全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（8）：1501–1510 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–04–05；修回日期：2012–07–12
基金项目：北京市农林科学院科技创新能力建设项目（KJCX201102003）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：liufan@nercv.org）
大白菜耐旱相关基因 BpNFYA5 的克隆及功能
初步分析
黄人卉 1,2，王桂香 2，刘 凡 2,*
（1 首都师范大学生命科学学院，北京 100089；2 北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业部华北地区园艺作物生物学
与种质创制重点实验室，北京 100097）
摘 要：以拟南芥（Arabidopsis thaliana）NFYA5 基因（GenBank 登录号：At1g54160）的序列为基
准，通过比对获得芸薹属大白菜[Brassica campestris L. ssp. pekinensis（Lour.）Makino]同源 EST 序列；采
用电子克隆的方法从大白菜中克隆到相关基因全长序列，命名为 BpNFYA5。该基因包含 3 个内含子，其
推导蛋白与拟南芥 NFYA5 CCAAT-box 结合域相似性达 92.6%。对大白菜进行干旱胁迫，发现 BpNFYA5
显著上调表达。构建了植物过表达载体 pBIn-NFYA5 和 RNA 干扰载体 pFGC-NFYA5，通过根癌农杆菌
（Agrobacterium tumefaciens）介导浸花法转化拟南芥。经除草剂、潮霉素筛选及 PCR 鉴定获得转基因植
株。采用干旱和 10% PEG6000 模拟亏水胁迫，对转基因材料的 T2 代进行了耐旱性鉴定。结果显示：过表
达植株（OL）较野生型植株（WT）和干扰表达植株（Ri）叶绿素含量高；渗透胁迫下 OL 植株脯氨酸含
量迅速积累，积累量显著高于 WT 和 Ri 植株；控水干旱 2 周 OL 株系较 WT 及 Ri 材料具有更好的干旱耐
受性；OL 株系离体叶片的失水速率较小，叶片有效水分利用率较 WT 和 Ri 高。结果表明所克隆的基因
BpNFYA5 在亏水胁迫调控中具有抗旱作用。
关键词：大白菜；拟南芥；BpNFYA5；基因；抗旱性；功能
中图分类号：S 634.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）08-1501-10

Cloning and Functional Analysis of a Drought-responsive Gene BpNFYA5
from Chinese Cabbage
HUANG Ren-hui1,2，WANG Gui-xiang2，and LIU Fan2,*
（1School of Life Sciences，Capital Normal University，Beijing 100089，China；2Beijing Vegetable Research Centre，Key
Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（North China），Ministry of Agriculture，Beijing
100097，China）
Abstract：Through alignment with the sequence of NFYA5 gene from Arabidopsis thaliana
（At1g54160），we got the homologous ESTs in Chinese cabbage[Brassica campestris L. ssp. pekinensis
（Lour.）Makino]. Then，the full length of the gene namely BpNFYA5 was cloned by the method of
Electronic Clone. The deduced protein of BpNFYA5 has the CCAAT-box binding domain，which showed
92.6% amino acid sequence identify with that of Arabidopsis. BpNFYA5 transcript is strongly induced by
drought stress. The over-expression vector pBIn-NFYA5 and RNA-interference vector pFGC-NFYA5

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were constructed and transformed to Arabidopsis thaliana（Col）mediated by Agrobacterium tumefaciens.
The drought-tolerance was analyzed between the BpNFYA5 over-expression（OL），RNA-interference（Ri）
and the wild-type（WT）Arabidopsis through the methods of drought stress and 10% PEG6000 drought
simulated treatments. The results showed that chlorophyll content of OL was higher compared with those
of WT and Ri；Proline content of OL accumulated quickly and showed higher than those of WT and Ri；
Likewise，the rate of water loss in OL leaves was less than in WT and Ri. All above suggested that
BpNFYA5 gene play an important role in drought response.
Key words：Chinese cabbage；Arabidopsis；BpNFYA5；gene；drought-tolerance

