全 文 ：园艺学报，2016，43 (3)：538–548.
Acta Horticulturae Sinica
538 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0946；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2015–12–24；修回日期：2016–02–13
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-30-bc-3）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yfdong1234@163.com）
葡萄扇叶病毒实时荧光定量 RT-PCR 检测方法
的建立及应用
周 俊，范旭东，董雅凤*，张尊平，胡国君，任 芳，李正男
（中国农业科学院果树研究所，国家落叶果树脱毒中心，辽宁兴城 125100）
摘 要：根据葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleaf virus，GFLV）RNA2 序列设计 4 对特异性引物，通过
引物筛选、体系优化，建立了以 FL-HP1-F/R 为引物的 GFLV 的 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 RT-PCR 方
法。该方法标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，扩增效率为 100%，相关性系数为 0.998，
灵敏性分别是常规 RT-PCR 和巢式 RT-PCR 的 100 倍和 10 倍。重复性试验表明组内和组间变异系数均小
于 2.59%，显示该方法具有较好的检测稳定性。内参基因的稳定性测试结果表明葡萄 EF1 和 GAPDH 基因
具有较好的试验稳定性。利用建立的荧光定量方法测定 12 个葡萄样品中 GFLV 含量，并检测 58 个葡萄
样品，结果表明不同葡萄样品中 GFLV 含量差异较大，最高含量是最低含量的 81 245.5 倍，与 ELISA 和
巢式 RT-PCR 相比，实时荧光定量方法能检测出更多的 GFLV 分离物。
关键词：葡萄；葡萄扇叶病毒；实时荧光定量 RT-PCR；病毒浓度
中图分类号：S 663.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）03-0538-11

Development and Application of a Quantitative RT-PCR Approach for
Quantification of Grapevine fanleaf virus
ZHOU Jun，FAN Xu-dong，DONG Ya-feng*，ZHANG Zun-ping，HU Guo-jun，REN Fang，and LI
Zheng-nan
（National Center for Eliminating Viruses from Deciduous Fruit Tree，Research Institute of Pomology，Chinese Academy of
Agriculture Sciences，Xingcheng，Liaoning 125100，China）
Abstract：To establish high sensitivity and relative quantitative method of Grapevine fanleaf virus
（GFLV），the SYBR Green RT-PCR real time fluorescence quantitative method of FL-HP for GFLV was
established by using primer screen and system optimization. The results showed that a good linear
correlation（R2 = 0.998）obtained from standard curve of cDNA，and the amplification efficiency was 100%.
Sensitivity of real-time quantitative RT-PCR method was at least 100 times higher than that with
conventional RT-PCR and 10 times higher than that with nested RT-PCR，respectively. Three-time repeats
revealed that the coefficients of variation between the intra- and inter-assay were both within 2.59%，
indicating a reproducibility detection method to GFLV. The stability test results showed that EF1α and
GAPDH gene of grape has high stability. Real-time RT-PCR method was used to determine the content of

周 俊，范旭东，董雅凤，张尊平，胡国君，任 芳，李正男.
葡萄扇叶病毒实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立及应用.
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GFLV in 12 different grape plants and to detect a large number of grape samples（58）. There was
noticeable differences among the content of GFLV in 12 field samples，the highest content can reach to
81 245.5 times than the lowest，in the 58 samples，the real-time fluorescent quantitative RT-PCR method
can detect more GFLV isolates than DAS-ELASA and RT-nPCR.
Key words：grape；Grapevine fanleaf virus（GFLV）；quantitative RT-PCR；GFLV content

葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleaf virus，GFLV）可引起葡萄扇叶病，是全世界范围内危害葡萄
最为严重的病毒之一（Myles et al.，2011）。葡萄扇叶病可导致葡萄产量 10% ~ 80%的损失，引起葡
萄浆果中糖含量降低和可滴定酸度下降，并且缩短葡萄园的生产寿命（Andret-Link et al.，2004）。
GFLV 属线传多面体病毒属（Nepovirus），自然传毒介体为标准剑线虫 Xiphinema index（Hewitt et al.，
1958）和意大利剑线虫 X. italiae（Cohn et al.，1970）。带毒的繁殖材料和苗木是 GFLV 传播的主要
途径（Sanfacon et al.，2009）。GFLV 基因组包括两条单链正义 RNA——RNA1（7 342 nt）和 RNA2
（3 774 nt），RNA1 和 RNA2 的 5′端都带有一个小的共价链接病毒蛋白（VPg），3′端为 Poly A 结构，
RNA1 和 RNA2 分别仅编码一条多肽链（Andret-Link et al.，2004）。RNA1 主要编码一些与复制有
关的蛋白，而 RNA2 不仅编码一个 RNA2 复制必需的归巢蛋白（2AHP），还编码移动蛋白（2BMP）
和外壳蛋白（2CCP）。
尽管已报道了多种 GFLV 检测方法（蔡文启 等，1990，1992；谷洪仓 等，1994a，1994b；魏
梅生 等，1995，2014；何水涛 等，2001；牛建新 等，2003），但这些方法不仅灵敏度有待提高，
而且无法用于 GFLV 浓度测定。近来有多位研究者报道建立了高灵敏度可定量 GFLV 的实时荧光定
量 RT-PCR 检测方法（Osman & Rowhani，2006；Čepin et al.，2010；Pacifico et al.，2011；López-Fabuel
et al.，2013），并可用来监控不同时期不同部位 GFLV 含量的变化（Krebeij et al.，2015），但是中
国分离物与其他国家分离物基因序列存在明显差异（Zhou et al.，2015），因此，针对中国 GFLV 分
离物建立快速灵敏并可相对定量的实时荧光定量 RT-PCR 检测方法十分必要。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
2013 年 11 月从辽宁省兴城市中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心毒源保存圃采
集葡萄一年生休眠枝条，置于 4 ℃冰箱保存备用。
以采用 ELISA 法、常规 PCR 法、巢式 PCR 法检测均为阳性的葡萄样品‘桑多哈尼 1’（Zhou
et al.，2015）作为建立实时荧光定量 RT-PCR 检测体系的试材，选择巢式 PCR 检出 GFLV 的‘巧
保 2 号’、‘恰齐瓦赫’、‘苏珊玫瑰’、‘巨玫瑰 2’作为阳性样品，以未检出 GFLV 的‘无核白’
作为阴性样品。
2× Sybr Green qPCR Mix、pTOPO-TA Vector 购自北京艾德莱生物有限公司；实时荧光定量
RT-PCR 8 连管购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA
Eraser、PCR Fragment Recovery Kit 和大肠杆菌感受态细胞 DH5α 购自大连宝生物公司（TaKaRa），
M-MLV 逆转录酶购自普洛麦格（Promega）公司；10× PCR 缓冲液（含 20 mmol · μL-1 Mg+）、Taq
酶、dNTPs 购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；DNase/RNase Free dH2O 购自北京天根生化科技
有限公司；DNA Mark-D 购自 Sangon；Real-time PCR Thermal Cycler 为德国 Analytikjena 公司生
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产的 qTOWER 2.0 型。
1.2 总 RNA 提取及反转录
取葡萄休眠枝条韧皮部 100 mg，采用吸附柱法（MacKenzie et al.，1997）进行总 RNA 提取。
琼脂凝胶电泳检测 RNA 完整性，并在–80 ℃保存备用。SYBR Green qPCR 去除基因组 DNA 反转
录（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa）：取 5× gDNA Eraser buffer 2.0 μL，gDNA
Eraser 1.0 μL，总 RNA 1.0 μL 混匀，42.0 ℃ 2 min；加入以下混合液：PrimeScript RT Enzyme MixⅠ
1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，5× PrimeScript buffer 2 4.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL；37 ℃ 15 min，
85 ℃ 5 s，–20 ℃保存备用。
1.3 引物设计
根据本实验室扩增得到的 GFLV 的 RNA2 基因序列，利用 Oligo 7 软件设计特异性引物 FL-HP1
F/R、FL-HP2 F/R、FL-MP1 F/R 和 FL-CP1 F/R（表 1），用 NCBI 的 Primer-BLAST 进行比对，保证
引物的特异性。内参 Vv_GAPDH、Vv_EF1α、Vv_SAND 和 Vv_α-Tubulin 参考 Reid 等（2006）。引
物序列及 PCR 产物大小见表 1，所有引物均由 Sangon 合成。
1.4 常规 PCR 和克隆鉴定
常规 PCR 反应体系为 25 μL，含 10× Taq 酶缓冲液 2.5 μL，2.5 mol · L-1 dNTPs 2.0 μL，10 mol · L-1
上、下游引物各 0.5 μL，5 U · μL-1 Taq 酶 0.25 μL，模板 cDNA 2.0 μL，最后加灭菌纯水补足 25 μL。
PCR 反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循环 35 次；72 ℃ 7 min；
4 ℃终止反应。巢式 PCR 扩增体系和条件与 Zhou 等（2015）的相同。
PCR 扩增获得的目的 DNA 片段经 PCR Fragment RecoveryKit 回收纯化，取 4 μL 与 pTOPO-TA
