全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（7）：1243–1252 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–02–27；修回日期：2012–06–15
基金项目：国家‘863’计划项目（2007AA10Z182）；河北省自然科学基金项目（C2009000635，C2012204091）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gdu@hebau.edu.cn；Tel：0312-7528300）
花粉管通道法遗传转化核桃的研究
师校欣 1，杜国强 1,*，王晓蔓 1，裴 东 2
（1 河北农业大学园艺学院，河北保定 071001；2 中国林业科学研究院林业研究所，北京 100091）
摘 要：为了提高核桃花粉管通道法转化成功率，以‘清香’核桃（Juglans regia L.）为试材，研究
了外源 DNA 导入受体时间、DNA 浓度和导入方法对导入效率的影响。结果表明：外源 DNA 滴加处理的
适宜时间为授粉后 14 ~ 20 h；外源 DNA 注射处理的适宜时间为授粉后 24 h。综合考虑外源 DNA 浓度对
坐果率和 GUS 检测结果的影响，认为 350 ~ 500 µg · mL-1 DNA 适宜转化。采用切割柱头滴加、柱头直接
滴加和子房注射等 3 种导入外源 DNA 的方法均获得了转化成功的果实，其中以切割柱头滴加法获得的转
化果实率最高（36.4%），其次是柱头直接滴加法（20.7%），子房注射法因易造成机械损伤，坐果率最低
（10.9%）。
关键词：核桃；外源 DNA；花粉管通道；柱头滴加；转化效率
中图分类号：S 664.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）07-1243-10

Studies on Gene Transformation via Pollen Tube Pathway in Walnut
SHI Xiao-xin1，DU Guo-qiang1,*，WANG Xiao-man1，and PEI Dong2
（1College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China；2Research Institute of
Forestry，Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China）
Abstract：In order to enhance the efficiency of gene transformation via the pollen tube pathway，the
timing of DNA inoculation，the concentration of DNA，and the different methods of DNA inoculation
were studied in‘Qingxiang’walnut（Juglans regia L.）. The results showed that a period of 14 to 20
hours after pollination was the optimum time for the treatment of dripping exogenous DNA on the pistils.
And a period of 24 hours was suitable for the treatment of injection. A DNA concentration of 350–500
µg · mL-1 was optimal for gene transformation according to the fruit set rates and GUS analysis. The
fruits carrying the exogenous gene were obtained by using three methods of dripping DNA with or
without the pistil cut and of the ovule injection，while the dripping DNA without the pistil cut treatment
had the highest transformation rate（36.4%），followed by the dripping DNA with the pistil cut treatment
（20.7%）. The ovule injection treatment had the lowest fruit set rate（10.9%）due to mechanical damage
during injection.
Key words：Juglans regia；exogenous DNA；pollen tube pathway；dripping on pistil；efficiency of
transformation