大白菜栽培耗水量极大，培育耐旱、节水品种对于提高水分利用率有重要意义。20 世纪 90 年
代以来，农业节水生物技术领域的研究工作集中在模式植物拟南芥上，也通过基因转移和重组，获
得了小麦（Pellegrineschi et al.，2004）、玉米（Nelson et al.，2007）和水稻（Oh et al.，2009）的耐
旱性材料，但蔬菜的耐旱基因工程还鲜有报道。
NF-Y（核转录因子 Y，Nuclear factor Y）是由 NF-YA（又称 CBF-B 或 HAP2）、NF-YB（又称
CBF-A 或 HAP3）和 NF-YC（又称 CBF-C 或 HAP5）组成的异源三聚体（Nakshatri et al.，1996），
是一个普遍存在的转录因子。它与 CCAAT-box 有很高的亲和性，而 25%真核生物基因的启动子区
都含有CCAAT顺式作用元件。NF-YA和NF-YC亚基包含一个富含谷氨酸的结构域和一个疏水残基，
对转录激活性起到重要作用（Mantovani，1999）。在动物和酵母中，每个 NF-Y 亚基都是由单拷贝
基因编码的，而在植物拟南芥整个基因组中有 10 个 NF-YA 编码基因，13 个 NF-YB 编码基因和 13
个 NF-YC 编码基因（Gusmaroli et al.，2002）。其中 NFYB9（LEC1）在胚胎发育中起到关键的作用
（Lee et al.，2003）。Nelson 等（2007）研究表明在拟南芥和玉米中过表达 NFYB1 可以显著地提高
植株的抗旱性，在干旱条件下获得显著高于对照的产量。对拟南芥 NFYA5 转录因子的研究发现，
干旱胁迫和脱落酸（ABA）处理下 NFYA5 被强烈诱导表达，过表达 NFYA5 的转基因拟南芥植株比
正常的野生型表现出叶片水分损失量少，对干旱的抗性显著增强等特性。并且发现 NFYA5 序列上存
在一个 microRNA（miR169）的靶位点，而 miR169 的表达受干旱抑制（Li et al.，2008）。这说明
NFYA5 不仅在转录水平受到干旱的调控，而且很可能转录后水平也受到 microRNA 介导的调控。在
拟南芥中，nfya5 功能缺失突变体表现出对干旱的高度敏感性，而 NFYA5 过表达的转基因植株表现
出对干旱的高度抗性，说明 NFYA5 确实是在干旱抗性途径中起关键作用的调控因子。
本研究中以此为出发点，基于芸薹属植物和拟南芥的亲缘关系，借助芸薹属 A、C 基因组测序
所积累的信息平台，从芸薹属大白菜中克隆到 BpNFYA5 基因；并通过构建过表达载体及干扰表达载
体转化拟南芥，通过对转基因材料的抗旱性分析来了解该基因的功能。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
大白菜‘北京 80 号’和拟南芥（Columbia 生态型）种子由本实验室保存。拟南芥在 22 ℃，相
对湿度 80%，光照周期为 16 h 光照/8 h 黑暗的气候箱中生长。试验自 2010 年 1 月开始。
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 感受态购于天根生化科技（北京）有限公司，根癌农杆菌
LBA4404 菌株由本实验室保存；过表达载体 pBIn-HSK 由本实验室改造保存，干扰表达载体
pFGC-1008 为中国农业大学郭仰东教授惠赠。各种内切酶、T4 连接酶购自 Fermentas 公司；RNA 提
8 期 黄人卉等：大白菜耐旱相关基因 BpNFYA5 的克隆及功能初步分析 1503

