全 文 ：园艺学报，2016，43 (4)：643–652.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0707；http：//www. ahs. ac. cn 643
收稿日期：2015–12–08；修回日期：2016–04–08
基金项目：国家自然科学基金项目（U1404321；31340015）；河南省科技计划项目（152300410094）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：shanhong98@163.com）
‘粉红亚都蜜’葡萄NAC转录因子基因VvDRL1
的功能初步分析
闫朝辉，李桂荣，穆金燕，娄航通，朱自果*
（河南科技学院园艺园林学院，河南新乡 453003）
摘 要：以欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’为材料，利用同源克隆法获得 1 个 NAC 转录因子，命名为 VvDRL1
（GenBank：XP-002281816）。该基因全长 840 bp，编码 280 个氨基酸，与‘黑比诺’葡萄中该基因的同
源性为 100%，但是基因组 DNA 序列中存在 6 处单核苷酸突变。瞬时转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位
分析，VvDRL1 基因主要在细胞核内表达，属于核蛋白；通过农杆菌介导的叶盘法获得稳定整合的转基因
烟草，T2 代转基因植株生长迟缓，株高、叶面积和叶片细胞面积约为野生型烟草的 60%、34%和 31%，
转基因植株叶片出现向内卷曲现象，利用石蜡切片进行显微结构观察，转基因植株主叶脉上表皮下缺
失 2 ~ 3 层厚壁细胞，且海绵组织内的空隙明显多于野生型植株。研究结果表明，VvDRL1 在调控植株的
形态发育方面起着重要作用。
关键词：葡萄；NAC 转录因子；矮化；卷叶
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）04-0643-10

Subcellular Localization and Functional Analysis of a NAC Gene VvDRL1
from Vitis vinifera‘Yatomi Rosa’
YAN Chao-hui，LI Gui-rong，MU Jin-yan，LOU Hang-tong，and ZHU Zi-guo*
（College of Horticulture and Landscape Architecture，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang，Henan
453003，China）
Abstract：In this study，a NAC gene，VvDRL1，was isolated from Vitis vinifera‘Yatomi Rosa’. The
length of full VvDRL1 was 840 bp，encoding 280 amino acids，which shared a 100% similarity in cRNA
and 6 single nucleotide mutation in DNA with‘Pinot Noir’. Subcellular localization showed that VvDRL1
is a nuclear protein. Transgenic tobacco with VvDRL1 was obtained by Agrobacterium-mediated method.
Compared with the wild type，the growth of T2-generation transgenic tobacco presented delayed with the
plant height，leaf area and mesophyll cells area of about 60%，34% and 31% in comparison with wild
tobacco plants. In addition，the transgenic tobacco showed curly leaves. Through paraffin sections
observation，it is found that the upper epidermis in main leaf veins of transgenic tobacco lacked 2–3
layers sclerenchyma cells and had significantly more space in the spongy tissue compared with the wild
type. Based on the above study，it is inferred that VvDRL1 gene play an important role in the regulation of

Yan Chao-hui，Li Gui-rong，Mu Jin-yan，Lou Hang-tong，Zhu Zi-guo.
Subcellular localization and functional analysis of a NAC gene VvDRL1 from Vitis vinifera‘Yatomi Rosa’.
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plant morphological development.
Key words：Vitis vinifera；NAC transcription factor；dwarf；curly leaf

