全 文 ：园艺学报，2015，42 (9)：1837–1842.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0145；http：//www. ahs. ac. cn 1837
收稿日期：2015–05–13；修回日期：2015–07–30
基金项目：上海市科技人才计划项目（13XD424700）；上海市市级农口系统青年人才成长计划项目[沪农青字（2015）第 1-10 号]
* 共同第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wyhrx@126.com）
运用基因枪法进行蛹虫草遗传转化的研究
茅文俊*，鲍大鹏*，周陈力，李 燕，谭 琦，汪 滢**
（国家食用菌工程技术研究中心，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，上海市农业遗传育种重点实验室，上海
市农业科学院食用菌研究所，上海 201403）
摘 要：采用蛹虫草[Cordyceps militaris（L.）Link]野生型菌株 CM01 为供试材料，以金粉包裹质粒
pDHt-gpdA-GFP-bar，运用基因枪法转化，经草铵膦抗性筛选，最终在靶距离 6 cm 或 9 cm，氦气压力
7.58 × 106 Pa 或 8.96 × 106 Pa 条件下，获得 2 个遗传稳定的转化子 Gfp2 与 Gfp3，转化效率为 0.4 cfu · µg-1。
PCR 鉴定与 Southern 杂交分析显示，草铵膦抗性基因 Bar 已经以单拷贝或者多拷贝方式整合到蛹虫草转
化子的基因组中。蛹虫草转化子的菌丝在荧光显微镜下可以观测到绿色荧光，表明载体携带的绿色荧光
蛋白基因在蛹虫草转化子中得到表达。研究结果表明可以把基因枪法应用于真菌蛹虫草，建立了一种简
便有效的遗传转化方法，而转化效率需要通过优化基因枪参数设置、受体材料制备等途径进一步提高。
关键词：蛹虫草；基因枪；遗传转化；绿色荧光蛋白
中图分类号：S 567；S646 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）09-1837-06

Effective Transformation of Cordyceps militaris by Particle Bombardment
MAO Wen-jun*，BAO Da-peng*，ZHOU Chen-li，LI Yan，TAN Qi，and WANG Ying**
（Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Edible Fungi Resources and
Utilization（South），Ministry of Agriculture，P. R.，China，National Engineering Research Center of Edible Fungi，Key
Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai，Shanghai 201403，China）
Abstract：An effective and convenient transformation method of Cordyceps militaris were established
by means of particle bombardment. Coating microcarriers with plasmid pDHt-gpdA-GFP-bar，we
transferred C. militaris CM01 by particle bombardment. After being selected by glufosinate-ammonium，
two transformants were obtained under three conditions differing in the two parameters of target distance
（6 cm or 9 cm） and helium pressure（7.58 × 106 Pa or 8.96 × 106 Pa）. The transformation frequency was
0.4 cfu· µg-1. PCR and southern blot results indicated that the selective marker gene Bar was integrated
into the genomic DNA，a single copy or multiple copies integration，and genetically stable. Green
fluorescence of the C. militaris transformant mycelia could be observed under fluorescent microscope，
which indicated that the expression of green fluorescent protein was successful in the C. militaris
transformants. Transformation by particle bombardment enriched the transformation methods of C.
militaris. However，sample preparation and parameter setting need to be optimized，in order to improve the
efficiency of transformation.

Mao Wen-jun，Bao Da-peng，Zhou Chen-li，Li Yan，Tan Qi，Wang Ying.
Effective transformation of Cordyceps militaris by particle bombardment.
1838 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (9)：1837–1842.
Key words：Cordyceps militaris；particle bombardment；genetic transformation；green fluorescent
protein