取试剂盒、M-MLV 逆转录试剂盒、DNA 回收试剂盒购自购自天根生化科技(北京)有限公司，荧光
定量试剂盒购自 TaKaRa 试剂公司。引物（表 1）合成和 DNA 测序由北京奥科鼎盛生物科技有限公
司完成。
1.2 大白菜中 BpNFYA5 的克隆
用拟南芥 NFYA5（GenBank 登录号：At1g54160）序列在芸薹属数据库和 GenBank 中比对，获
得同源的 EST-contig 序列，设计引物（表 1），并以大白菜 DNA 和 cDNA 为模板通过 PCR 扩增，克
隆 NFYA5 转录因子基因同源 DNA 序列和 cDNA 序列。将 PCR 产物回收后连接到 pEASY-T 载体，
重组质粒转化大肠杆菌 DH5α，经蓝白斑筛选阳性克隆送测序，所得序列分别在 Brassicadb 和 NCBI
进行对比分析。
表 1 PCR 引物序列
Table 1 PCR primer sequence
引物
Primer
序列
Sequence（5′–3′）
引物
Primer
序列
Sequence（5′–3′）
NFYA5-L7 ATGCAAGTCCCAACAAATTC qF CAGGAGGTTACATCGTAAGC
NFYA5-R7 TCACGTCCCTGACATGAGAG qR GGTTGAGATGCATATTCAGG
NFYA5pbL TTGGCGCGCCTATGCAAGTCCCAACAAAT act2 CTGGACCTGCCTCATCATAC
NFYA5pbR CCATTTAAATCACGTCCCTGACATGAGAG act3 GTGCTCAGTGGTGGAACAAC
NFYA5Ri-1F GGACTAGTCCATGGTGTCTCACGATTCT hygL GCCTGACCTATTGCATCTCC
NFYA5Ri-1R CCTTAATTAAGCTGAGACATGGTGTGTTGA hygR TTCTACACAGCCATCGGTCC
NFYA5Ri-2F TTGGCGCGCCGTCCATGGTGTCTCACGATT barL GGTCTGCACCATCGTCAACCAC
NFYA5Ri-2R CCATTTAAATAGCTGAGACATGGTGTGTTG barR AGCTGCCAGAAACCCACGTCAT
注：下划线为添加的酶切位点。
Note：Underlined in primers indicate restriction enzyme sites.
1.3 干旱及 ABA 处理的大白菜 BpNFYA5 的表达分析
在温室栽培大白菜正常生长 45 d 时开始亏水处理，分别在亏水 0、5、13、16 和 20 d 剪取叶片
提取 RNA。同批栽培 45 d 的大白菜用 ABA（200 μmol · L -1）喷施处理，分别在处理 0、6、10 和
24 h 剪取叶片提取 RNA。RNA 反转录得到的 cDNA 用做相对定量 RT-PCR 的模板。该试验重复 3
次。
依据 qRT-PCR 引物设计要求，使用 primer 设计 BpNFYA5 特异引物 qF/qR，以 Actin 基因作内标，
设计引物 act2/act3。用 qRT-PCR 专用 96 孔板（Axygen，美国）和 LightCycler®480 荧光定量 PCR
仪进行 qRT-PCR 分析，每个样品重复 3 次。相对表达量 Fold change = 2–ΔΔCT（Livak & Schmittgen，
2001）。采用 t 检验进行差异显著性分析。
1.4 载体构建和拟南芥转化
1.4.1 BpNFYA5 表达载体的构建
设计特异性引物 NFYA5pbL/NFYA5pbR，以 BpNFYA5 的 cDNA 片段为模板，PCR 扩增得到带
有 AscⅠ/ SwaⅠ酶切位点的 DNA 片段；用 AscⅠ/ SwaⅠ双酶切该片段和 pBIn-HSK（含有 AscⅠ/
SwaⅠ酶切位点及 HSK 外源片段）载体；然后连接转化并测序，得到重组质粒，命名为 pBIn-NFYA5。
1.4.2 BpNFYA5 干扰载体构建
选取 BpNFYA5 基因 cDNA 中间长 477 bp（195 ~ 672 bp）的片段作为干扰该特定基因的靶序列，
用于构建干扰载体。用带酶切位点的特异性正向引物 NFYA5Ri-1F/NFYA5Ri-1R 进行 PCR 扩增，回
收纯化的 PCR 产物用 SpeⅠ/PacⅠ双酶切后，与 SpeⅠ/PacⅠ双酶切得到 pFGC1008 开环相连接，并
经菌落 PCR 和测序鉴定，得到中间载体 pFGC1008F；再用反向引物 NFYA5Ri-2F/NFYA5Ri-2R 扩增