NAC 转录因子是植物特有的转录因子。Souer 等（1996）从矮牵牛中克隆得到的第 1 个 NAC
转录因子。随着各物种基因组测序的完成，在拟南芥、杨树、大豆和水稻基因组中已鉴定出 117、
120、152 和 151 个 NAC 家族成员（Ooka et al.，2003；Hu et al.，2010；Nuruzzaman et al.，2010；
王洋和柏锡，2014）。研究表明，NAC 转录因子在植物的开花诱导，胚胎发育，次生壁加厚，细胞
分裂等方面发挥着重要作用。水稻 NAC 转录因子成员 NTL8 通过抑制 FLOWERING LOCUST（FT）
基因的表达，大大延迟植株的开花进程（Kim et al.，2007）；拟南芥 NARS1 和 NARS2 调节胚珠外
皮的发育，影响植株胚胎形成，产生非正常形状的种子（Kunieda et al.，2008）；拟南芥 SND2 基因
正向调控次级细胞壁的发育，可以增强有关纤维素、木聚糖、甘露聚糖和木质素聚合相关基因的表
达，从而导致纤维次级细胞壁的加厚（Hussey et al.，2011）；FEZ 和 SOMBRERO（SMB）在细胞
分裂过程中起着重要作用，FEZ 在根冠中表达，促进细胞平周分裂，SMB 则抑制根冠细胞的分裂
（Willemsen et al.，2008）。此外，NAC 转录因子也参与植物的生物胁迫和非生物胁迫过程（邵帅 等，
2014；郭文芳 等，2015）。水稻 NAC 基因 ONAC045 提高了水稻对干旱和高盐的抗性（Zheng et al.，
2009）；在大豆中，GmNAC11 可以增强拟南芥对高盐和冷冻的抗性（Hao et al.，2011）；拟南芥
NAC 基因 ATAF2 降低对病原真菌 Fusarium oxysporum 的抗性，ATAF1 提高了对 Botrytis cinerea 的
敏感性（Delessert et al.，2005；Wu et al.，2009）。
目前关于 NAC 基因的研究主要集中在水稻和大豆等少数农作物上，关于葡萄 NAC 基因的报道
很少，仅见欧洲葡萄 VvNAC1 参与对干旱、高盐和病原菌的抗性，以及在 VvNAC1 转基因拟南芥的
发育后期可显著增加植物的生物量，而且可提早开花 4 ~ 8 d（Le Henanff et al.，2013）；中国野生华
东葡萄 VpNAC1 基因增强了烟草对白粉病和疫霉病的抗性（Zhu et al.，2012）；Tello 等（2015）利
用生物信息学研究 VvNAC26 的功能，发现其与果实大小的变异有关。作者前期对欧洲葡萄 NAC 基
因家族启动子进行生物信息学分析，发现 VvNAC94 基因启动子中除了含有 ABA（ABRE）和干旱
响应元件（MBS）外，还包含一个与发育相关的 Leafy 顺式作用元件，推测此基因可能调控葡萄的
生长发育，故在欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’品种中克隆此基因，并在烟草中进行功能分析，并将其命
名为 VvDRL1（Vitis vinifera Drought and Rolled Leaf gene 1），这将有助于了解葡萄生长发育的机理。
1 材料与方法
1.1 植物材料
试验于 2012 年进行，欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’的嫩叶采自河南科技学院葡萄种质资源圃，转
基因所用本氏烟草为本实验室保存。
1.2 半定量 PCR 反应及基因表达分析
采用改良 SDS/酚法进行‘粉红亚都蜜’葡萄叶片 RNA 的提取（张今今 等，2003），采用 TaKaRa
公司的 PrimeScript 反转录试剂盒进行第 1 链 cDNA 的合成；采用改良的 CTAB 法提取葡萄 DNA
（Michelmore et al.，1991）。分别以叶片 cDNA 和 DNA 为模板进行全长 cDNA 和 DNA 基因的克
隆，采用 TaKaRa 公司的 PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 高保真酶进行扩增，程序为 94 ℃ 3 min，
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30 个循环（98 ℃ 10 s， 68 ℃ 3 min），72 ℃ 10 min。半定量 PCR 在 Thermol 梯度 PCR 仪上进
行。反应体系：2× Taq PCR Master Mix 10 µL，cDNA 模板 1 µL，上下游引物各 1 µL，最终用 ddH2O
补齐到 20 µL。参照天根生化科技有限公司 Taq PCR Master Mix 说明书，程序为 94 ℃ 3 min，28
个循环（94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），72 ℃ 10 min。试验中所用引物及序列见表 1。

