 ComparisonofinstantaneousexpressionsofGUS
infectedbydiferentstrainsofAgrabacteriumtumefaciens
菌株
StrainsofA.tumefaciens
蝴蝶兰
Phalaeanopsis
文心兰
Oncidium
EHA105 +++ +++
AGL1 ++ ++
LBA4404 + +
注：+多少表示GUS瞬时表达的强弱。
Note:Thenumberof“+”standsfortheintensityofinstantaneousexpression
ofGUS.
表4 不同浓度AS对GUS瞬间表达的影响
Table4EfectsofdiferentconcentrationofASoninstantaneous
expressionofGUS
AS浓度
ASconcentration
μmol/L
接种数
Inoculantnumber
个
0 30 5 6
50 30 8 7
100 30 20 14
150 30 16 10
200 30 15 11
蓝斑数Bluespotsnumber∥个
蝴蝶兰
Phalaeanopsis
文心兰
Oncidium
图1 不同菌液浓度对GUS瞬时表达率的影响
Fig.1 Efectsofdiferentbacteriumconcentrationson
instantaneousexpressionofGUS
20
40
60
80
100
0
0.40.30.20.1 0.5
OD600
G
U
S
瞬
间
表
达
率
In
st
an
ta
ne
ou
s
ex
pr
es
si
on
of
G
U
S∥
% 蝴蝶兰Phalaeanopsis
文心兰Oncidium
10
20
30
40
50
0
5 25201510 30
t/min
图2 不同侵染时间对GUS瞬时表达率的影响
Fig.2 Efectsofdiferentinfectiontimeoninstantaneous
expressionofGUS
G
U
S
瞬
间
表
达
率
In
st
an
ta
ne
ou
s
ex
pr
es
si
on
of
G
U
S∥
% 蝴蝶兰Phalaeanopsis
文心兰Oncidium
安徽农业科学 2008年
3130
（上接第3121页）
条件较恶劣，且离水源较远，采用新型保水剂既能保证先锋
复绿植物鬼针草生长期间水分的有效供应，又能提高其成
活率、坡面覆盖率和护坡效果。
参考文献
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40
50
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0
54321 6
图3 不同共培养时间对GUS瞬间表达的影响
Fig.3 Efectsofdiferentco!culturetimeonthe
instantaneousexpressionofGUS
蝴蝶兰Phalaeanopsis
文心兰Oncidium
G
U
S
瞬
间
表
达
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an
ta
ne
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pr
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G
U
S∥
%
培养时间。预培养时间太长会降低外植体转化率，甚至农杆
菌侵染后外植体死亡，一般以 2~3d为宜。该研究发现，蝴
蝶兰原球茎和文心兰愈伤组织的预培养时间分别是3、2d
最佳，瞬时表达效果最好。
3.2 菌液浓度和侵染时间对遗传转化的影响 掌握外植
体在菌液中浸泡的时间有助于减少后继培养中可能造成的
污染，并可减轻细菌对植物细胞的毒害作用[5]。一般控制在
数秒钟至数分钟内。浸泡时间太短农杆菌尚未接种到伤口
面，培养时无农杆菌生长，不能转化。如果外植体在菌液中
浸泡时间太长，常因农杆菌毒害缺氧而软腐，一般不要超过
30min。蝴蝶兰原球茎浸泡在OD600=0.3的农杆菌中10min
其瞬时表达最好；而文心兰愈伤组织对菌液浓度不敏感，其
侵染时间在5min时瞬间表达最好。
3.3 AS对侵染效果的影响 在植物方面，AS的加入促进
了植物与农杆菌天然亲和性相关基因的高效表达。在农杆
菌方面，AS促进了与转移有关的Vir基因的活化，从而大大
促进了农杆菌向植物细胞的附着和转移。在一些单子叶植
物的遗传转化中，AS的加入可明显提高转化效率，不加AS
则转化效率几乎为零。另外，在农杆菌介导的一些单子叶
植物，甚至双子叶植物的遗传转化中，虽然AS不是成功转
化所必需的，但加入AS可以大大提高转化效率[6]。实际上，
AS已经成了应用农杆菌介导的转化方法转化植物的试验
中添加的促进转化的常规试剂。在该试验中也得到了同样
的结果，发现在培养时添加100μmol/L的AS可以显著提
高蝴蝶兰和文心兰的转化效率。
3.4 共培养与转化的关系 当共培养时间过短时，农杆菌
增殖生长不良，外植体切口边缘只有很少的农杆菌生长，转
化的机率较低；当共培养时间过长时，农杆菌已大部分或全
部覆盖外植体，此时的表达率变化不大。GUS表达率下降可
能是由于GUS的表达主要是由切口处的农杆菌侵染引起，
以后农杆菌再繁殖不能引起表达率的提高，而且农杆菌的
繁殖可能很快引起外植体细胞活力的下降所致。
确定最佳共培养时间的方法主要采用GUS基因瞬时
表达测定法，即共培养定时测定外植体的GUS基因颜色反
应，统计瞬时表达率，以表达率高的为优。同时还要考虑外
植体的受损程度，以保证外植体的旺盛生长。该研究的结果
认为，蝴蝶兰遗传转化中共培养以5d为宜，文心兰以3d
为宜，其表达率高，外植体受损程度小。
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培养时间Culturetime∥d
满若君等 蝴蝶兰·文心兰遗传转化体系的初步研究36卷8期

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zljs/hyjs-yx-new.asp?recid=01128777.2&leixin=0.
[3]TACHIBANAR，SHIMIZUS.KOBAYSHIS，etal.Electronicwatermarkingmethodandsystem:US，6，915，001[P/OL].2002-04-25[2002-
05-28].htp：∥patftuspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sectl=PTO2&Sect2=HITOFF&p=1&u=/netahrml/search-bool.html&r=1&f=G&l=
50&col=AND&d=ptxt&sl=′Electronic+watermarking+method+system′.TTL.&OS=TTL/.
#############################################$#
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GB/T7714-2005
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