出反向序列，回收纯化的 PCR 片段经 AscⅠ/SwaⅠ双酶切后，与 AscⅠ/SwaⅠ双酶切的 pFGC1008F
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开环连接，通过菌落 PCR 和测序鉴定，获得重组的 pFGC-NFYA5 干扰载体。
1.4.3 拟南芥转化及筛选
拟南芥气候箱栽培参照《拟南芥试验手册》（Weigel & Glazebrook，2004）；冻融法（Rhodes et
al.，1988）转化根癌农杆菌 LBA4404 获得工程菌；农杆菌介导浸花法转化拟南芥（Zhang et al.，2006）。
每5 d侵染1次，连续侵染3次，培养至开花结荚收取成熟种子（T0代）。干扰载体转化植株用50 mg · L-1
潮霉素筛选，过表达载体转化植株用体积浓度 0.15%的 Basta 除草剂筛选，抗性株（T1 代）自交留
种。筛选得到的 T2 种子与野生型 WT 在 MS 培养基上生长，得到幼苗用于抗旱性评价。
1.5 BpNFYA5 过表达的拟南芥抗旱性评价
叶绿素含量测定：按照 Laby 等（2000）的方法测定叶绿素含量。取生长 16 d 的材料，分别转
入含 10% PEG6000 和不含 PEG 的液体 MS 培养基中培养 1 周，取培养基以上部分称量其质量；等
量组织孵化在丙酮︰乙醇为 2︰1 的 1 mL 浸提液中，室温下震荡 14 h 萃取叶绿素，取 1.5 µL 萃取液
用超微量紫外分光光度计测量波长在 663 nm 和 645 nm 处的吸光值。试验重复 3 次。
脯氨酸含量测定：取生长 14 d 的材料，分别转移到含有 10% PEG6000 和不含 PEG 的 MS 液体
培养基中，22 ℃持续光照 5 d，用酸性茚三酮法测定脯氨酸的含量（张殿忠 等，1990）。
离体叶片失水率测定：取生长 28 d 的材料各 5 株，每株取 2 片称量初始鲜质量后，将叶片放在
30 ℃光照培养箱中分别在 30、60、120 和 160 min 测叶片质量，试验重复 4 次。失水率（%）=（初
始质量–实时质量）/初始质量 × 100（Cui et al.，2008）。
叶片气孔密度测定：取培养 30 d 的材料新鲜叶片，用透明胶粘下下表皮在光学显微镜下观察
气孔形态和统计气孔密度，每个叶片观察 5 个视野，每株取 3 片，每株系测 5 株。
叶片净光合速率、蒸腾速率及叶片水分有效利用率的测定：同一培养钵中土培 30 d 的植株莲座
叶中叶龄一样的叶片，用便携式光合速率测定仪（LI-COR LI-6400）测定净光合速率（Pn）和蒸腾
速率（Tr），每个株系测定 3 株，每株测 3 片叶子。叶片水分有效利用率 WUE = Pn/Tr。
2 结果与分析
2.1 BpNFYA5 cDNA 克隆和序列分析
拟南芥NFYA（At1g54160）序列在BrassicaDB和GenBank中比对得到芸薹属作物同源EST-contig
序列 JCVI_22231。JCVI_22231 序列分析发现具有一个完整读码框及 5´端和 3´端非编码区（UTR）。
在同源区域设计包含读码框的起始位点 ATG（NFYA5-L7）和终止位点 TGA（NFYA5-R7）的引物
（表 1）。通过 PCR 扩增，从大白菜中分离出长度为 690 bp 的同源 cDNA 片段，及长度为 971 bp 的
DNA 片段。克隆到的 DNA 片段在 Brassica datebase（http：//brassicadb. org/）上进行数据比对，发
现该片段位于大白菜 A08 号染色体上（A08：1369245……1370216），且该片段的上游和下游分别可
以找到 JCVI_22231 的 5′端和 3′端 UTR 序列。因此确认从大白菜中克隆到 NFYA5 的同源基因
BpNFYA5 的全长序列。白菜基因组测序已完成，以 NFYA5 注释的基因序列在白菜基因组中可以找
到 3 个，其中有 1 个位于 A06 号染色体上，2 个位于 A08 号染色体。本试验中克隆到 BpNFYA5 与
A08 号染色体中的 1 个位置一致，与另外 2 个同源序列的相似度分别为 0.454 和 0.488。对 BpNFYA5
的 DNA 和 cDNA 序列分析发现该基因含有 3 个内含子，可以编码含 229 个氨基酸的推导蛋白。推
导蛋白的氨基酸序列与拟南芥 NFYA5 蛋白序列比对，具有 CCAAT-box 结合区域（图 1），与已报道
的拟南芥 NFYA5 CCAAT-box 结合区域 CBFB_NFYA 相似性达 92.6%。
8 期 黄人卉等：大白菜耐旱相关基因 BpNFYA5 的克隆及功能初步分析 1505