表 1 试验中所用的引物及序列
Table 1 Sequence of the primers in the experiment
引物序列（Primer sequence 5′–3′） 基因名称
Gene name
基因 ID
Gene ID 正向 Forward 反向 Reverse
VvDRL1（cDNA） XP-002281816 CACAGGACAACACCAGTAAGCAG GTTATTCATACCAAGCCAGGGAT
VvDRL1（gDNA） KU213972 ATGGAGGACATGACAGCAGAGC TTAGAAATTCAGAATGTTGGTGTAAGT
VvDRL1（Semi-PCR） XP-002281816 TTTTGGGAAGAGGCAGAGGTTTG ATTGATGACATTGGAGATGAAGG
NtActin（Semi-PCR） AB158612 AGCACCAAACCACTCCCACG AGGATGCAGCCACCACTTCA
1.3 生物信息学分析
在Genoscope Genome Browser的BLAT server进行染色体定位预测，利用在线软件 PredictProtein
（http：//www. predictprotein. org/）进行核定位信号分析，利用 SMART 软件（http：//smart. embl-
heidelberg. de/）进行保守性结构域分析，利用 NCBI 数据库中 BLAST（http：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/
Blast.cgi）进行同源蛋白基因的寻查。
1.4 亚细胞定位
将去除终止子的 VvDRL1 基因编码序列插入到载体 PBI221-GFP 的绿色荧光蛋白的 C 端，构建
融合表达载体 pBI221-GFP-VvDRL1。构建好的载体质粒利用 PSD-1000/He 基因枪在 1 100 psi 压力下
轰击洋葱表皮细胞，28 ℃培养 16 h，在激光共聚焦荧光显微镜（LSM510，USA）下进行观察。基
因枪转化操作步骤参照 PSD-1000 说明书。
1.5 烟草转基因
构建过量表达载体 pWR306-VvDRL1（徐伟荣，2005），参照 Horsch 等（1985）的农杆菌介导
的叶盘共培养法转化本氏烟草，25 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗环境下培养 T2 代转基因烟草用于功能分析。
1.6 切片制作及显微观察
切取烟草叶片，在 4% FAA 液中固定 72 h，用 30%、50%、85%、95%、100%、100%乙醇梯度
脱水，每级 30 ~ 60 min，二甲苯透明，浸蜡，倒入纸盒内进行包埋。用切片机切 8 μm 厚度的切片，
依次经过二甲苯、无水乙醇、50%乙醇、蒸馏水，脱蜡至复水。依次用 1%番红水溶液和 0.5%固绿
酒精溶液染色，染色后的切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明后封片。在光学显微镜（Nikon C-SHG1，
Japan）下进行观察。
2 结果与分析
2.1 VvDRL1 的结构分析
以欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’叶片 cDNA 为模板，根据欧洲葡萄基因组数据库中 VvNAC94 开放
阅读框两侧的序列设计全长引物，利用同源基因克隆法，获得 1 个包含 NAC 保守性结构域的 NAC
成员 VvDRL1，开放阅读框全长 840 bp，编码 280 个氨基酸，蛋白分子量为 30.9 kD，同源性比对分
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析发现该基因与 VvNAC94 相似性为 100%，GenBank 登录号：XP-002281816（图 1）。而后利用同源
克隆法克隆获得长度为 1 044 bp 的 VvDRL1 基因的 DNA 序列，该序列与‘黑比诺’葡萄基因组序
列同源性为 99%，仅存在 6 处单核苷酸的突变（图 2），GenBank 登录号：KU213972。该基因组 DNA
序列包含两个内含子（103、101 bp），3 个外显子（405、269、166 bp），在‘黑比诺’基因组上
进行染色体定位，VvDRL1 位于第 3 条染色体的 2 447 338 ~ 2 448 391 bp 处（图 1，图 2）。










图 1 VvDRL1 的染色体定位
Fig. 1 Chromosomal location of VvDRL1

















图 2 葡萄 VvDRL1 的 DNA 序列分析
Fig. 2 Homology analysis of VvDRL1 genome DNA sequence in V. vinifera‘Yatomi Rosa’with‘Pinot Noir’

蛋白结构分析表明，VvDRL1 在 N 端包含一个 147 个氨基酸的 NAC 保守型区域，一个 PKKK
核定位信号肽，位于第 70 ~ 76 个氨基酸处，在 C 端存在一个与激活功能有关的[W/N]xWEQx[n/t]W
结构域，位于第 254 ~ 266 个氨基酸处（图 3）。








图 3 葡萄 VvDRL1 的蛋白结构
Fig. 3 Schematic protein structure domains of VvDRL1
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2.2 亚细胞定位
利用基因枪法在洋葱表皮细胞内进行 VvDRL1 亚细胞定位分析，如图 4，VvDRL1 融合蛋白主
要在细胞核内分布，其次在细胞壁有少量分布，而对照 GFP 蛋白则分布于整个细胞壁、细胞膜和细
胞核，表明 VvDRL1 属于核蛋白。


















图 4 VvDRL1 的亚细胞定位
Fig. 4 Subcellular localization of VvDRL1 protein

2.3 VvDRL1 转基因烟草的获得
利用土壤农杆菌介导的叶盘法进行转基因烟草研究，对获得的抗性植株提取 RNA 进行半定量
分析，表明已获得转 VvDRL1 烟草植株（图 5）。在后续的研究中选取转基因株系 OE1、OE5 和 OE9
进行表观及显微观察试验。







图 5 VvDRL1 在转基因烟草不同株系中的表达
烟草 Actin 基因作为内参。WT：野生型；OE1、OE5、OE9：转基因烟草。下同。
Fig. 5 Expression level analysis of VvDRL1 in transgenic tobaccos
Tobacco Actin gene was used as an internal control. WT：Wild type tobacco；OE1，OE5，OE9：Transgenic tobaccos. The same below.

