全 文 ：园艺学报，2016，43 (1)：15–24.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0574；http：//www. ahs. ac. cn 15
响应葡萄根瘤蚜侵染的扩展蛋白基因筛选及其
多克隆抗体的制备
季兴龙 1，韩 宁 2，翟 衡 1，杜远鹏 1,*
（1 山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018；2 齐鲁工业大学生物工程学
院，济南 250353）
摘 要：以对葡萄根瘤蚜敏感的‘克瑞森无核’葡萄（Vitis vinifera‘Crimson Seedless’）组培苗和抗
性砧木‘1103P’组培苗为试材，通过荧光定量 PCR 技术从扩展蛋白基因家族中筛选到经根瘤蚜侵染后表
达上调的扩展蛋白基因家族成员 VvEXPA1。采用 RT-PCR 方法克隆到 VvEXPA1 基因片段，连接至原核表
达载体 pET-32a 中，转化大肠杆菌 DE3 菌株，测序确定构建的重组载体 pET32a-VvEXPA1 开放阅读框正
确，并经 IPTG 诱导表达了融合蛋白。该蛋白以包涵体的形式存在，纯化后免疫新西兰兔，制备扩展蛋白
多克隆抗体，通过 Western-blot 和 ELISA 检测抗体的特异性及效价。结果显示制备的抗体具有较高的特
异性，ELISA 显示效价为 1︰51 200。
关键词：葡萄；根瘤蚜；扩展蛋白；VvEXPA1；多克隆抗体制备
中图分类号：S 663.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）01-0015-10

Identification of VvEXP Gene from Grape Roots Infected by Phylloxera
and Preparation of Polyclonal Antibody to Grape Expansin
JI Xing-long1，HAN Ning2，ZHAI Heng1，and DU Yuan-peng1,*
（1College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，State Key Lab of Crop Biology，
Tai’an，Shandong 271018，China；2College of Bioengineering，Qilu Technology of University，Ji’nan 250353，China）
Abstract：Based on qRT-PCR method，an expansin（VvEXPA1）was acquired and investigated from
infected Crimson Seedless grape and 1103P grape rootstock in present study. VvEXPA1 was cloned into
prokaryotic expression vector pET32a after identification by enzymatic digestion and sequencing，and then
the recombinant plasmid with VvEXPA1 was transformed into E. coli DE3. The results showed that the
protein was highly expressed in E. coli and the molecular weight of the recombinant protein was 41 kD.
The specific antibody was prepared by immunizing rabbit with the purified protein，and then detected by
Western-blotting and ELISA. Finally， the high specific antibody was obtained and the titers of
anti-VvEXPA1 antibody were 1︰51 200.
Key words：grape；phylloxera；expansin；VvEXPA1；poly-antibody preparation