Vector 连接，并转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，操作同说明书。挑取白色菌落进行菌液培养，PCR
鉴定获得重组质粒，提交北京诺赛基因组研究中心进行测序。采用 DNA Star 分析软件中的 MegAlign
程序将获得的扩增片段序列与 GenBank 数据库中已登录的一些分离物的核苷酸序列进行同源性分
析。
1.5 实时荧光定量 RT-PCR
1.5.1 反应条件
实时荧光定量 RT-PCR 在 qTOWER 2.0 Thermal Cycler（Analytikjena，德国）上进行，采用试剂
盒为 2× Sybr Green qPCR Mix（艾德莱，北京，中国）。
反应体系含 2× SYBR GreenⅠ的 qPCR Mix 12.5 μL、10 μmol · L-1 正、反向引物 0.5 μL、
DNase/RNase Free dH2O 9.5 μL 和 cDNA 2 μL，每个反应总体积为 25 μL，使用 0.2 mL 实时荧光定量
RT-PCR 8 连管[生工生物工程（上海）股份有限公司]进行。实时荧光定量 PCR 扩增条件：95 ℃预
变性 30 s，95 ℃ 15 s，退火温度 15 s，72 ℃ 20 s，40 个循环，在延伸步骤记录荧光信号。PCR 扩
增产物的熔解曲线分析的温度范围从 60 ~ 95 ℃，其中每 6 s 增加温度 0.5 ℃，以鉴别引物二聚体和
非特异性扩增。
1.5.2 条件的优化
将‘桑多哈尼 1’总 RNA 反转录得到的 cDNA 稀释 1 × 10-2 作为模板，设定不同的引物浓度（500、
400、300、200、100 nmol · L-1）进行实时荧光定量 RT-PCR，筛选出每对引物反应时最优的引物浓
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度；在最优引物浓度下，分别检测不同引物在 61.8、60.0、58.0、56.0、54.0、52.0 和 48.2 ℃时退
火荧光信号的变化，选取 Ct 值（每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）最小
且扩增效果最好的温度作为退火温度。
1.5.3 引物扩增效率与检测灵敏度比较
为评价本研究各引物的扩增效率，以‘桑多哈尼 1’样品 10 倍稀释系列 cDNA 进行实时荧光定
量 RT-PCR 反应，构建各引物的标准曲线，反应中每个梯度 3 个重复。另外，以同一系列稀释液为
模板，分别进行实时荧光定量 RT-PCR、常规 RT-PCR 和巢式 RT-PCR 反应，比较不同方法的灵敏度，
实时荧光定量 RT-PCR、常规 RT-PCR 检测引物为 FL-HP1，巢式 RT-PCR 第 1、第 2 轮引物分别为
FL-MP1 A/B、FL-MPn1 A/B，3 种检测方法的反应体系及条件同前面的描述。
1.5.4 重复性检验
以‘桑多哈尼 1’cDNA 稀释梯度 1 × 10-1 ~ 1 × 10-5 为模板，每个稀释度 3 个重复，以 FL-HP1
进行实时荧光定量 RT-PCR，并重复进行 3 次试验。计算 Ct 值、Ct 值标准差（SD）和 Ct 值变异系
数（CV）。
1.5.5 内参基因的稳定性测试
为了建立可相对定量 GFLV 基因表达量的方法，选择了 4 个在葡萄植株中稳定表达的内参基因，
EF1α、GAPDH、SAND 和 α-Tubulin（Reid et al.，2006）。为进一步评估所选择的内参基因的稳定性，
通过实时荧光定量 RT-PCR 测定其在 12 个样本（6 个样品，每个样品两个重复）的 Ct 值数据，进
而用软件 Normfinder（Andersen et al.，2004）和 BestKeepker（Pfafflet al.，2004）分析其表达稳定
性。
1.5.6 数据分析
选择扩增效果较好FL-HP1引物及稳定性最好的内参基因EF1α、Tubulin，对12个样品进行GFLV
相对定量检测，每个样品做 3 个重复，反应体系及程序同 1.5.1。
仪器附带软件根据设定参数自动计算出 Ct 值，其中内参 Ct 值取两个内参 Ct 值的几何平均数，
设相对 GFLV 含量最低的样品为 1，采用 2-ΔΔCt 法进行相对含量计算。
1.6 田间 GFLV 样品的检测
选择经 ELISA 或巢式 RT-PCR 检测的 58 个田间样品，其中阳性样品 53 个、阴性样品 5 个进行
实时荧光定量 RT-PCR 检测（引物为 FL-HP1），2 次重复，反应体系及程序同 1.5.1。
为保证检测结果的一致性与可比性，待检测样品 cDNA 合成方法同巢式 RT-PCR（Zhou et al.，
2015）。
2 结果与分析
2.1 引物的特异性
选择巢式 PCR 检测为阳性的‘桑多哈尼 1’、‘巧保 2 号’、‘恰齐瓦赫’、‘苏珊玫瑰’、‘巨玫
瑰 2’作为模板进行常规 PCR 和实时荧光定量 RT-PCR，以阴性样品‘无核白’作对照。4 对 GFLV
引物的特异性通过琼脂糖凝胶电泳和溶解曲线评估。琼脂糖凝胶电泳结果显示，FL-HP1 F/R 检出所
有阳性样品均有目的条带，其他引物仅扩增部分阳性样品有目的条带，所有 GFLV 引物扩增得到的
均为单一目的条带，并且所有引物健康对照均无目的条带（表 1，图 1）。
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表 2 引物特异性溶解温度
Table 2 Amplicon specific melting temperatures
引物
Primer
溶解温度/℃
Melting temperature
FL-HP1 86.77 ± 0.08
FL-HP2 86.23 ± 0.03
FL-MP1 84.92 ± 0.03
FL-CP1 84.87 ± 0.03
Vv_GAPDH 81.07 ± 0.03
Vv_α-Tubulin 81.58 ± 0.06
Vv_SAND 81.27 ± 0.03
Vv_EF1α 82.53 ± 0.03
表 1 实时荧光定量 RT-PCR 引物及内参基因引物
Table 1 Primers sets targeting GFLV genomic regions of interest and Vitis vinifera reference genes
目标区域
Target
引物
Primer
扩增产物大小/bp
Amplicon size
引物序列（5′–3′）
Sequence
参考文献
Reference
葡萄扇叶病毒 2AHP 基因 228 F：TCTAGGGTTCAGAAGGACCG
GFLV homing protein
FL-HP1
R：AGGAGGAGGCGAAGGAATC