2.4 VvDRL1 转基因烟草表型分析
2.4.1 植株矮化
T2 代转基因植株生长迟缓，生长 21 ~ 70 d 的幼苗在体形上明显小于野生型植株（图 6）。
生长 70 d 的成苗转基因株系 OE1、OE5、OE9 平均株高为野生型的 60.7%，60.8%和 60.2%，但
是叶片数相差不大。茎粗、植株鲜质量和叶片面积都明显小于野生型，分别是野生型的 51.3%、54.1%、
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54.1%；36.5%、36.1%、35.7%和 34.2%、35.3%、34.4%（表 2）。
此外，通过甲苯胺蓝染色进行叶片细胞观察，转基因植株叶片细胞也明显小于野生型（图 7），
分别为为野生型的 31.4%、30.6%和 31.0%（表 2）。















图 6 VvDRL1 转基因烟草表型分析
Fig. 6 Phenotype analysis of VvDRL1 transgenic tobacco

表 2 VvDRL1 转基因烟草幼苗形态指标
Table 2 Morphological indexes of transgenic tobacco plants
类型
Type
株高/cm
Height
茎粗/cm
Stem diameter
叶片数
Leaf number
鲜样质量/g
Fresh weight
叶片面积/mm2
Leaf area
细胞面积/μm2
Cell area
OE1 5.25 ± 1.34* 0.19 ± 0.01* 13.63 ± 1.92 0.84 ± 0.08* 44.25 ± 3.25* 3 370.35 ± 615.68*
OE5 5.26 ± 0.99* 0.20 ± 0.04* 12.57 ± 1.98 0.83 ± 0.08* 45.75 ± 2.58* 3 286.30 ± 354.21*
OE9 5.21 ± 1.08* 0.20 ± 0.03* 13.13 ± 1.55 0.82 ± 0.07* 44.60 ± 1.51* 3 328.33 ± 475.60*
WT 8.65 ± 1.34 0.37 ± 0.03 14.50 ± 1.43 2.30 ± 0.08 129.50 ± 4.20 10 729.07 ± 1311.53
注：﹡P < 0.05（t 检测），n = 10。
Note：Significant difference was confirmed by Tukey’s t test（P < 0.05），n = 10.














图 7 转基因烟草叶片细胞观察
Fig. 7 Leaf cell observation of transgenic tobacco
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2.4.2 叶片卷曲
如图 8，A 所示，不论是幼苗期还是成苗期 VvDRL1 转基因烟草植株，除了表现矮化方面外，
所有的叶片均出现向内卷曲现象。
为了明确卷叶的原因，取 10 周大的烟草自下往上第 10 片叶子制作石蜡切片进行显微观察，在
叶脉中，野生型烟草上表皮细胞下部木质部外面存在 3、4 层厚壁细胞，上表皮细胞向外凸出（图 8，
B），而转基因植株上表皮细胞下部仅存在 1、2 层厚壁细胞，上表皮细胞不外凸（图 8，C）。
此外，相比野生型烟草，转基因烟草海绵组织中出现更多的细胞间隙（图 8，D、E）。这些差
异可能是导致转基因株系叶片出现卷叶现象的原因。