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花粉管通道法是利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，使外源 DNA 沿着花粉管渗入，经珠
心通道，进入胚囊，以达到遗传转化之目的。周光宇等（1979）在分析植物远源杂交成功经验的基
础上，论证了 DNA 片段杂交假设的可能性，并首次用花粉管通道法成功培育出抗枯萎病的棉花栽
培品种。自 Luo 和 Wu（1988）用该方法转化水稻，得到分子水平验证后，相继在小麦（刘根齐 等，
1994）、玉米（丁群星 等，1993）、大豆（雷勃钧 等，2000）等多种作物以及黄瓜、西瓜、甘蓝、
茄子、番茄等蔬菜品种上（张广平和邹学校，2007）也取得了成功。因花粉管通道法操作简便易行，
直接获得转基因种子；变异性状在受体植株中稳定遗传，缩短育种时间；不需组织培养和植株再生
的漫长过程；可在任何开花植物和不同物种之间实现基因的转移，已成为国内外生物技术育种的重
要手段（张广平和邹学校，2007；李志亮 等，2010），中国大面积种植的转基因抗虫棉就是用这种
方法育成的（倪万潮 等，1998；郭三堆 等，1999）。
随着转基因技术的迅速发展和在生产中的广泛应用，转基因作物的安全性越来越受到人们的重
视，筛选标记基因和载体骨架序列是影响转基因作物安全性评价的重要因素，基因枪和农杆菌介导
转化法目前难以解决这一问题，而花粉管通道法可用其它物种的植物 DNA 进行遗传转化，获得类
似远缘杂交的效果（周光宇 等，1988），无需构建表达载体，无需使用抗生素选择标记，生物安全
性更好（任海红 等，2010）。
核桃的体细胞胚胎发生为基因转化提供了良好的离体再生系统，1988 年起，McGranahan 等
（1988，1990）利用核桃体胚发生系统进行外源基因转移，获得了抗卡那霉素的转基因植株，成为
木本植物中第 1 个成功导入外源基因的树种，后来又进一步提高了转化效率。汤浩茹等（2001）通
过根癌农杆菌介导法，将哈兹木霉几丁质酶基因（ThEn-42）导入核桃体细胞胚，获得了遗传转化的
核桃植株，并检测证实转化的体细胞胚系的几丁质酶活性比对照高几十至几千倍。
在果树基因转化中，花粉管通道法的相关研究少有报道，仅限于初步尝试。张玲（2004）将外
源 DNA 片段溶液滴入杏花粉管，观察了杂交和外源 DNA 对杏坐果率和果实发育的影响；侯立群等
（2004）利用花粉管通道法转化核桃，比较了几种方法的坐果率，获得了畸形果，未对后代实生植
株进行鉴定。核桃具孤雌生殖特性（郗荣庭和张毅萍，1996），不需杂交即可获得遗传稳定的实生后
代，利用花粉管通道进行基因转化获得的果实种子，既可保持原有品种的特性，又可定向改良某一
性状，因此更具优势。
花粉管通道法通常包括柱头滴加法和子房注射法，由于不同植物的花器构造、大小以及开花授
粉时间不同，掌握好外源 DNA 导入受体的时间和方法非常关键。本试验中利用花粉管通道法将外
源 DNA 导入核桃，研究外源 DNA 导入受体的适宜时间，DNA 浓度和导入方法，以提高转化成功
率，为该方法在核桃遗传改良中的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2008—2009 年在河北农业大学校内实验基地完成。试材为 12 年生‘清香’核桃（Juglans
regia L.）树。
转化用农杆菌菌株为 AGL1（质粒载体：pWBVec10a），以 CaMV35S 为启动子，包含具有抗寒
性状的 CBF 基因、hpt（潮霉素磷酸转移酶基因）筛选基因和 GUS 标记基因（图 1），由美国 Oregon
State University 的 Tony Chen 教授馈赠。
7 期 师校欣等：花粉管通道法遗传转化核桃的研究 1245