蛹虫草[Cordyceps militaris（L.）Link]，又名北虫草、北冬虫夏草，属于麦角菌科（Clavicipitaceae）
虫草属（Cordyceps），是世界性广布种，为虫草属真菌的模式种（Kirk et al.，2001；梁宗琦 等，
2007）。蛹虫草人工栽培成功以来，其药理和毒理等方面的研究得到了广泛的开展（林群英 等，2006）。
研究表明蛹虫草具有和冬虫夏草相似的活性成分和药理作用（Li et al.，2006；Dong et al.，2012；
Shrestha et al.，2012；张姝 等，2013），有关蛹虫草的应用研究也成为虫草研究方向上的热点
（Paterson，2008）。
随着蛹虫草基因组测序的完成（Zheng et al.，2011a），蛹虫草分子遗传学研究日趋深入，而分
子遗传学的发展离不开有效的遗传转化体系。Zheng 等（2011b）建立并优化了蛹虫草的农杆菌介导
转化方法，为蛹虫草基因功能鉴定提供了良好的基础，是目前蛹虫草研究中较常用的遗传转化方法。
本文报道了应用基因枪转化蛹虫草的方法，相较农杆菌介导转化方法，省去了质粒转化农杆菌与农
杆菌介导的共培养等步骤，操作更为简便，可为蛹虫草遗传转化提供一种新的有效途径。
1 材料与方法
1.1 供试菌株、质粒及培养基
蛹虫草菌株 CM01、质粒 pDHt-gpdA-GFP-bar（段志兵，2010）均由中国科学院上海植物生理
研究所保藏并提供。质粒含草铵膦抗性基因 Bar 与绿色荧光蛋白表达盒。
PDA 培养基：BD Difco PDA。
MM 培养基：KH2PO4 1.45 g，K2HPO4 2.05 g，MgSO4 · 7H2O 0.5 g，NaCl 0.15 g，CaCl2 · 2H2O 0.066 g，
FeSO4 · 7 H2O 0.0025 g，（NH4）2SO4 0.5 g，葡萄糖 0.9 g，Agar 15 g，0.5% 甘油 10 mL，加双蒸水至 1 L。
M-100 微量元素液：H3BO3 30 mg，MnCl2 · 4H2O 70 mg，ZnCl2 200 mg，Na2MoO4 · 2H2O 20 mg，
FeCl3 · 6H2O 50 mg，CuSO4 · 5H2O 200 mg，加双蒸水至 500 mL。
M-100 盐溶液：KH2PO4 16 g，Na2SO4 4 g，KCl 8 g，MgSO4 · 7H2O 2 g，CaCl2 1 g，M-100 微
量元素液 8 mL，加双蒸水至 1 L。
M-100 培养基：M-100 盐溶液 62.5 mL，葡萄糖 10 g，KNO3 3 g，琼脂 15 g 加双蒸水至 1 L。
M-100 筛选培养基：M-100 培养基灭菌后添加加草铵膦至终浓度 200 mg · L-1。
1.2 基因枪遗传转化
采用 BIO-RAD 的 PDS-1000/He 型基因枪，金粉微弹包裹质粒 pDHt-gpdA-GFP-bar 的步骤按照
仪器说明书进行。蛹虫草转化受体材料的准备：培养蛹虫草菌丝至长满 PDA 平板，取 0.2 g 菌丝与
少量石英砂混合研磨后，加入 1 mL 灭菌水，混匀后自然沉淀，取上层含有菌丝的悬浊液涂布于 MM
培养基平板中央（直径约 4 cm），此平板置于基因枪轰击室作为受体材料用于基因枪转化。靶距离
（阻挡网与蛹虫草平板之间的距离）分别设置为 6、9 和 12 cm；轰击次数为 1 次；氦气压力分别设
置为 4.48 × 106 Pa、7.58 × 106 Pa 和 8.96 × 106 Pa；真空度 1.79 × 105 Pa。同时以未包裹质粒的微弹
基因枪轰击蛹虫草平板为对照。转化效率以每 µg 质粒 DNA 所获得的经过复筛的转化子数量表示。
茅文俊，鲍大鹏，周陈力，李 燕，谭 琦，汪 滢.
运用基因枪法进行蛹虫草遗传转化的研究.
园艺学报，2015，42 (9)：1837–1842. 1839


图 1 草铵膦抗性转化子 Gfp1、Gfp2 和 Gfp3 的 PCR 检测
Fig. 1 Insertion of Bar gene into transformants Gfp1，
Gfp2 and Gfp3 of Cordyceps militaris