收稿日期：2015–11–10；修回日期：2016–01–18
基金项目：国家自然科学基金项目（31201609）；山东省中青年科学家基金项目（BS2012NY007）；山东省自然科学基金项目
（ZR2013CQ022）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（20113702120007）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：duyuanpeng001@163.com）
Ji Xing-long，Han Ning，Zhai Heng，Du Yuan-peng.
Identification of VvEXP gene from grape roots infected by phylloxera and preparation of polyclonal antibody to grape expansin.
16 Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (1)：15–24.
葡萄根瘤蚜（Daktulosphaira vitifoliae Fitch）是葡萄专性寄生害虫，侵染敏感葡萄品种后，侵染
位点周围细胞开始加速生长（Kellow et al.，2004；Du et al.，2011），细胞体积加速膨大（杜远鹏，
2010），外观上表现为产生膨大的瘤状组织（Forneck et al.，2001），根瘤蚜在瘤状组织上取食并完成
整个发育周期产卵，瘤状组织能够提供根瘤蚜生长发育产卵所需的足够的营养物质（Granett &
Timper，1987），因此能否形成瘤状组织是判断葡萄品种对根瘤蚜敏感性的重要指标（Boubals，1966）。
扩展蛋白在细胞膨大中起关键作用，其位于细胞壁（Lee et al.，2001；Lee & Kende，2002），
是由 250 ~ 270 个氨基酸残基组成的单链蛋白，共分 3 个结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。其 N 末端 20 ~ 30
个氨基酸残基属于信号肽，可引导扩展蛋白分泌到细胞壁，结构域Ⅱ由 90 ~ 120 个氨基酸残基组成，
属于纤维素结合结构域（Sampedro & Cosgrove，2005）。根据扩展蛋白基因组分析可将植物中的扩
展蛋白家族分为 4 个亚家族 EXPA、EPXPB、EXPLA 和 EXPLB（Kende et al.，2004；Sampedro &
Cosgrove，2005）。其中，EXPA 和 EXPB 亚家族与细胞壁伸展有关，而 EXLA 和 EXLB 亚家族的功
能尚不明确。
作为细胞壁蛋白质，扩展蛋白不属于结构蛋白，而是一种酶蛋白，可以打断细胞壁纤维素与半
纤维素之间的共价键与非共价键，促使纤维素和半纤维素相互移位，引发细胞壁伸展（Cosgrove，
2000），因此扩展蛋白可以参与植物细胞生长、果实软化、根毛发生、花粉管延伸、组织分化等生长
发育过程，而且可能与植物在生物胁迫中形成的根结有关。Greisser 和 Grundler（2008）发现，根结
线虫侵染番茄形成的根结中，LeEXPA2、LeEXPA5 和 LeEXPA11 基因表达明显上调；在拟南芥中，
AtEXPA1、AtEXPA15 和 AtEXPB3 基因上调表达也与根结的形成有关（Jammes et al.，2005；Wieczorek
et al.，2006）。然而根瘤蚜侵染形成的根结和根瘤是否与根部细胞壁扩展蛋白活性调控有关，至今并
不明确。
本试验中从对根瘤蚜敏感的葡萄品种‘克瑞森无核’和抗性葡萄砧木‘1103P’根部扩展蛋白基
因家族中筛选与根结形成相关的基因，克隆其全长，进行原核表达以制备蛋白的多克隆抗体，为进
一步分析葡萄受根瘤蚜侵染后扩展蛋白功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2014 年 4 月进行。以‘克瑞森无核’葡萄（Vitis vinifera‘Crimson Seedless’）和葡萄砧
木‘1103P’无菌组培苗为试材。组培室培养光周期为 14 h/10 h，昼夜温度为 25 ℃。生长 40 d 后，
挑取 6 d 的根瘤蚜虫卵采用 Kellow 等（1999）的方法灭菌后，放在无菌的培养皿中孵化，1 d 后用
毛笔挑取 1 龄幼虫 200 头放在 1 cm × 1 cm 的灭菌滤纸上，然后将滤纸放入组培苗中。对照放入空
滤纸，如图 1 所示。接种完成后放在组培室培养，3 ~ 4 d 后根部形成根结。‘克瑞森无核’和‘1103P’
各接种 21 瓶，分别于接种后的第 0、4、8、16、24、48 和 72 h 取样。每次取样 3 瓶。
pET-32a 载体、大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）、DH5α 由实验室保存。RNAplant Plus
Reagent 试剂盒购自天根生物科技有限公司；小量质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自康为世纪生
物科技有限公司；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、异丙基硫化–β–D–半乳糖苷（IPTG）、反转
录试剂盒（Cat#RR047A）购自大连宝生物公司；包涵体蛋白纯化试剂盒和 Western-blot 二抗
（lot#J10309）购自全式金生物技术有限公司。

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响应葡萄根瘤蚜侵染的扩展蛋白基因筛选及其多克隆抗体的制备.
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图 1 根瘤蚜接种方式（A）及根局部放大（B）
Fig. 1 Injection methods of phylloxera（A）and partial zoom in root（B）

1.2 定量PCR技术筛选响应根瘤蚜侵染的葡萄根扩展蛋白基因
根据 Santo 等（2013）的方法，从葡萄基因组数据库中得到了 12 条 VvEXPA 和 4 条 VvEXPB 基
因序列，利用 Primer Premier 5.0 设计半定量引物（表 1）。在‘克瑞森无核’葡萄和‘1103P’根部
接种 1 龄根瘤蚜，并在接种 0、4、8、16、24、48 和 72 h 后分别收集根样品，使用 RNAplant Plus Reagent
试剂盒提取根总 RNA，反转录得到 cDNA，取适量作为模板。按照 SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）
操作指导，在 Bio-Rad 公司的 My-IQ2 荧光定量 PCR 仪上检测基因的表达量。
选取葡萄看家基因 Actin 作为内参基因，引物序列如表 1 所示。总反应体系为 20 µL：10 µL SYBR
Premix Ex TaqTM（2 ×）混合液，1 µL cDNA，1 µL 上、下游引物（10 mmol · L-1），8 µL ddH2O。两
步法扩增，具体程序为：95 ℃预变性 10 min，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 30 s，40 个循环，然后进
行熔解曲线分析。基因的相对表达量采用 2-ΔΔCT 或 2-ΔCT 法（Livak & Schmittgen，2001）计算，采用
Excel 软件绘图。