图 1 CBF 质粒结构图
Fig. 1 Plasmid structure diagram of CBF gene

1.2 试验设计与方法
1.2.1 花粉管萌发情况的观察
采集尚未开放的核桃雄花花序，室内晾干后收集花粉备用。雌花刚显露时将雌花连同下面 3 ~ 4
片复叶套袋隔离，待柱头成倒八字形并分泌出较多黏液状物时进行人工授粉。分别于授粉后 2、4、
6、8、12、16、20、24、28、32、36、40 和 48 h 各采集 10 朵雌花，FAA 固定 24 h，用 2 mol · L-1 NaOH
于 55 ℃水浴中保温软化 1 h，25 ℃下苯胺蓝染色 2 h，轻压制片，荧光显微镜下观察。
1.2.2 质粒 DNA 制备
将携带 CBF 质粒载体的农杆菌菌株 AGL1 分别在 YEP + Carb（羧苄青霉素）100 mg · L-1 + Spec
（壮观霉素）75 mg · L-1 的固体、液体培养基中平板活化及悬浮培养，悬浮液 OD600 值为 0.5 ~ 0.8
时采用碱裂解法提取质粒 DNA，经岛津 UV-265 紫外检测和琼脂糖凝胶电泳进行纯度和片段大小分
析，用 0.1% TE 溶液稀释为 0、200、350、500、650 和 800 µg · mL-1 浓度进行花粉管 DNA 导入。
1.2.3 花粉管通道法导入外源 DNA
授粉 30 ~ 40 h 后，以只进行人工授粉，不做任何处理为对照，用微量注射器吸取不同浓度的质
粒 DNA 溶液，分别采用 3 种方法导入。（1）横切花柱，向花柱断面滴加外源 DNA；（2）向柱头上
直接滴加外源 DNA；（3）通过医用微量进样器针头插入子房，注射外源 DNA。每朵花施加 5 ~ 10 µL。
1.2.4 子房注射处理对核桃果实损伤的观察
采集注射 2 d 后的核桃雌花于 FAA 固定液中固定，酒精系列脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切
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片，铁矾苏木精染色，显微镜观察子房注射法转化外源 DNA 处理后子房内部受损情况。
1.2.5 转基因后代鉴定
外源基因导入后分别调查不同处理的坐果率。将转化果实与非转化果实进行种胚离体培养，成
苗后接种在附加潮霉素（Hyg）20 mg · L-1 的 DKW + 6-BA 1.0 mg · L-1 + ZT 1.0 mg · L-1 + IBA 0.02
mg · L-1 + 蔗糖 35 g · L-1 + 琼脂 6.0 g · L-1 继代培养基上进行抗性筛选；切取转化果实胚组织经
X-Gluc 染色液染色，进行 GUS 稳定表达检测；并参照张虎平等（2003）的方法分别提取潮霉素抗
性植株和对照植株 DNA，进行 PCR 和 Southern 杂交检测。Southern 杂交检测利用地高辛标记探针，
试剂盒购自 Roche 公司，DNase 反转录酶和 RNA 酶抑制剂购自 Promega 公司。仪器型号为美国
BIO-RAD 公司的 MyCyclerTM PCR 仪、Universal Hood II 凝胶成像系统仪。
2 结果与分析
2.1 核桃花粉管通道法基因转化适宜转化时间的确定
用荧光显微镜观察发现，核桃人工授粉后，2 h 时花粉粒开始在柱头上萌发，4 h 后形成花粉管
并伸长；6 h 后花粉管生长整齐；多数花粉管在 8 ~ 12 h 已达花柱 1/2 处；14 ~ 20 h 到达花柱基部；
20 ~ 22 h 穿过花柱组织接近子房，24 h 后进入子房；32 ~ 48 h 已从珠孔进入胚珠内部（图 2）。
图 2 核桃花粉管在子房中的生长动态
A. 花粉粒在柱头萌发（授粉后 2 h）；B. 花粉管形成并伸长（授粉后 4 h）；C. 多数花粉管到达花柱 1/2 处（授粉后 12 h）；
D. 花粉管到达花柱基部（授粉后 18 h）；E. 花粉管进入子房（授粉后 24 h）；F. 花粉管由珠孔进入胚珠内部（授粉后 40 h）。
Fig. 2 Growth status of pollen tubes in ovary in walnut
A. Pollen germinated on stigma（2 h after pollination）；B. Pollen tube formatted and elongating（4 h after pollination）；
C. Most of the pollen tubes on half way of styles（12 h after pollination）；D. Pollen tubes reached the end of styles（18 h after pollination）；
E. Pollen tubes entered ovary（24 h after pollination）；F. Pollen tubes entered ovule through micropyle（40 h after pollination）.
7 期 师校欣等：花粉管通道法遗传转化核桃的研究 1247