图 8 VvDRL1 转基因烟草叶片表型及显微组织分析
A：野生型和转基因烟草的叶片表型；B ~ E：转基因烟草（B、C：叶脉的显微观察，D、E：叶肉的显微观察）。
WT：野生型；OE9：转基因烟草。
Fig. 8 Leaf phenotype and micro histological analysis of VvDRL1 transgenic tobacco
A：Leaves phenotype of VvDRL1 transgenic tobacco. B–E：Transgenic tobaccos（B，C：Observation of leaf vein.
D，E：Observation of leaf mesophyll）.WT：Wild type tobacco；OE9：Transgenic tobaccos.
3 讨论
2007 年葡萄作为第 1 种果树和第 4 种开花植物，其基因组测序完成。李绍华课题组研究发现，
葡萄 2 000 多个转录因子中预测包含 74 个 NAC 基因（Wang et al.，2013）。NAC 转录因子 N 端含
有 1个高度保守的DNA结合域，C端含有 1个高度变异的激活域（Quattrocchio et al.，1999；Riechmann
et al.，2000）。葡萄 NAC 家族基因分布在除第 5 和 9 条外的 17 条染色体上，且在第 15 和 19 条染
色体上的 NAC 成员最多。本研究中从欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’中克隆到 1 个 NAC 家族成员，VvDRL1，
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该基因定位于第 3 条染色体上，其 N 端包含 1 个 147 个氨基酸的 NAC 保守型区域，还有一个 PKKK
核定位信号肽。NAC 转录因子以往研究主要集中在植物开花诱导，胚胎发育，次生壁加厚、细胞分
裂等方面的作用（Kim et al.，2007；Kunieda et al.，2008；Willemsen et al.，2008；Hussey et al.，2011），
对于植株形态，诸如植株的矮化和叶片形态方面研究较少，本研究中 VvDRL1 的功能将对葡萄在形
态发育方面的研究有重要意义。
内在的基因调控、各种激素作用和外界环境的影响，可使得植株节间不能正常伸长生长从而导
致植株矮化。本研究中，葡萄 VvDRL1 基因可以导致转基因的植株矮化，其植株的高度、茎粗度、
叶面积明显小于野生型植株。这与拟南芥 NAC 转录因子中的 NTL8、ANAC036、XND1 基因的功能
一致，其都可使植株的生长减缓（Kim et al.，2007）。还有葡萄 VvDRL1 和拟南芥 ANAC036 均可引
起转基因植株细胞面积缩小，这可能是导致植株株形矮化的直接原因。另外，拟南芥 NAC 转录因
子 NTL8 基因可介导 GA 信号转导途径。GA 是植物生长发育过程中一类重要的调节激素，对诱导植
物种子的萌发、节间和叶片的伸长、茎的伸长和植株增高、花器官形成等都有明显的促进作用，阻
断GA的生物合成或信号转导途径均可引起植株矮化。葡萄中GA受体蛋白基因VvGID1a和VvGID1b
的缺失可导致转基因拟南芥株形严重矮化，表明 GA 在调控葡萄株形发育期起关键作用
（Acheampong et al.，2015）。在其他物种中也有类似的现象，YABBY 类转录因子中的 OsYAB1 在水
稻的快速分化和伸长的组织中超量表达能抑制 osGA3ox2的表达，使水稻植株矮化（Jang et al.，2004）。
bZIP 类转录因子中的 RSG 基因在超表达的烟草中会抑制 GA20ox 的表达从而引起烟草植株矮化
（Yamaguchi，2008）。至于本研究中 VvDRL1 导致烟草植株矮化是否介导了 GA 信号转导途径，还
需要进一步的研究。
叶片卷曲是一个复杂的生物学过程，也是环境因子诱导下的形态学反应，造成叶片卷曲的原因
有很多。基因是控制叶片形态发育的基础，基因的表达和调控是植物接受外界信号和调控叶片形态
等发育活动的关键（Ito，1957；李平霞，2013）。拟南芥 ARF 转录因子 ARF3 和 ARF4（Irena et al.，
2005），HD 和 ZIPⅢ转录因子中的 PHB 和 PHV（Jane et al.，2001），水稻 Roc5 基因、SLL1 基因（Zhang
et al.，2009；Zou et al.，2011）等均可调控叶片的形态发育。在葡萄中，中国野生华东葡萄 VpYABBY1
也引起转基因拟南芥植株叶片的外卷现象（Xiang et al.，2013）。本研究中葡萄 VvDRL1 转基因烟草
出现了叶片向内卷曲的现象，这与水稻基因 SLL1 突变体表型一致。通过石蜡切片观察，发现转基
因植株叶片叶脉处的厚壁细胞相比野生型植株较少了 1 ~ 2 层，这不利于叶片的展开，这与水稻基
因 Roc5 的机制相同，水稻 SLL1 基因突变体正是通过叶脉离轴面厚壁细胞的不正常发育造成叶片的
内卷（Zhang et al.，2009）。相反，水稻 Roc5 基因突变体则通过增加泡状的数量及体积导致叶片出
现外卷现象（Zou et al.，2011）。此外，VvDRL1 转基因烟草叶片海绵组织中出现较多的细胞间隙，
这有利于叶片的内卷。以上这两点的差异可能是 VvDRL1 导致叶片内卷的原因。

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