211 F：GGGTTCAGAAGGACCGCT

FL-HP2
R：GGAATCACCACCTTCTTCGG

葡萄扇叶病毒 2BMP 基因 212 F：GCGGATGGAAGAACTACCG
GFLV movement protein
FL-MP1
R：GCGCCAAGATAAGCATTCCT

葡萄扇叶病毒 2CCP 基因 174 F：GGTGCAAGGTACGACACTT
GFLV coat protein
FL-CP1
R：AAGGTCTGCCCTGGTTCC

葡萄 3–磷酸甘油醛脱氢酶基因 Ubiquitin- 70 F：TTCTCGTTGAGGGCTATTCCA
conjugating enzyme V. vinifera glyceraldehyde
Vv_GAPDH
R：CCACAGACTTCATCGGTGACA
Reid et al.，2006
葡萄 α–微管蛋白基因 119 F：CAGCCAGATCTTCACGAGCTT
V. vinifera alpha-tubulin
Vv_α-Tubulin
R：GTTCTCGCGCATTGACCATA
Reid et al.，2006
SAND 家族蛋白基因 76 F：CAACATCCTTTACCCATTGACAGA
SAND family protei
Vv_SAND
R：GCATTTGATCCACTTGCAGATAAG
Reid et al.，2006
葡萄延伸因子 1-α基因 Vv_EF1α 150 F：GAACTGGGTGCTTGATAGGC Reid et al.，2006
V. vinifera elongation factor 1-alpha R：AACCAAAATATCCGGAGTAAAAGA


图 1 目标片段实时荧光定量 RT-PCR 琼脂糖凝胶电泳图
M：2 000 bp DNA 标记；CK-：阴性对照（无核白）；1：桑多哈尼 1；2：巧保 2 号；3：恰齐瓦赫；4：苏珊玫瑰；5：巨玫瑰 2。
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of real-time RT-PCR product
M：2 000 bp DNA marker；CK-：Negative control；1：Santos Hani 1；2：Qiaobao 2；3：Qiaqiwahe；4：Sushanmeigui；5：Muscat Kyoho 2.