表 1 不同氦气压力与靶距离条件下筛选转化子的个数
Table 1 Effects of target distance and helium pressure on the
number of putative transformants
靶距离/cm Target distance 氦气压力/Pa
Helium pressure 6 9 12
4.48 × 106 0 0 0
7.58 × 106 1 1 0
8.96 × 106 0 1 0
1.3 转化子的鉴定
1.3.1 转化子 PCR检测
转化子的 PCR 检测使用菌丝直接 PCR 的方法。挑取在 M-100 筛选培养基上长出的经过初筛获
得的转化子的菌丝直接作为 PCR 扩增的模板，以草铵膦抗性基因引物 Bar798F 和 Bar798R 进行 PCR
扩增。上游引物 Bar798F：5′-TTTAGTCGTCCAGGCGGTGAGCACAA-3′，下游引物 Bar798R：5′-GCC
AGAAACCCACGTCATGCCAGTTC-3′。PCR 扩增使用天恩泽的 PCR MagicMix2.0。反应体系为 20
μL：含菌丝的模板 1 μL，2 × Mix 10 μL，引物（0.1 mmol · L-1）各 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 扩增：
94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，扩增 30 个循环；72 ℃延伸
5 min，4 ℃保存。PCR 产物采用 1%琼脂糖进行凝胶电泳检测，Syngene G：BOX 凝胶成像系统照相。
1.3.2 转化子的遗传稳定性检测
经过微弹轰击后的蛹虫草平板置于 25 ℃培养 2 d 后，覆盖 M-100 筛选培养基作为初筛，于 25 ℃
培养一周左右，在筛选培养基上挑选出经过初筛的转化子。将此转化子转接至 M-100 筛选培养基，
25 ℃培养，继代培养 3 次，以检测转化子的遗传稳定性。
1.3.3 Southern杂交验证与转化子荧光显微镜观察
分别提取野生型 CM01 与稳定遗传的转化子的基因组 DNA，以草铵膦抗性基因 Bar 设计探针，
基因组 DNA 寄送浙江大学林福呈实验室完成 Southern 杂交验证。
刮取经过继代培养 3 次验证的转化子的少量菌丝置于载玻片后，于荧光显微镜 Olympus BX60
下观察并拍照，同时以野生型菌株 CM01 作为对照。
2 结果与分析
2.1 基因枪转化、转化子筛选和遗传稳定性检测
在基因枪参数设置上，选择了靶距离分别为
6、9 和 12 cm，氦气压力（即可裂膜的压力）分
别为 4.48 × 106 Pa、7.58 × 106 Pa 和 8.96 × 106 Pa
进行转化，在各条件下筛选得到的转化子个数
见表 1。
在靶距离 6 或 9 cm，氦气压力 7.58 × 106 Pa
或 8.96 × 106 Pa 条件下，初步获得 3 个转化
子。
对初筛得到的 3 个转化子的菌丝作为直接
PCR 扩增的模板，以草铵膦抗性基因引物
Bar798F 和 Bar798R 进行 PCR 扩增。结果显
示（图 1），从 3 个转化子 Gfp1、Gfp2 和 Gfp3
菌株中都可以扩增得到草铵膦抗性基因目的条
带，而以野生型菌株 CM01 为模板则扩增不到目
的条带，结果表明草铵膦抗性基因已经成功转入
蛹虫草供试菌株中。
Mao Wen-jun，Bao Da-peng，Zhou Chen-li，Li Yan，Tan Qi，Wang Ying.
Effective transformation of Cordyceps militaris by particle bombardment.
1840 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (9)：1837–1842.
图 3 蛹虫草转化子 Gfp2 和 Gfp3 的 Southern 杂交结果
Fig. 3 Southern blotting analysis of transformants of
Cordyceps militaris
经过初筛获得了 3 个转化子 Gfp1、Gfp2 和 Gfp3，随后经过 3 次继代培养的复筛，最终得到草
铵膦抗性稳定遗传的转化子 Gfp2 和 Gfp3，转化效率为 0.4 cfu · μg-1。
将复筛得到的转化子 Gfp2、Gfp3 与野生型菌株 CM01 分别接种于 M-100 培养基、M-100 筛选
培养基上培养 1 周后观察生长情况，结果显示（图 2），在含有草铵膦的培养平板上，野生型菌株
CM01 生长受到抑制，而转化子 Gfp2、Gfp3 的生长不受抑制，Gfp2、Gfp3 的草铵膦抗性表型遗传
稳定。



图 2 蛹虫草转化子 Gfp2 和 Gfp3 的生长情况
A：M-100 培养基；B：M-100 培养基 + 草铵膦。
Fig. 2 The phenotype of transformants Gfp2 and Gfp3 grown on different media
A：M-100 plate；B：M-100 plate with 200 μg · mL-1 Glufosinate-ammonium.

2.2 Southern 杂交验证
提取草铵膦抗性稳定遗传的 Gfp2、Gfp3
菌株与野生型菌株 CM01 的基因组 DNA，进
行地高辛标记的 Bar 基因探针 Southern 杂交
分析。结果显示（图 3），野生型菌株未获
得杂交信号，两个转化子可以获得 1 ~ 2 条杂
交信号，说明草铵膦抗性基因成功整合到蛹
虫草基因组中，并可以初步判定在 Gfp2 的基
因组中为单拷贝插入，在 Gfp3 的基因组中为
双拷贝插入。此外两者杂交条带位置不同，
显示外源基因可能是以随机方式插入蛹虫草
基因组上。
2.3 转化子荧光显微观察
运用荧光显微镜进行观察，野生型菌株与转化子 Gfp2 在正常视野与激发光下的视野（图 4）显
示，野生型菌株 CM01 在激发光下未能观察到绿色荧光（图 4，B），而转化子有绿色荧光（图 4，
D），这证明质粒 pDHt-gpdA-GFP-bar 通过基因枪法转化入蛹虫草后，所携带的绿色荧光蛋白基因
可以成功进行表达。

