全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（8）：1521–1530 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–03–02；修回日期：2012–06–18
基金项目：国家自然科学基金项目（30972023）；中国博士后科学基金项目（20090451280）；辽宁省重点实验室项目（LS2010148）
* E-mail：hmbh@sina.com
百合鳞茎淀粉磷酸化酶分离纯化及酶学性质研
究
孙红梅*，周兰娟，王文娟，袁思施，王春夏
（沈阳农业大学园艺学院，设施园艺省部共建教育部重点实验室/辽宁省设施园艺重点实验室，沈阳 110866）
摘 要：从兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）鳞茎中分离纯化淀粉磷酸化酶（Starch Phosphorylase，
SP）并研究其酶学性质。结果表明：选用 30% ~ 60%硫酸铵分级沉淀，SP 纯化倍数为 14.78，回收率为
23%，纯化的 SP 亚基分子量约 62.5 kD；SP 的最适反应体系缓冲液为 pH 5.0 的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液，
最适反应温度为 30 ℃，且体系中不适合加入酚类抑制剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；SP 不耐强酸，在中性
和弱碱性条件下活性稳定，pH < 5 时活性较弱；在合成方向上，SP 对葡萄糖–1–磷酸（G-1-P）的 Km
值为 2.84 mmol · L-1；1 mmol · L-1 Mg2+、Ca2+对 SP 活性有极显著的促进作用，K+、Zn2+也有一定的促进
作用；大部分离子在高浓度（> 10 mmol · L-1）下抑制 SP 活性，但 Na+随着浓度的升高，对 SP 活性的促
进作用增强；10 mmol · L-1 的抗坏血酸可将 SP 活性提高 30%。
关键词：百合；兰州百合；鳞茎；淀粉磷酸化酶；纯化；酶学性质
中图分类号：S 682.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）08-1521-10

Research on Starch Phosphorylase Purification and Enzymatic Properties
in Bulbs of Lilium
SUN Hong-mei*，ZHOU Lan-juan，WANG Wen-juan，YUAN Si-shi，and WANG Chun-xia
（Key Laboratory of Protected Horticulture，Ministry of Education/Key Laboratory of Protected Horticulture of Liaoning
Province，College of Horticulture，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）
Abstract：Starch phosphorylase（SP）in bulbs of Lilium davidii var. unicolor was purified and its
enzymatic properties were studied. The results indicated that SP activity was improved 14.78 fold by 30%–
60% ammonium sulfate fractionation with a final yield of 23% and a subunit of 62.5 kD. The optimal
reaction buffer and temperature were citric acid-sodium citrate buffer（pH 5.0）and 30 ℃，respectively.
However，SP was sensible to strong acid and it was not suitable for adding phenolic inhibitors（PVP）to the
reaction system. The activity was stable under neutral and alkaline conditions，while decreased under pH <
5. In the synthetic direction，Km value for G-1-P was 2.84 mmol · L-1. Furthermore，1 mmol · L-1 Mg2+ and
Ca2+ promoted SP activity significantly，K+ and Zn2+ also played a promoting role. Most ions with high
concentration（> 10 mmol · L-1）could inhibit SP activity，whereas Na+ enhanced the activity with its
concentration increasing. Besides，the enzyme activity increased by 30% while adding 10 mmol · L-1 ascorbic


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acid to the reaction system.
Key words：lily；Lilium davidii var. unicolor；bulb；starch phosphorylase；purify；enzymatic properties