回收各引物扩增‘桑多哈尼 1’的 PCR 产
物，经克隆后送诺赛基因公司测序。序列在
NCBI 经 Blast 分析发现，所有扩增得到序列与
GFLV Takestan（JQ071377）Blast 比对序列相
似性为 86% ~ 92%，为 GFLV 特异性条带。实
时荧光定量 PCR 扩增结果显示，所有引物扩增
阳性样品均有扩增曲线，其中 FL-HP1 出峰时
间最短（Ct 值最小），并且各引物的所有 GFLV
阳性样品溶解曲线仅见单一峰，溶解温度标准
差小于 0.08（表 2），表明各引物无二聚体和非
特异性扩增，特异性高。
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表 3 各引物标准曲线的扩增效率、决定系数、斜率、截距
Table 3 Efficiency，coefficients of determination（R2），
slope and y-intercept of standard curves of each primer
引物
Primer
扩增效率
PCR efficiency
决定系
数 R2
斜率
Slope
y 轴截距
y-intercept
FL-HP1 1.00 0.998 –3.31 16.94
FL-HP2 1.00 0.995 –3.31 17.41
FL-MP1 0.98 0.998 –3.37 18.02
FL-CP1 1.05 0.998 –3.21 16.41
Vv_GAPDH 0.99 0.996 –3.34 18.34
Vv_α-Tubulin 1.06 0.998 –3.19 22.51
Vv_SAND 1.03 0.992 –3.71 21.75
Vv_EF1α 0.86 0.997 –3.14 25.43

2.2 实时荧光定量 RT-PCR 反应条件优化
浓度优化试验发现，引物 FL-HP1、FL-HP2、FL-MP1 和 FL-CP1 浓度为 200 和 300 nmol · L-1
时，相对荧光强度最高，Ct 值最小；因此，选择 200 nmol · L-1 作为该体系引物浓度。退火温度优化
试验显示，引物 FL-HP1、FL-HP2、FL-MP1 和 FL-CP1 分别在退火温度为 52.0、54.0、60.0 和 56.0 ℃
时，相对荧光强度最高，Ct 值最小；Vv_GAPDH、Vv_α-Tubulin、Vv_SAND 和 Vv_EF1α 分别在退
火温度为 54.0、54.0、52.0 和 52.0 ℃时，相对荧光强度最高，Ct 值最小；所有引物在各退火温度下，
仅见单一峰，特异性好。
2.3 扩增效率的比较
以‘桑多哈尼 1’cDNA 10 倍稀释系列进行实时荧光定量 RT-PCR 反应，得到各引物的标准曲
线。其中 FL-HP1、FL-CP1、Vv_GAPDH 在梯
度稀释浓度 1 ~ 10-5 范围内，FL-HP2、FL-MP1、
Vv_α-Tubulin 在 1 ~ 10-4 范围内，Vv_SAND、
Vv_EF1α 在 1 ~ 10-3 范围内，与 Ct 值呈现良好
的线性关系；除 Vv_EF1α扩增效率较低（0.86）
外，其他引物扩增效率均较高（0.98 ~ 1.06），
并且所有引物的决定系数 R2 > 0.992（表 3）。
根据引物特异性分析、扩增效率评价和灵敏
度比较，选择扩增效果最好 FL-HP1 作为 GFLV
实时荧光定量 RT-PCR 检测引物。
2.4 灵敏度比较
实时荧光定量 RT-PCR、常规 RT-PCR 和巢式 RT-PCR 灵敏度测试结果表明，FL-HP1 实时荧光
定量 RT-PCR 能够检测到稀释梯度为 10-5 cDNA（图 2），而常规 RT-PCR 只能检测 10-3 cDNA（图 3，
A），这表明实时荧光定量 Rt-PCR 检测灵敏度比常规 RT-PCR 检测提高了 100 倍。此外，巢式 PCR
第 1 轮引物 FL-MP1A/B 只能检测到 1 × 10-1的 cDNA（图 3，B），而巢式 PCR 第 2 轮引物 FL-MPn1A/B
能检测到 1 × 10-4 的 cDNA（图 3，C），这表明实时荧光定量 RT-PCR 检测灵敏度分别是巢式 PCR
第 1、第 2 轮检测 10 000 倍和 10 倍。