茅文俊，鲍大鹏，周陈力，李 燕，谭 琦，汪 滢.
运用基因枪法进行蛹虫草遗传转化的研究.
园艺学报，2015，42 (9)：1837–1842. 1841


图 4 绿色荧光蛋白在野生型菌株 CM01 和转化子 Gfp2 中的表达荧光显微图
Fig. 4 Expression of GFP in the wild-type CM01 and transformant Gfp2
3 讨论
基因枪法与其他常用的转化方法相比，既不需要制备原生质体，也无需通过农杆菌的介导，实
验操作相对简便。本文报道了基因枪法在蛹虫草转化中的成功应用，丰富了蛹虫草的遗传转化手段，
提供了一个有效简便的遗传转化方法。但是相较于常用的农杆菌介导转化方法，基因枪法的缺点则
在于转化效率较低，本研究中基因枪法的转化效率是 0.4 cfu · µg-1。这可能会限制基因枪法应用于需
要筛选大量转化子的操作，如基因敲除（Cho et al.，2006）等。
进一步提高基因枪法的转化效率可以从基因枪操作中各参数的设置与受体材料的选择两个方面
考虑。本研究中基因枪的参数设置，参考了基因枪法应用于大型真菌荷叶离褶伞、糙皮侧耳（Sunagawa
& Magae，2002；Sunagawa et al.，2007）的设置后，最终在靶距离 6 cm、9 cm，氦气压力 7.58 × 106
Pa、8.96 × 106 Pa 等条件下，得到了转化子，与荷叶离褶伞、糙皮侧耳等中筛选的氦气压力相似。
而对于受体材料的选择，本试验中最初参考 Sunagawa 等（2007）的方法选择直接以平板上生长的
菌丝为受体材料，经过基因枪轰击后，切割成小块，转接于抗性平板，但是实际筛选过程中，发现
带有小块培养基的菌丝在转接于抗性平板后，难以起到良好的筛选效果。本研究中将 PDA 培养菌丝
研磨后的悬浮液作为受体材料，通过覆盖筛选培养基的方法可以更简便的筛选转化子。由于蛹虫草
PDA 培养平板中既有菌丝也有无性孢子，本试验中使用的是菌丝与无性孢子混合物作为受体材料，
在进一步的研究中可以考虑单独选择菌丝或者无性孢子，以优化基因枪转化方法，提高转化效率。
研究显示，通过基因枪转化大型真菌而获得的转化子会有遗传不稳定的情况发生。基因枪转化
双孢蘑菇菌褶获得的转化子，虽然可以通过 PCR 检测到目的条带，但在随后的传代过程中会失去抗
生素抗性，遗传不稳定（曹育博 等，2011）。而基因枪转化荷叶离褶伞（Sunagawa et al.，2007）
与糙皮侧耳（Sunagawa & Magae，2002）获得的转化子，遗传稳定，可以连续传代 5 代以上。本试
验中，在最初获得的 3 个拟转化子均可以通过 PCR 扩增到目的条带，但在传代转接过程中发现，其
Mao Wen-jun，Bao Da-peng，Zhou Chen-li，Li Yan，Tan Qi，Wang Ying.
Effective transformation of Cordyceps militaris by particle bombardment.
1842 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (9)：1837–1842.
中 1 个拟转化子 Gfp1，经过第 1 次转接后即失去了草铵膦抗性，Altpeter 等（2005）认为，基因枪
转化会产生大量的、多拷贝和复杂的转基因位点，这些基因进一步重组从而导致不稳定和基因沉默，
这或许是对基因枪转化后遗传不稳定的一种解释。而本研究中另两个转化子 Gfp2、Gfp3 则遗传稳
定，一直保持了抗生素抗性与表达绿色荧光蛋白的能力。Southern 结果显示两个遗传稳定的转化子
分别为单拷贝与多拷贝插入基因组。因此应用基因枪法转化，结合多次抗性复筛，即可获得遗传稳
定的转化子，可以作为外源基因转化蛹虫草的有效手段。