淀粉是百合鳞茎中碳水化合物的重要贮藏形态（Shin et al.，2002），其含量是衡量种球成熟度
和贮藏品质、决定鳞茎发育进程的重要指标之一。淀粉磷酸化酶（Pho，SP，α-glucan phosphorylase，
EC 2.4.1.1）是参与淀粉代谢的重要酶之一，其功能是将长链淀粉中的 α–1,4–糖苷键磷酸解，产物
为葡萄糖–1–磷酸（G-1-P）（武维华，2005）。Tickle 等（2009）的研究表明，SP 亦可催化 G-1-P
逆向合成淀粉。因此，分离纯化 SP 并探讨其酶学性质，对于百合鳞茎淀粉代谢机制研究具有重要
意义。Mingo-Castel 等（1976）从马铃薯中成功得到纯化的 SP，此后 Hsu 等（2004）、辛红宝和郝
东云（2009）相继纯化得到水稻和玉米胚乳中的 SP 并对其酶学性质进行了研究。随后，研究者就
烟草、玉米和山药等作物在不同环境或发育时期 SP 活性的变化规律进行研究，从而探讨其生理功
能（谷岩 等，2010），包括胁迫生理（李洪勋和王怀珠，2008）、休眠生理（朱海旺和霍秀文，2011）
以及果实发育和品质等（Schupp & Ziegler，2004；王园 等，2010）。此外，研究人员先后阐明了 SP
的结构特点和蛋白质水解对其催化作用的调控（Chen et al.，2002；Young et al.，2006），并从甘薯
和玉米造粉体基质中获得 SP 的基因序列及氨基酸组成，指出玉米 SP 的氨基酸序列与马铃薯块茎有
很高的同源性（Lin et al.，1991；Ying et al.，2001）。水稻中关于 SP 的研究较为深入，已分析了 SP
基因的表达特性，并通过转基因技术将其导入植株体内，从而改良稻米品质（袁亚芳和刘巧泉，2007）。
目前，国内外有关百合中 SP 的研究主要集中在植株不同生长期和低温解除休眠过程中酶活性的变
化上（Addai，2010），而百合鳞茎中 SP 的酶学性质及其作用机制的系统研究较少，SP 的基因序列
也未见报道。作者在前期试验中确定了兰州百合鳞茎内 SP 的最佳提取和测定条件（孙红梅 等，
2009），但并未对其进行纯化和酶学性质的系统研究。本试验以兰州百合鳞茎为试材，在对 SP 进行
提取、纯化和鉴定的基础上，探索其酶学性质，以期为从蛋白质水平揭示淀粉代谢机理，培育优质
百合种球奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）的种球，质量为（25 ± 1）g。试材于 2008
年 4 月栽种于沈阳农业大学园艺研究基地，常规管理。10 月采收鳞片抱合紧密、无病虫害、鳞茎盘
无损伤的鳞茎，去除地上部，由外向内取鳞茎的第 2 ~ 3 层鳞片，用蒸馏水洗净，液氮速冻后于–80 ℃
保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 硫酸铵分级沉淀
将粗酶液配制成饱和度为 10% ~ 90%的硫酸铵饱和溶液，每隔 10%为一个样点。4 ℃静置 1 h，
4 000 r · min-1 离心 20 min，分别收集上清液和沉淀，测定 SP 活性和蛋白质含量（孙红梅 等，2009）。
1.2.2 双水相法纯化
取一定量的聚乙二醇（PEG）溶液，按比例加入葡聚糖溶液，配制成不同质量分数比的 PEG/
葡聚糖双水相混合体系。按比例取适量酶液，与体系混合，4 000 r · min-1 离心 5 min，分别测定上、
下相中酶活力，计算 PEG、葡聚糖在系统中的质量百分浓度和 SP 分配系数 K。
8 期 孙红梅等：百合鳞茎淀粉磷酸化酶分离纯化及酶学性质研究 1523