根据核桃雌花外部形态特征和显微镜观察结果，DNA 滴加处理的适宜时间为授粉后 14 ~ 20 h，
这个时间段花粉管通道打开，适于外源 DNA 的导入；DNA 注射处理的时间宜为授粉后 24 h，此时
花粉管进入子房内部。
2.2 质粒 DNA 浓度对核桃坐果率和 GUS 表达的影响
以柱头直接滴加法进行不同浓度的外源 DNA 导入。结果表明：柱头滴加 TE 溶液或滴加质粒
DNA 溶液后容易导致部分子房在发育过程中逐渐变褐、枯萎直至脱落，与只授粉的对照相比坐果率
明显降低。不同浓度的质粒 DNA 影响程度不同，DNA 浓度在 200 ~ 500 µg · mL-1 范围内坐果率差
异不显著，达到或超过 650 µg · mL-1，坐果率显著降低（表 1）。
通过检测 GUS 活性可了解 GUS 是否转化进入植物细胞以及 GUS 在植物组织、细胞内的表达部
位等。将转化果实的胚组织在 37 ℃恒温下经 X-Gluc 染色，部分胚组织呈现蓝色阳性反应，而未转
化的果实表现 GUS 阴性反应（图 3），表明 GUS 可在转化核桃果实中得到表达。从表 1 看出，DNA
浓度较高和较低时，GUS 的表达率均较低，DNA 溶液浓度在 350 ~ 650 µg · mL-1 时 GUS 表达率可
达 11.8% ~ 19.5%。
表 1 质粒 DNA 浓度对核桃坐果率及转化效率的影响
Table 1 Effects of concentration of plasmid DNA on fruit set rates and transformation frequency in walnut
DNA 浓度/（µg · mL-1）
DNA concentration
花朵数
Number of
flowers
果实数
Number of
fruits
GUS+子叶数
Number of cotyledons
with GUS+
坐果率/%
Fruit set rate
GUS 阳性反应/%
GUS+
不处理（对照）None （Control） 164 131 0 79.8 a 0 c
0（水 Water） 163 90 0 55.0 b 0 c
200 130 40 3 30.7 c 7.3 b
350 185 62 11 33.3 c 17.7 a
500 165 41 8 24.8 cd 19.5 a
650 160 17 2 14.0 de 11.8 ab
800 158 13 1 10.6 e 7.7 b
2.3 DNA 导入方法对坐果率和 GUS 表达的影响
分别采用切割花柱滴加、柱头直接滴加以及子房注射 3 种方法导入 500 µg · mL-1 的 DNA 溶液，
统计坐果率，并对转化果实进行 GUS 检测（表 2，图 4）。结果表明，3 种方法均对坐果率有一定的
影响，柱头直接滴加法的坐果率为 34.0%，比对照下降了 57.4%；切去柱头后滴加 DNA 的处理出现
子房萎蔫、脱落的时间提早，坐果率为 21.4%，比对照下降了 73.2%；子房注射法的坐果率最低，
为 10.9%。说明切除柱头后滴加 DNA 与子房注射两种方法都对花器官造成不同程度的机械损伤，胚
珠内受精不良导致花器官脱落。不同 DNA 导入方法获得的转化果实中以切去柱头后滴加 DNA 的处
理 GUS 阳性反应频率最高，柱头直接滴加和子房注射法差异不显著。

表 2 质粒 DNA 导入方法对核桃坐果率及转化效率的影响
Table 2 Effects of DNA transformation methods on fruit set rates and transformation frequency in walnut
DNA 导入方法
Methods of DNA
transformation
花朵数
Number of
flowers
果实数
Number of
fruits
GUS+子叶数
Number of cotyledons
with GUS+
坐果率/%
Fruit set rate
GUS 阳性反应频率/%
GUS+ frequency
柱头直接滴加
Dripping without pistil cut
156 53 11 34.0 b 20.7 b
切割柱头滴加
Dripping with pistil cut
152 33 12 21.4 c 36.4 a
子房注射
Ovary injection
172 19 2 10.9 d 10.5 b
对照 Control 164 131 0 79.8 a 0 c

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图 3 核桃转化果实胚组织 GUS 检测
1. 对照胚组织；2 ~ 6. GUS 阳性反应胚组织；7、8. GUS 阴性反应胚组织。
Fig. 3 Expression of GUS gene in embryo of transgenic lines in walnut
1. Control；2–6. Transgenic lines with GUS positive；7，8. Transgenic lines with GUS negative.