图 1 BpNFYA5 的 cDNA 序列及其推导的氨基酸序列
灰色突出显示 CCAAT-box 结合域。
Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of BpNFYA5
CCAAT-box binding domain is highlighted in gray.

2.2 BpNFYA5 的表达与干旱和 ABA 诱导的关系
利用相对定量 RT-PCR 对干旱胁迫、ABA 处理下大白菜 BpNFYA5 表达量进行分析。结果表明：
干旱胁迫 5 d 时 BpNFYA5 表达量基本不变，处理 16 d 时显著增高，约为处理前的 41 倍，在处理 20
d 时表达量下降至 2.7 倍（图 2）。外源 ABA 处理大白菜，处理后 BpNFYA5 的表达量降低，在 6、
10、24 h 时的表达量约是未处理组的 0.9、0.3、0.4 倍（图 2）。结果说明，大白菜 BpNFYA5 基因受
到干旱的强烈诱导表达，与植物的抗旱性调控有关，但可能并不依赖于 ABA 途径。

图 2 干旱和 ABA 处理对大白菜中 BpNFYA5 的表达调控
对照的表达水平设为 1.0，误差线为 3 次重复试验的标准方差。
*和**分别表示 t 检验与对照组差异显著性在 P < 0.05 和 P < 0.01 水平上。
Fig. 2 Regulation of BpNFYA5 expression by drought stress and ABA in Chinese cabbage
The level of BpNFYA5 transcript in the controls was set at 1.0. Error bars represent SD for three independent experiments.
* and ** designate a significant difference between controls and treatments at P < 0.05 and P < 0.01 levels，respectively，based on t test.
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2.3 载体构建及转化拟南芥
成功构建了表达载体 pBIn-NFYA5 和干扰载体 pFGC-NFYA5，所构建的质粒载体的结构如图 3
所示。

图 3 pBIn-NFYA5 和 pFGC-NFYA5 载体示意图
CaMV 35S：启动子；NOS、OCS：终止子；Bar、Hyg、Gus：选择标记。
Fig. 3 Recombinant plasmid of pBIn-NFYA5 and pFGC-NFYA5
CaMV 35S：Promoter；NOS，OCS：Terminator；Bar，Hyg，Gus：The selection marker.

根癌农杆菌浸花转化的拟南芥收获当代种子（T0）播种在苗盘或 MS 培养基上，用 Basta 或潮
霉素分别进行筛选。存活的抗性株自交留种，收获的 T1 代种子相同方法筛选。提取 T1 代抗性株 DNA，
分别用筛选标记基因的特异引物 barL/barR 和 hygL/hygR 进行 PCR 鉴定。抗性株分别扩增出 438 bp
的 Bar 基因片段和 712 bp 的 Hyg 基因片段（图 4）。抗性株继续自交留种，获得 T2 代种子用于抗旱
性评价。

图 4 转化株筛选标记 PCR 鉴定结果
M：分子量标准；1 ~ 15：过表达转基因植株的 Bar 基因 PCR 结果；18 ~ 25：干扰表达的 Hgy 基因 PCR 结果；
16、26：阴性对照；17、27：阳性对照。
Fig. 4 PCR identification of the transformed plants
M：Marker；1–15：PCR results of the over-expression plants；18–25：PCR results of the RNA-interference plants；
16，26：Negative control；17，27：Positive control.