表 1 VvEXP 基因的半定量 PCR 引物及产物大小
Table 1 Primers used for reference genes（Actin）and putative expansin identification in RT-PCR
基因
Gene name
上游引物
Forward 5′–3′
下游引物
Reverse 5′–3′
产物大小/bp
Product size
Actin TGTGCTTAGTGGTGGGTCAA ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG 174
VvEXPA1 CCCCTTATTCTTGAGGTCCTT TTGAAGGCATAACATCTGAGG 155
VvEXPA2 ATGTGATGAATGTTGGTGGAGG TTTGCTACTAGAATCTGCTTGGT 181
VvEXPA3 AATGTTGGGTTGGATGGAGAA ATTGTAGGAGGTGAGTGTTTTTC 174
VvEXPA8 CCTCAATGTGGCACCTTCA GAATGGGTCTGGTTTAGAGTTG 204
VvEXPA12 TCCGAGTCAGAGTAAGTGATGGT ACAGGAAGGATATTCAGATGGA 130
VvEXPA13 CGCTTCTACAAGACCAAAATC CATTTCACCATCAAAACCAGA 191
VvEXPA14 TTGGGAGAAGGGAAAATGGA TCAACAAAAGGCGACCAAC 166
VvEXPA15 AATGTCAAGATTAAGGGCTCC CATTATCGGACTGAACCATCT 148
VvEXPA16 GAAGGGAAAATGGAAAGGAAA TCAACAAAAGGCGACCAACA 159
VvEXPA17 TATCGCATATATTTCCCCTTC AAAGGACAAACTCATCCATCA 124
VvEXPA18 ATATACTGTTGTCCTTGGGGG GAATAAGGGTCTCTGAATAGGG 158
VvEXPA19 TACTATCAACTCCTTGTGCCC TGTAAAATGAAGAAAAAAAGAACT 178
VvEXPB1 GCTGGATGCTGGCTATGAA GCCAGGGCTCAAAGGTAG 153
VvEXPB2 TAGAGATGAGGCATGTGTGGG GAAGTTGAGCCGAGAGGTGT 170
VvEXPB3 GGTGACTGTGACGATAACTGAT ATACTCGCACTCAACCCTTCT 166
VvEXPB4 ACTTGGTAGACTTTGTTTGGCT AGTGGAGACAGATGTAAAAGCC 193