References
Altpeter F，Baisakh N，Beachy R，Bock R，Capell T，Christou P，Daniell H，Datta K，Datta S J，Dix P，Fauquet C，Ning Huang，Kohli A，
Mooibroek H，Nicholson L，Nguyen TT，Nugent G，Raemakers K，Romano A，A. Somers D，Stoger E，Taylor N，Visser R. 2005. Particle
bombardment and the genetic enhancement of crops：Myths and realities. Molecular Breeding，15 (3)：305–327
Cao Yu-bo，Liu Tian-xiang，Zhou Wei-wei，Gao Yu-qian，Qi Yuan-chen，Shen Jin-wen，Qiu Li-you. 2011. Transformation of Agaricus bisporus
by particle bombardment of fruit body gill tissue. ACTA Edulis Fungi，18 (3)：9–11. (in Chinese)
曹育博，刘天翔，周巍巍，高玉千，戚元成，申进文，邱立友. 2011. 基因枪法遗传转化双孢蘑菇菌褶. 食用菌学报，18 (3)：9–11.
Cho Y，Davis J W，Kim K H，Wang J，Sun Q H，Cramer R A Jr，Lawrence C B. 2006. A high throughput targeted gene disruption method for
Alternaria brassicicola functional genomics using linear minimal element（LME）constructs. Molecular Plant-Microbe Interactions，19 (1)：7–15.
Dong J Z，Lei C，Ai X R，Wang Y. 2012. Selenium enrichment on Cordyceps militaris link and analysis on its main active components. Applied
Biochemistry and Biotechnology，166 (5)：1215–1224.
Duan Zhi-bing. 2010. Functional analyses of a phosphoketolase MPK1，a bax inhibitor-1 homologue MaBI-1 and the phosohorylation site mutation
studies of a perilipin MPL1 in the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae［Ph. D. Dissertation］. Shanghai：Institute of Plant
Physiology and Ecology，SIBS，CAS. (in Chinese)
段志兵. 2010. 金龟子绿僵菌 MPK1、MaBI-1 功能及 MPL1 磷酸化位点突变的研究[博士论文]. 上海：中国科学院上海生命科学研究院
植物生理生态研究所.
Kirk P M，Cannon P F，David J C，Stalpers J A. 2001. Dictionary of the fungi-9th edition. CAB International，Oxon：1–655.
Li S P，Yang F Q，Tsim K W. 2006. Quality control of Cordyceps sinesis，A valued traditional Chinese medicine. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis，41：1571–1584.
Liang Zong-qi，Liu Ai-ying，Liu Zuo-yi. 2007. Flora fungorum sincorum. Vol. 32. Cordyceps. Beijing：Science Press. (in Chinese)
梁宗琦，刘爱英，刘作易. 2007. 中国真菌志：虫草属. 北京：北京科学出版社.
Lin Qun-ying，Song Bin，Li Tai-hui. 2006. Advances in the studies on Cordyceps militaris. Microbiology China，33 (4)：154–157. (in Chinese)
林群英，宋 斌，李泰辉. 2006. 蛹虫草研究进展. 微生物学通报，33 (4)：154–157.
Paterson R R M. 2008. Cordyceps：A traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory? Phytochemistry，69 (7)：1469–1495.
Shrestha B，Zhang W M，Zhang Y J，Liu X Z. 2012. The medicinal fungus Cordyceps militaris：Research and development. Mycological Progress，
11：599–614.
Sunagawa M，Magae Y. 2002. Transformation of the edible mushroom Pleurotus ostreatus by particle bombardment. FEMS Microbiology Letters，
211 (2)：143–146.
Sunagawa M，Murata H，Miyazaki Y，Nakamura M. 2007. Transformation of Lyophyllum decastes by particle bombardment. Mycoscience，48：195–197.
Zhang Shu，Zhang Yong-jie，Shrestha B，Xu Jian-ping，Wang Chen-shu，Liu Xing-zhong. 2013. Ophiocordyceps sinensis and Cordyceps militaris：
Research advances，issues and perspectives. Mycosystema，32 (4)：577–597. (in Chinese)
张 姝，张永杰，Shrestha B，徐建平，王成树，刘杏忠. 2013. 冬虫夏草菌和蛹虫草菌的研究现状、问题及展望. 菌物学报，32 (4)：577–597.
Zheng P，Xia Y L，Xiao G H，Xiong C H，Hu X，Zhang S W，Zheng H J，Huang Y，Zhou Y，Wang S Y，Zhao G P，Liu X Z，St Leger R
J，Wang C S. 2011a. Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris，a valued traditional Chinese medicine. Genome
Biology，12：R116.
Zheng Z，Huang C，Cao L，Xie C，Han R. 2011b. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation as a tool for insertional mutagenesis in
medicinal fungus Cordyceps militaris. Fungal biology，115：265–274.