2.4 转基因株抗旱性评价
2.4.1 叶绿素含量
过表达转基因株系（OL5、OL6），干扰表达转基因株系（Ri）和野生型（WT）拟南芥均在 10%
PEG 处理和正常培养基条件（未处理）下生长。OL5、OL6 与 WT 和 Ri 的叶绿素含量存在显著差
异。由图 5 可见，无胁迫处理的 Ri 与 WT 的叶绿素含量近似，而 OL5、OL6 的叶绿素含量高于 WT。
10% PEG 胁迫 7 d，过表达转基因株系的叶绿素含量仍然明显高于对照，而干扰表达转基因株系显
著低于对照。10% PEG 胁迫下，各株系叶绿素含量都有不同程度的降低，其中 Ri 株系降低幅度最
大，降低了 62.3%，OL5 与对照 WT 的降低幅度近似，约为 10%，OL6 降低 13.2%。这说明 Ri 转基
8 期 黄人卉等：大白菜耐旱相关基因 BpNFYA5 的克隆及功能初步分析 1507

因株对 10%的 PEG 胁迫较敏感，BpNFYA 可能参与叶绿素合成有关的逆境胁迫调控；同时由于对照
材料叶绿素含量在无或有胁迫处理条件下差异不明显，提示 10%的PEG胁迫尚不能区分WT与OL5、
OL6 在胁迫耐受程度上的差异。

图 5 转基因株系和野生型拟南芥叶绿素含量
WT：野生型；OL5、OL6：过表达转基因株系 5、6；Ri：干扰转基因株系。
*和**分别表示 t 检验转基因株系和 WT 差异显著性在 P < 0.05 和 P < 0.01 水平上。
Fig. 5 Chlorophyll content of wild-type and transgenic Arabidopsis
WT：Wild-type；OL5，OL6：Over-expression transgenic line 5 and 6；Ri：RNA interference transgenic line.
* and ** designate a significant difference between transgenic lines and wild-type plants at
P < 0.05 and P < 0.01 levels，respectively，based on t test.


2.4.2 脯氨酸含量
脯氨酸作为最重要和有效的细胞渗透势调节物质，常作为鉴定植物抗旱性的指标之一。大量试
验证明：水分胁迫越强，植物脯氨酸含量越高，抗旱性强的品种往往积累更多的脯氨酸（李君 等，
2007）。本试验结果显示，正常条件下野生型和不同转基因材料间的脯氨酸含量没有明显差异，10%
PEG6000 处理条件下各株系脯氨酸含量迅速升高, 但过表达转基因株系 OL5、OL6 升高更快（图 6），
处理 5 d 时是对照的 8 ~ 10 倍。Ri 转基因材料在 PEG 处理 5 d 时，其体内脯氨酸含量虽有上升，但
绝对值及变化量都显著小于对照野生型材料。可见 BpNFYA5 在干旱胁迫环境下能促进脯氨酸的积
累，过表达植株具有更强耐旱性。

图 6 未处理和 10% PEG 处理的拟南芥叶片脯氨酸含量
*和**分别表示与 WT 差异显著水平为 P < 0.05 和 P < 0.01。
Fig. 6 Proline content in leaves of Arabidopsis with or without 10% PEG treatment
* and ** designate a significant difference between transgenic lines and wild-type plants at
P < 0.05 and P < 0.01 levels，respectively，based on t test.
1508 园 艺 学 报 39 卷
2.4.3 叶片失水速率
在含有 10% PEG 的液体 MS 培养基中培养的 Ri 植株在胁迫 6 d 时开始出现叶卷曲现象，WT 在
胁迫一周时叶片出现卷曲，而过表达株 OL5、OL6 在胁迫第 10 天开始出现叶卷曲，且相较于 WT
和 Ri 普遍具有较强根系。OL5、OL6 较 WT 和 Ri 耐旱性更强，亏水两周后 OL6 和 OL5 仍然有部
分存活，而 WT 和 Ri 全部死亡（图 7）。由此可见在干旱胁迫下，OL5、OL6 具有更强的抗旱性。


图 7 干旱胁迫前（上）、后（下，2 周）转基因和野生型拟南芥生长和存活情况
Fig. 7 The growth and survival of transgenic and wild-type Arabidopsis under drought stress

离体叶片失水率测定表明：OL5、OL6 比 WT 和 Ri 失水速率慢（图 8），60 min 后株系 OL6 失
水率较 WT 和 Ri 有显著差异。这表明 OL-BpNFYA5 株系保水能力增强。



图 8 转基因和野生型拟南芥离体叶片失水率比较
Fig. 8 The rate of water loss from detached leaves of transgenic
and wild-type Arabidopsis plants
8 期 黄人卉等：大白菜耐旱相关基因 BpNFYA5 的克隆及功能初步分析 1509