图 2 ‘桑多哈尼 1’样品 FL-HP1 引物实时荧光定量 RT-PCR 扩增曲线
Fig. 2 The amplification plots of primers FL-HP1
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图 3 ‘桑多哈尼 1’样品不同检测方法灵敏度比较
A：FL-HP1 常规 RT-PCR 扩增产物电泳图；B：巢式 PCR 第 1 轮引物 FL-MP1A/B 扩增产物电泳图；
C：巢式 PCR 第 2 轮引物 FL-MPn1A/B 扩增产物电泳图；M：2 000 bp DNA 标记；
1 ~ 9：cDNA 梯度稀释浓度 1 ~ 10-8；N：水对照。
Fig. 3 Comparison of sensitivity of different detection methods
A：Agarose gel electrophoresis of FL-HP1 conventional RT-PCR amplified product；B：Agarose gel electrophoresis of FL-MP1A/B
conventional RT-PCR amplified product；C：Agarose gel electrophoresis of FL-MPn1A/B nested RT-PCR product；
M：2 000 bp DNA marker；1–9：Concentration of GFLV-SDHN1 dilution gradient 1–10-8；N：Water control.

2.5 重复性检测结果
以引物 FL-HP1 进行实时荧光定量 RT-PCR 重复性实验，对其 Ct 值数据进行统计学分析，结果
显示各梯度组内重复的变异系数最大为 2.34%（表 4），组间重复的变异系数最大为 2.59%（表 4），
表明该方法具有较好的组内重复性和组间重复性。因此，说明本试验建立的实时荧光定量 RT-PCR
方法不仅灵敏度和准确性高，而且稳定性好。

表 4 重复性试验结果（引物 FL-HP1）
Table 4 The results of reproducibility（primer FL-HP1）
组内重复 Reproducibility test of intra-assay 组间重复 Reproducibility test of extra-assay 浓度稀释梯度
Concentration
dilution gradient
Ct 平均值
Mean Ct value
标准差
SD
变异系数/%
CV
Ct 平均值
Mean Ct value
标准差
SD
变异系数/%
CV
10-1 19.48 0.19 0.98 19.28 0.50 2.59
10-2 22.89 0.25 1.10 23.13 0.24 1.04
10-3 26.09 0.34 1.30 26.21 0.18 0.69
10-4 29.30 0.65 2.22 29.40 0.58 1.97
10-5 32.22 0.76 2.34 32.38 0.38 1.17

2.6 内参基因的稳定性
应用 Normfinder（Andersen et al.，2004）和 BestKeepker（Pfaffl et al.，2004），根据实时荧光定
量 RT-PCR 扩增所得 Ct 值分析内参基因的表达稳定性，并比较两者的结果。Normfinder 可通过计算
每个候选基因的 Ct 值，排列候选基因的表达稳定性和推荐最佳组合基因，结果显示最稳定的内参基
因是 EF1α（稳定值 0.08），最佳基因组合为 EF1α 与 GAPDH（稳定值 0.08）。BestKeeper 用于候选
基因 Ct 值描述性统计计算和两两间相关性分析，结果显示候选基因 SAND 的变异最大，Ct 标准偏
差 < 0.58（表 5），α-Tubulin 与其他候选基因的相关性最弱（表 6）。根据候选基因 Ct 值的几何平均
数计算 BestKeeper 指数，并通过候选基因两两间相关分析及其指数描述每个候选基因对该指数的贡
周 俊，范旭东，董雅凤，张尊平，胡国君，任 芳，李正男.
葡萄扇叶病毒实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立及应用.
园艺学报，2016，43 (3)：538–548. 545

献。分析表明，GAPDH、SAND 和 EF1α相关性非常强（0.857 < r < 0.904），而 α-Tubulin 相关性较
低（0.778）。综合 Normfinder 和 BestKeepker 的分析结果，选择 EF1α与 GAPDH 作为相对定量 GFLV
的内参基因。

表 5 BestKeeper 用于候选内参基因的描述性统计
Table 5 BestKeeper descriptive statistics of candidate reference genes
候选内参基因
Candidate reference gene
最大值
Max [Ct]
最小值
Min [Ct]
几何平均数
Geometric mean [Ct]
算术平均数
Arithmetic mean [Ct]
标准差
SD [± Ct]
变异系数
CV [% Ct]
EF1α 22.35 20.37 21.40 21.41 0.42 1.96
GAPDH 20.13 18.48 19.39 19.40 0.40 2.08
SAND 25.18 23.15 24.29 24.30 0.58 2.38
α-Tubulin 22.84 21.35 22.04 22.05 0.50 2.26
n = 12。