图 4 外源 DNA 溶液导入方法对子房发育的影响
A. 切割柱头滴加；B. 柱头直接滴加；C. 子房注射；D. 注射后正常膨大子房；E. 滴加后萎蔫子房；F. 注射后萎蔫子房。
Fig. 4 DNA transformation methods applied in this experiment and their effects on ovary development
A. Dripping with pistil cut；B. Dripping on pistil；C. Ovary injection；D. Ovary development normally after DNA injection；
E. Ovary wilting after DNA dripping；F. Ovary wilting after DNA injection.

2.4 子房注射法的机械损伤观察
子房注射法即通过子房注射直接将外源DNA带到处于活跃状态的卵细胞附近来实现基因转化，
在实际操作过程中，由于注射的盲目性很大，容易造成注射深度不够而达不到胚珠部位，注射部位
接近胚珠但位置偏移和注射过深穿透子房等情况（图 5），从而影响坐果率及转化率（表 2）。

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图 5 子房注射对子房造成的机械损伤
A. 注射太浅而未达胚珠；B. 注射部位接近胚珠；C. 注射位置偏移；D. 注射穿透胚珠。
Fig. 5 Location of the injecting and mechanical damage of ovary by injection
A. Injected too shallow without reaching ovule；B. Injection closed to ovule；
C. Injection deviated from ovule；D. Injection penetrated through ovule.

2.5 花粉管通道法核桃基因转化植株的获得
采收经遗传转化和对照的核桃果实，剥取种胚，切去下胚轴接种，进行离体培养，成苗后进行
潮霉素抗性筛选，在添加 20 mg · mL-1 Hyg 的继代培养基上，非转化株褐化死亡，17 株转化株系分
化生长正常，具有潮霉素抗性（图 6）。



图 6 转基因核桃果实种胚培养及潮霉素抗性筛选
A. 剥取种胚接种；B. 种胚接种 20 d 分化；C. 转化株系 Hyg 抗性筛选。
Fig. 6 Embryo culture of transgenic lines and screening for Hyg resistant ones in walnut
A. Embryo inoculation；B. Embryo growth status at 20 days after inoculation；
C. Screening for Hyg resistant lines.

对具有潮霉素抗性的株系继代增殖培养，从组培苗幼嫩叶片提取基因组 DNA 作模板，以质粒
DNA 作阳性对照，以非转化的核桃种胚培养植株作阴性对照，进行 PCR 和 Southern 杂交分析。电
泳结果如图 7 和图 8 所示：具有 Hyg 抗性的部分株系中，扩增出的特异条带与质粒 DNA 扩增出的
特异条带一致，非转化株未扩增出任何条带，表明经花粉管通道法已将外源 CBF 整合到核桃基因组
中。
1250 园 艺 学 报 39 卷
图 8 核桃转基因植株的 Southern 杂交分析
1. 质粒；2. 未转化植株；
3、4. 转基因植株。
Fig. 8 Southern blot of transgenic lines in walnut
1. Plasmid；2. Non-transgenic plant；
3，4. Transgenic lines.