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1.3 VvEXPA1 基因全长克隆与测序
根据葡萄基因组数据库中VvEXPA1（Gi:35947332）核酸序列，去掉N端信号肽后设计该基因引
物。上游引物：5′GGATCCGGTGGTGCTTGTGGGTAT3′（下划线部位为BamHⅠ酶切位点），下游引
物：5′GTCGACGGAACTGTGCTCCACTGAA3′（下划线部位为SalⅠ酶切位点）。以cDNA为模板使
用高保真DNA聚合酶（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒TAKARA BIO INC）进行
PCR反应。PCR反应条件：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，
35 个循环；72 ℃终延伸 5 min。用 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物与pEASY-blunt载体
连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并送金唯智公司测序，测序正确的阳性克隆命名为
pEASY-blunt-VvEXPA1。
1.4 原核表达载体的构建及鉴定
在 BamHⅠ和 SalⅠ位点将 VvEXPA1 基因全长连入原核表达载体 pET-32a，转化大肠杆菌 DE3，
挑选阳性克隆并测序。
1.5 融合蛋白的诱导表达及包涵体纯化
将含有 VvEXPA1 基因全长的阳性克隆接种于含有 100 µg · L-1 Amp 的 LB 液体培养基中，37 ℃
振荡培养过夜，然后按 1︰50 接种量进行扩大培养，至 OD600 约为 0.5，加入 IPTG 至终浓度为 0.5
mmol · L-1，27 ℃继续振荡培养 4 h 以诱导蛋白的表达。包涵体纯化方法参照 ProteinIso Ni-NTA REsin
试剂盒说明书。用 SDS-PAGE 电泳检测纯化产物。
1.6 多克隆抗体的制备、效价检测及特异性鉴定
取新西兰兔（约 2 kg）一只，进行 4 次免疫，免疫之前取前耳静脉阴性血清。初次免疫时，取
纯化的融合蛋白，等体积加入完全弗氏佐剂，经过充分乳化后，背部皮下注射（8 ~ 10 点），免疫剂
量为 400 µg。间隔两周进行加强免疫（加不完全弗氏佐剂），总共进行 3 次。末次免疫 10 d 后，耳
静脉取血进行效价测定，合格后颈动脉取血，离心收集多抗血清。将纯化的抗原用包被稀释液稀释，
终浓度为 2 µg · mL-1，包被聚乙烯微孔板，100 µL · 孔-1，4 ℃过夜后，以 PBS 洗液洗涤两次，封闭
液封闭，37 ℃作用 2 h。PBS 洗涤 1 次后，多抗血清从 1︰200 开始 2 倍梯度稀释，以 PBS 为空白
对照，阴性对照为 1︰200 阴性血清，37 ℃作用 1 h 后，PBS 洗涤 3 次，再依次加入 HRP–羊抗兔
IgG 和 DAB 底物，最后加入 1 mol · L-1 的硫酸铵（50 µL · 孔-1），双波长（450 nm、630 nm）测吸
光值。并用 Western-blot 方法对多克隆抗体的特异性进行鉴定（Fischer-Schliebs et al.，1997）。
2 结果与分析
2.1 ‘克瑞森无核’葡萄根中扩展蛋白基因的相对表达量
以‘克瑞森无核’葡萄根系（未被侵染）为基础，使用定量 PCR 技术检测了各扩展蛋白基因在
根中的相对表达量（采用 2-∆CT 法计算）。结果显示：VvEXPA1、VvEXPA13、VvEXPA14、VvEXPA16、
VvEXPA18、VvEXPA19 和 VvEXPB1、VvEXPB2 在根中的表达量较高，可能在根生长发育中起主要作
用（图 2）。

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图 2 ‘克瑞森无核’未被侵染植株根中扩展蛋白各基因的相对表达量
Fig. 2 Relative expression level of expansin genes in uninfected roots of Crimson Seedless grape
2.2 响应根瘤蚜侵染的扩展蛋白基因筛选
为了筛选响应根瘤蚜侵染的扩展蛋白基因，使用定量 PCR 技术检测了经根瘤蚜侵染不同时间后
‘克瑞森无核’葡萄和抗根瘤蚜砧木‘1103P’根中各扩展蛋白基因的相对表达量变化（采用 2-∆∆CT
法计算，图 3）。


图 3 ‘克瑞森无核’和‘1103P’葡萄根被根瘤蚜侵染后根系扩展蛋白各基因的相对表达量
Fig. 3 Relative expression level of expansin genes in the infected roots of Crimson Seedless grape and 1103P grape rootstock


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对照根扩展蛋白基因表达量随处理时间无显著变化，基本为 1。在抗性砧木‘1103P’中，VvEXPA1、
VvEXPA14、VvEXPA16 和 VvEXPA19 的表达量在接种根瘤蚜后呈现出先升高随后迅速降低的趋势，
表现峰值低、下降快（图 3）。在‘克瑞森无核’根中，对根瘤蚜侵染响应最明显的 VvEXPA1 表达
量随着根瘤蚜侵染时间的延长持续增加，在处理 72 h 达到峰值时是对照的 18 倍，VvEXPA14 和
VvEXPA16 的表达量则呈现先升高后降低的趋势。接种根瘤蚜后，VvEXPA18 的表达趋势在两个品种
上正好相反，在‘克瑞森无核’根中陡然上调并持续保持较高含量，而在‘1103P’中则迅速降低。
接种根瘤蚜后，VvEXPA13 的表达量在‘1103P’中有先升高后降低的趋势，而在‘克瑞森无核’中
呈现波动性变化。根据根瘤蚜胁迫后葡萄根扩展蛋白基因在这两种葡萄材料中的表达量变化趋势及
响应幅度，结合根结在形成过程中保持细胞体积持续增大的现象，推测 VvEXPA1 可能是响应根瘤蚜
侵染的扩展蛋白关键基因。
2.3 VvEXPA1 表达的组织特异性
进一步对筛选到的 VvEXPA1 进行组织特异性分析。选用 3 年生‘克瑞森无核’葡萄植株，在开
花前取根、茎、幼叶、成熟叶和花，随后取膨大期的果实，检测 VvEXPA1 的表达情况（采用 2-∆CT
法进行计算）。结果显示，VvEXPA1 在葡萄不同组织中皆有表达，但差异较大。在根、成熟叶及膨
大期的果肉、果皮中表达量较低，在细胞增殖速度较快的花和幼叶中表达量较高（图 4）。