2.4.4 气孔密度、净光合速率、蒸腾速率和水分有效利用率
本试验观察统计结果显示，各材料的气孔形态基本一致，密度差异不显著。
光合速率和蒸腾速率测定结果显示，部分转基因株系与对照无显著差异。株系 OL5、OL6 较
WT 和 Ri 的蒸腾速率显著降低，净光合速率显著增强，Ri 较 WT 差异不显著。OL5 和 OL6 的叶片
水分有效利用率较 WT 提高约 1.4 倍，较 Ri 提高约 1.6 倍。由此推测 BpNFYA5 过表达的拟南芥对干
旱的耐受性更强，可能更加适应干旱环境。
3 讨论
植物的抗旱性是多基因协同作用的结果，仅仅通过导入或改良单个抗旱功能基因来提高干旱抗
性往往很难实现。本试验中研究的 BpNFYA5 是一个转录因子。转录因子可以调控下游多个功能基
因表达（Singh et al.，2002）。本试验结果显示 BpNFYA5 过表达的拟南芥抗旱性增强。因此通过改
良或导入一个抗旱调控相关转录因子使植株获得抗旱性更加切实可行。近年来，通过过表达转录因
子基因来提高植物抗旱性也在水稻、烟草等植物中都得到证实（Kim & Kim，2009；Zhang et al.，
2009；Zheng et al.，2009；Quan et al.，2010）。本研究结果与 Li 等（2008）研究表明过表达 NFYA5
基因可以增强拟南芥的抗旱性结果一致。与 BpNFYA5 相关的转录因子 NFYB1 也有报道其过表达的
拟南芥和玉米都表现出抗旱性增强（Nelson et al.，2007）。因此本试验克隆到的 BpNFYA5 的研究对
大白菜抗旱机制研究和大白菜抗旱种质创新具有重要意义。
拟南芥 At1g54160 的 3′UTR 存在与 miRNA 家族中 ASRP1815 互补的靶序列，而 ASRP1815 与
miR169 序列同源。Jones-Rhoades 和 Bartel（2004）指出 NFYA5 基因是 miR169 的靶基因之一。非
干旱胁迫条件下 miR169 与 NFYA5 结合抑制其表达；干旱胁迫下 miR169 表达受到抑制，NFYA5 表
达量增加，从而调控下游基因抵御干旱（Li et al.，2008）。通过序列分析发现在 BpNFYA5 的 3′UTR
区也存在 ASRP1815 互补的靶序列：TAGCCCAAGGATAACTTCC。这说明大白菜 BpNFYA5 很有可
能也受 miR169 调控。在拟南芥中发现 NFYA5 与多个下游抗旱抗逆基因表达相关。本试验只初步验
证了 BpNFYA5 在抗旱途径中可能具有重要作用，但是对于 BpNFYA5 在抗旱途径中的功能机制还不
清楚。对转 BpNFYA5 基因拟南芥的研究结果为后续试验指明了方向。

References
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《中国蔬菜品种志》
本书由中国农业科学院蔬菜花卉研究所主编，已于 2002 年 9 月出版发行。全书分上、下卷，1 ~ 6 章为上卷，
包括根菜类、白菜类、芥菜类、甘蓝类、绿叶菜类及葱蒜类，计 2 263 个品种，1 347 页；7 ~ 12 章为下卷，包括瓜
类、茄果类、豆类、薯芋类、水生蔬菜类和多年生蔬菜类，计 2 550 个品种，1 177 页。入志的品种中，地方品种占
90%以上，少量在全国栽培时间较长、种植面积较大的一代杂种也选入其中。本书较全面系统而又有重点地反映了
中国丰富的蔬菜品种资源概貌、研究成果及育种水平，可供蔬菜科研、教学、生产及种子公司、农业行政单位的人
员参考。本书出版后受到读者普遍好评，现尚有少量存书，特以优惠价格 490 元（上、下卷）提供给读者（原价 980
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购书者请通过邮局汇款至北京中关村南大街 12 号中国农科院蔬菜花卉所《园艺学报》编辑部，邮编 100081。