3 讨论
花粉管通道法已成为植物遗传转化的重要手段，确定导入的准确时期和适宜方法是提高转化成
功率的关键。从胚胎学研究的角度来看，外源 DNA 导入的最适宜时期应限定在精卵融合至合子分
裂前这段时间（王艳杰和申家恒，2006）。具体技术操作以花粉管延伸到胚珠时开始授粉为宜，若导
入过晚，花粉管通道老化，变得收缩和干瘪，且胚胎已形成，珠心组织呈封闭状态，外源 DNA 很
难进入；若导入过早，花粉管还未伸长或未到达胚珠，DNA 溶液中的水分蒸发会大大降低转化效率
（张庆祝和韩天富，2004）。本试验中通过荧光显微观察，‘清香’核桃授粉 14 ~ 20 h 后花粉管通道
已打开，为利用花粉管通道法导入外源 DNA 的适宜时期。
根据小麦受精过程的细胞形态学分析，曾君祉等（1998）推测，当花粉管在花柱内向胚囊伸长
时，花柱被横向切断，滴加在断口上的外源 DNA 可以被断面上的任何细胞吸收，其中也有花粉管，
如果含外源 DNA 的花粉管进入胚囊并参加受精，基因转化就可能发生。基于外源 DNA 是依托花粉
管的外界面进入到胚囊里（邓德旺 等，1999），王艳杰和申家恒（2006）认为导入的部位应该是离
胚囊愈近愈有利。由于花粉管在花柱中生长较为集中，通过花柱基部之后，花粉管便分散朝向子房
腔里的胚珠方向延伸，所以最适的外源 DNA 导入部位也是从花柱基部进行横切，在其切面上滴加
外源 DNA 溶液。Cheung 等（1995）研究，切去百合花柱后授粉，花粉管进入胚珠的几率很低。若
在子房上留下一段花柱，则明显提高花粉管进入胚珠的百分率，说明花粉管与花柱的相互作用促进
花粉管伸长并进入胚珠。本试验结果表明核桃花粉管导入时切除柱头滴加 DNA 的处理出现子房枯
萎，脱落情况早于未切割花柱的处理，结实率偏低。这可能是由于核桃花期温度高，空气干燥，风
大，花柱形成断面后加速水分蒸发，导致器官的枯萎及脱落。为了有效利用切除柱头缩短 DNA 溶
液导入部位与胚囊距离和花粉管与花柱能够互相作用促进花粉管伸长优势，同时减少切口断面水分
蒸发影响，结合核桃雌蕊结构及花粉管生长途径，作者认为应用柱头切除滴加法时，柱头切除时机
为关键因素之一，一般不宜过早，可在授粉后 14 ~ 20 h 进行，切去柱头后立即滴加外源 DNA 溶液。
图 7 核桃转基因植株的 PCR 分析
1. 2 000 bp DNA；2. 质粒；
3 ~ 7. 转基因植株；8. 未转化植株。
Fig. 7 PCR assay of transgenic lines in walnut
1. 2 000 bp DNA ladder marker；2. Plasmid；
3–7. Transgenic lines；8. Non-transgenic plant.
7 期 师校欣等：花粉管通道法遗传转化核桃的研究 1251

为使切面保持一定湿度可重复滴加 1 次，但是否能提高结实率需进一步试验验证。
核桃具孤雌生殖特性，不需杂交即可获得遗传稳定的实生后代，利用子房注射法进行基因转化
获得的果实种子，既可保持原有品种的特性，又可定向改良某一性状，具有很好的应用前景。通过
田间结果调查和石蜡切片观察，发现核桃多数子房在注射 DNA 后子房受损，为坐果率下降的主要
原因。采用直径较小的注射针头和掌握适宜的注射位置可减少子房受损几率。一般认为，外源 DNA
溶液运行动力可能来源于外源 DNA 滴加处与胚囊之间溶液的浓度差，从而使外源 DNA 溶液沿花粉
管外表面向胚囊渗入成为可能。因此可采用稍偏离子房注射方式，将 DNA 溶液注射到胚珠附近，
使其渗入胚囊，减小对胚囊的伤害。另外，导入的操作过程中基本在大田中进行，子房注射和切割
花柱除造成人为的机械损伤外，消毒条件也无法保障，在一定程度上影响坐果率。

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