图 4 ‘克瑞森无核’葡萄 VvEXPA1 表达的组织特异性
Fig. 4 Expression analysis of VvEXPA1 in different Crimson Seedless grape organs

2.4 VvEXPA1 基因的克隆
根据葡萄基因组数据库的 VvEXPA1 核苷
酸序列设计引物，以‘克瑞森无核’葡萄根
cDNA为模板进行PCR扩增，得到1条长621 bp
的基因片段（图 5），符合预期大小。将产物回
收纯化，连接到 pEasy-blunt 载体上并对重组分
子进行测序，结果表明扩增出的 VvEXPA1 基因
序列与葡萄基因组中的原序列完全一致，即所
得片段为 VvEXPA1 基因。经双酶切重组质粒
pEasy-blunt-VvEXPA1 后连入原核表达载体
pET32a，转化大肠杆菌 DE3，挑选阳性克隆，
经测序鉴定，构建重组分子 pET32a-VvEXPA1
的阅读框正确。
图 5 VvEXPA1 基因 PCR 扩增产物电泳图
M：分子量标准 D2000。
Fig. 5 PCR product of VvEXPA1 gene
M：D2000 ladder.
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2.5 VvEXPA1 的同源分析
将 VvEXPA1 蛋白序列在 NCBI 数据库中进行 blastp 分析，并用 ClustalX 进行同源序列比对，
发现该蛋白序列与豆科、茄科、禾本科及蔷薇科等多种作物的类扩展蛋白（Expansin-like protein）
序列同源性较高，分别为杨树 90%，苹果 87%，柑橘 86%，大豆 85%，黄瓜 85%，拟南芥 83%，水
稻 78%，玉米 71%，小麦 73%。如图 6 显示，目的蛋白含有 3 个结构域。结构域 1 是由 20 ~ 30 个
氨基酸残基组成的信号肽区域，结构域 2 是位于整个蛋白序列中段的催化域（catalysis domain），含
120 ~ 135 个氨基酸残基，这段区域内半胱氨酸含量较为丰富，一般分布有 6 个保守的半胱氨酸和 1
个组氨酸域，据推测可能与二硫键形成有密切关系；结构域 3 存在于扩展蛋白的羧基端，一般包含
有 90 ~ 120 个氨基酸残基，具有 4 个保守的色氨酸残基丰富域，可与细胞壁中的纤维素相结合，该
域对 pH 变化敏感，可导致分子构象发生变化（ Sampedro & Cosgrove，2005）。























图 6 VvEXPA1 与其他植物 EXP 同源比对
domain 1：信号肽；domain 2：蛋白催化域；domain 3：蛋白结合域。
Fig. 6 Alignment of VvEXPA1 with other plant expansins
domain 1：Signal peptide domain；domain 2：Protein catalytic domain；domain 3：Protein binding domain.

2.6 VvEXPA1 融合蛋白的表达与纯化
原核表达阳性菌经 IPTG（终浓度 0.5 mmol · L-1）诱导 4 h 后，对细胞粗提物进行 SDS-PAGE 电

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泳检测。结果显示：与对照菌株（pET-32a）相比，原核表达菌（pET-32a-VvEXPA1）在相对分子量
41 kD 附近出现一条新带，与预期的融合蛋白 6 × HIS-VvEXPA1 分子量一致（图 7）。进一步对诱导
后的菌体用细胞超声破碎仪进行超声波破碎，发现葡萄 VvEXPA1 重组蛋白以包涵体形式存在。经
纯化后得到高纯度包涵体（图 7），符合免疫要求。


图 7 克瑞森无核 VvEXPA1 融合蛋白的表达与纯化
M：蛋白分子量标准；1：pET-32a-VvEXPA1 转化子诱导后的总蛋白；2：pET-32a 空质粒转化子诱导后的总蛋白；
3、4：纯化后的包涵体蛋白。
Fig. 7 SDA-PAGE analysis of VvEXPA1 expression in E. coli
M：Protein molecular weight marker；1：Total proteins of induced E. coli transformed with pET-32a-VvEXPA1；
2：Total proteins of induced E. coli transformed with pET32a；3，4：The purified fusion protein.