表 6 BestKeeper 用于内参基因两两相关性比较
Table 6 Pairwise correlation between reference genes and pairwise comparison between each reference gene
基因 Gene EF1α GAPDH SANE α-Tubulin
EF1α – 0.002 0.015 0.034
GAPDH 0.790 – 0.015 0.096
SAND 0.681 0.679 – 0.065
α-Tubulin 0.612 0.503 0.548 –
注：左下为皮尔森相关系数（r）；右上为 P 值。
Note：Left lower Pearson correlation coefficient（r）；Right upper P-value.
2.7 不同样品间 GFLV 相对含量的比较
设 GFLV 相对含量最低的样品的含量为 1，计算其它样品相对含量。结果表明，不同样品间 GFLV
的相对含量存在显著差异，其中最高含量样品是最低含量样品的 81 245.48 倍（表 7），这一结果可
能是由于不同葡萄品种对 GFLV 的抗性不同导致的。

表 7 实时荧光 RT-PCR 相对定量不同样品 GFLV 浓度
Table 7 Relative quantitation of GFLV in samples
Ct 平均值 Mean Ct value 2AHP相对含量 品种 Cultivar
2AHP EF1α GAPDH Relative content of 2AHP
桑多哈尼 1 Santos Hani 1 16.27 21.51 19.77 81 245.48
巧保 2 号 Qiaobao 2 26.59 21.64 19.23 53.82
恰齐瓦赫 Qiaqiwahe 24.57 20.44 18.54 114.56
苏珊玫瑰 Sushanmeigui 27.54 22.31 20.05 46.85
巨玫瑰 2 Muscat Kyoho 2 26.63 21.11 19.57 49.87
北冰红 Beibinghong 26.60 21.42 19.22 49.52
贵人香 Italian Riesling 30.53 20.71 19.74 3.10
品丽珠 Cabernet Franc 25.10 20.14 18.68 75.58
玛瑟兰 Marselen 29.59 20.17 18.97 3.76
贵人香 Italian Riesling 26.16 19.40 18.12 39.67
赤霞珠 Cabernet Sauvignon 30.54 19.12 18.09 1.00
贵人香 Italian Riesling 28.98 22.18 20.73 21.11

2.8 田间葡萄样品 GFLV 实时荧光定量检测
应用所建立的实时荧光定量 RT-PCR 方法检测 58 个样品，共检出 57 个阳性样品（表 8），包括
ELISA 或巢式 RT-PCR 检出阳性的 53 个样品和阴性的 4 个样品（Zhou et al.，2015），仅来自新疆的
‘无核白’为阴性（Ct > 32，无特异性溶解曲线）。
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Development and application of a quantitative RT-PCR approach for quantification of Grapevine fanleaf virus.
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表 8 实时荧光定量 RT-PCR 检测田间葡萄样品 GFLV
Table 8 Detection of GFLV in grapevines
检测方法 Detection method 来源
Origin
样品编号
Number
品种
Cultivar DAS-ELISAa Nested PCRb GFLV Ctc
北京 Beijing 1 品丽珠 Cabernet Franc + + 25.34
2 巨峰 Kyoho - - 23.38
3 巨峰 Kyoho - - 28.07
河北 Hebei