2.7 VvEXPA1 多克隆抗体的制备与鉴定
将纯化后的葡萄 VvEXPA1 融合蛋白作为抗原免疫新西兰兔，得到抗血清，用 Protein-G 方法纯
化后得到多克隆抗体，通过 ELISA 法检测抗体效价为 1︰51 200（表 2）。

表 2 ELISA 法检测 VvEXPA 多克隆抗体效价
Table 2 Polyantibody titers detection of VvEXPA1 protein
被检物
Objection
免疫血清
Immune serum
空白
Blank
阴性血清
Negative serum
稀释度 Dilution 1︰800 1︰1 600 1︰3 200 1︰6 400 1︰12 800 1︰25 600 1︰51 200 1︰102 400 1︰12 800 1︰200
OD450,630 1.34 1.327 1.317 1.284 1.168 1.033 0.819 0.579 0.009 0.019

另外使用 Western-blot 检测其特异性，结果显示免疫血清能特异性识别经诱导后的重组菌体目
标蛋白（图 8）。




图 8 纯化产物 Western-blot 分析
1：阴性血清对照；2：诱导纯化产物。
Fig. 8 Identification of the expressed Vv-pET32a protein polyclonal antibody by Western-blot
1：Negative serum；2：Polyclonal antibody.
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3 讨论
葡萄根瘤蚜是葡萄的专性寄生害虫，在敏感品种上根瘤蚜能完成整个生长发育过程，产生根结
和根瘤；而在抗性品种上取食不能完成完整的生活史，或者其生长和产卵受到抑制（杜远鹏 等，
2008），不形成或形成少量根结，且根结的体积显著小于敏感品种形成的根结，因此根结细胞的膨大
是根瘤蚜构成侵染的必然结果（Du et al.，2011）。
诸多文献认为扩展蛋白基因在细胞膨大中具有重要作用（Jammes et al.，2005；Wieczorek et al.，
2006）。本研究中发现，当抗性砧木‘1103P’接种根瘤蚜后，VvEXPA1、VvEXPA14、VvEXPA16 和
VvEXPA19 的表达量迅速升高后陡然降低，表明不利于细胞的扩大；而当根瘤蚜侵染敏感品种‘克
瑞森无核’时，VvEXPA1 表达量持续增加并一直维持较高的水平，因此，尽管 VvEXPA1 在根中的表
达量少于 VvEXPA14 等其他基因，但对根瘤蚜侵染的响应幅度却明显高于其他扩展蛋白基因。此外，
试验检测了接种空白滤纸对照的根系中扩展蛋白基因在各取样时间段的表达量，发现扩展蛋白基因
表达量并无显著变化，排除了因接种空白滤纸对试验结果产生影响的可能。由此推测 VvEXPA1 可能
在根瘤蚜侵染‘克瑞森无核’葡萄根形成根瘤和根结中起主要作用。但此推测还需在扩展蛋白水平
上进一步验证。
另外，扩展蛋白家族属于多基因家族，本研究中从葡萄基因组数据库中共发现了 16 条扩展蛋白
基因（Santo et al.，2013），这些家族基因的表达具有组织、发育阶段及环境特异性（Keller & Cosgrove，
1995）。本研究中 VvEXPA1 也具有组织表达特异性，其在根、老叶、膨大期的果肉、果皮中的表达
量比较少，而在幼叶和花中的表达量较高，可能是因为嫩叶和花处于细胞快速增殖和生长期，
VvEXPA1 在嫩叶和花中的大量表达能促进细胞增殖，这也证实了扩展蛋白基因有促进细胞生长的功
能（Muller et al.，2007）。
本试验中通过制作扩展蛋白抗体，为进一步研究 VvEXPA1 在根瘤蚜侵染葡萄根形成根瘤和根结
过程中的功能奠定了基础。同时，通过 VvEXPA1 与其他作物的同源序列比对发现，扩展蛋白具有
高度的保守性，因此该多克隆抗体也为研究扩展蛋白在其他作物中的作用摸索了新途径。

References
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