4 玛瑟兰 Marselen + + 24.11
5 贝达 Beda + - 21.39
6 甲斐乙女 Kaiotome - + 24.62
7 阿尔曼玫瑰 Arman rose - - 24.03
8 基拉尔 Kilar + - 24.50
9 郑伏 Zhengfu + - 25.18
10 苏 46 号 Su 46 + - 26.10
11 白塞涅 Seneca + - 21.11
12 白马拉加 White Malaga + - 23.22
13 白马拉加 White Malaga + + 22.86
14 玫瑰香 Muscat Hamburg + - 26.87
15 桑多哈尼 1 Santos Hani 1 + + 16.27
16 秋蜜 Qiumi + + 26.32
17 琥珀 Amber + - 22.58
18 龙眼 Longan + + 23.80
19 恰齐瓦赫 Qiaqiwahe - - 27.95
20 恰齐瓦赫 Qiaqiwahe + + 24.57
21 洋白蜜 Yangbaimi + + 26.39
22 87-1 + - 22.60
23 乌兹别克玫瑰 Uzbek rose + + 24.50
24 红丹 Hongdan + + 23.30
25 着色香 Zhousexiang + + 22.40
26 巧保 2 号 Qiaobao 2 + + 26.59
27 红香妃 Hongxiangfei + - 23.63
28 紫丰 Zifeng + + 23.95
29 牛心 Niuxin + + 20.61
30 克什麦什 Keshenmaishen + + 25.70
31 哈佛德 Halfords + - 21.59
32 李子香 Lizixiang + - 23.67
33 达米娜 Tamina + + 23.06
34 洋白蜜 Yangbaimi + - 22.31
35 奥拉皇后 Ora queen - + 24.61
36 奥拉皇后 Ora queen + + 23.51
37 苏珊玫蜜 Sushanmeigui + + 27.54
38 紫珍珠 Zizhenzhu + - 23.54
39 228 + - 22.38
40 白瓦沙卡 Baiwashaka + + 26.01
41 瑰宝 Guibao + - 23.48
42 紫香无核 Zixiang Seedless + + 26.08
43 京早晶 Jingzaojing + + 26.68
44 瑰宝 Guibao + + 24.71
45 巨玫瑰 2 Muscat Kyoho + + 26.63
46 红富士 Red Fuji + + 27.73
47 桑多哈尼 2 Santos Hani 2 + + 15.66
48 228 + + 26.07
辽宁 Liaoning
49 102459 + + 29.49
50 黑虎香 Heihuxiang + + 26.67
51 贵人香 Italian Riesling + + 27.66
52 贵人香 Italian Riesling + + 25.14
山东 Shandong
53 贵人香 Italian Riesling + - 26.11
54 贵人香 Italian Riesling + + 26.34 天津 Tianjin
55 赤霞珠 Carbenet Sauvignon + + 25.55
新疆 Xinjiang 56 克瑞森无核 Crimson Seedless + - 23.21
57 紫香无核 Zixiang Seedless - + 30.16
58 无核白 Bai Seedless - - –
注：a：引自 Zhou 等（2015）；b：引自 Zhou 等（2015），包括引物 FL-MP1A/B、FL-MPn1A/B 的检测结果；c：FL-HP1 检测结果。
Note：a：Data from Zhou et al.（2015）；b：Data from Zhou et al.（2015），and the data contains the detection results of primers FL-MP1A/B、
FL-MPn1A/B；c：The detection results of FL-HP1.
周 俊，范旭东，董雅凤，张尊平，胡国君，任 芳，李正男.
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3 讨论
本研究针对中国 GFLV 分离物 RNA2 基因的保守区域设计 4 对引物，分别进行常规 RT-PCR 检
测 5 个阳性样品，结果仅 FL-HP1 检出所有阳性样品有单一目的条带。并且对 4 对引物的特异性、
扩增效率和灵敏度比较结果均显示，FL-HP1 是 GFLV 实时荧光定量 RT-PCR 扩增效果最好的引物。
通过体系的优化，建立了以 FL-HP1 为引物的实时荧光定量 RT-PCR 检测方法。该方法标准曲线循
环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，扩增效率为 100%，相关性系数为 0.998，灵敏度是巢式 RT-PCR
的 10 倍，组内和组间变异系数均小于 2.59%，说明该方法不仅检测效率较好，而且灵敏度高、稳定
性好。另外，实时荧光定量 RT-PCR 方法检出阳性样品数多于 ELISA 和巢式 PCR，说明本研究建立
的实时荧光定量 RT-PCR 检测方法可检测出更多 GFLV 分离物，能够满足 GFLV 常规检测的需要。
应用本研究建立的实时荧光定量 RT-PCR 相对定量不同葡萄样品中 GFLV 含量，结果显示不同
样品中 GFLV 含量差异显著，其中‘桑多哈尼 1’样品中 GFLV 的含量明显高于其他样品，这可能
是由于‘桑多哈尼 1’较其他样品更感病，或毒源植株中 GFLV 分布不均匀所致。同时，这一结果
也说明 Zhou 等（2015）使用常规 RT-PCR 仅检测两个‘桑多哈尼 1’样品存在 GFLV，是由于其
GFLV 浓度较高，而其他样品 GFLV 浓度较低导致的。本试验建立的实时荧光定量 RT-PCR 方法灵
敏度和稳定性较高，可适用于 GFLV 的常规诊断和定量。
本研究是首次报道针对中国 GFLV 分离物建立实时荧光定量 RT-PCR 检测方法，该方法不仅能
准确检测葡萄中 GFLV，还可测定其在植株体内的相对含量，为以后监测 GFLV 的流行与种群生态
学研究奠定了一定基础。

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