用硫酸铵代替葡聚糖作为成相物质，比较不同成相物质对 K 值的影响；向该体系中加入不同浓
度的 NaCl，比较其对 K 值的影响。
1.2.3 离子交换条件的确定
层析缓冲液：配制 pH 5.0、5.5、6.0 和 6.5 的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液（0.1 mol · L-1），以及 pH
7.0、7.5、8.0、8.5 和 9.0 的 Tris-HCl 缓冲液（0.05 mol · L-1）。称取 9 份 1.0 g 的柱层析材料——阴
离子交换树脂 DEAE-Sepharose CL-6B，分别加入 1.0 mL 不同 pH 的缓冲液和 0.4 mL 浓缩酶液。
缓冲液中 NaCl 含量：称取 10 份 1.0 g 的 DEAE-Sepharose CL-6B，分别加入含 0.05 ~ 0.50 mol · L-1
NaCl 的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液 1.0 mL（每隔 0.05 mol · L-1 为一个样点）和 0.4 mL 浓缩酶液。
层析上样量：称取 10 份 1.0 g 的 DEAE-Sepharose CL-6B，各加入 1.0 mL pH 8.0 的 Tris-HCl 缓
冲液和 0.02 ~ 0.50 mL 浓缩酶液，每隔 0.04 mL 为一个样点。
系统稳定后，均测定上清液中 SP 活性和蛋白质含量。
1.2.4 DEAE-Sepharose CL-6B 层析及鉴定
选用 pH 8.0 的 Tris-HCl（0.05 mol · L-1）作为层析体系的平衡缓冲液，系统 pH 稳定后上样 1 mL。
采用同样的缓冲液冲洗杂质，然后用含 0.2 mol · L-1 NaCl 的 pH 8.0 Tris-HCl 缓冲液进行线性洗脱，
流速为 0.5 mL · min-1，紫外检测仪检测。采用自动收集器收集，2 mL 为一管，并分别检测 SP 活性。
收集 SP 活性较高的部分。
纯化后采用 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定 SP 分子量，分离胶质量分数为 12%，
浓缩胶为 4%，以 pH 8.0 的 Tris-HCl 为电泳缓冲液。取 20 μL 酶液与 20 μL 样品缓冲液（含 SDS、
巯基乙醇、甘油和溴酚蓝）混合后沸水浴 3 ~ 5 min，冷却后点样。以浓缩胶中 100 V，分离胶中 140
V 稳压进行电泳。
1.2.5 酶学性质研究
矿质元素和 SP 反应动力学：纯化后的 SP 酶液经反应体系（含柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液、G-1-P
和可溶性淀粉）缓冲液透析后，分别加入 1、10、20、50 mmol · L-1 的 Mg2+、K+、Na+、Ca2+、Zn2+
和 1、10 mmol · L-1 的 Ba2+、Co2+、Mn2+、Fe2+、Gu2+等矿质离子进行反应；同时以不加金属离子的
酶反应体系作为对照。以 G-1-P 为底物，在 0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 和 5.0 mmol · L-1 不同底物
浓度下测定 SP 活性。以 Lineweaver-Burk 法（双倒数作图法）求 Km 值。
最佳pH和反应温度：选用柠檬酸—柠檬酸钠和Tris-HCl缓冲液分别将酶液配制成pH为4.0 ~ 9.0
的溶液，每隔 0.5 为一个样点；设置反应温度为 20、30、40、50 和 60 ℃。
抗氧化剂和蛋白保护剂：酶反应体系中分别加入 1、10、25 和 50 mmol · L-1 的抗坏血酸或 0.1、
0.25 和 0.5 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP），以不加抗坏血酸或 PVP 的一组为对照。
2 结果与分析
2.1 SP 的初步纯化结果
2.1.1 分段盐析范围的确定
如图 1 所示，(NH4)2SO4 饱和度为 0 ~ 60%时，上清液中蛋白质含量一直维持在较高水平；40%
时目的蛋白开始发生沉降，而总蛋白还有较高溶解度。综合目的蛋白得率和纯化倍数两种因素考虑，
当(NH4)2SO4 饱和度 30% ~ 60%时，目的蛋白得率接近 50%，且纯化倍数较大，故以此作为体系的
盐析范围。


1524 园 艺 学 报 39 卷
















图 1 硫酸铵饱和度对 SP 活性及蛋白质溶解度的影响
Fig. 1 Effects of (NH4)2SO4 saturation on SP activity and protein solubility

2.1.2 双水相萃取结果
在 PEG/葡聚糖双水相体系中，SP 的分配系数 K 在 PEG 18%时最大（表 1），之后随 PEG 含量
的增加而减小，原因在于成相的 3 种物质——葡聚糖、PEG1000 和 H2O 中，PEG 是极性最小的一
种，随着浓度增加，上相的萃取相极性减小。控制 PEG 18%，当葡聚糖 8%时，K 值和纯化倍数均
达最大值（表 1）。

表 1 体系中 PEG 和葡聚糖浓度对分配系数的影响
Table 1 Effects of PEG and dextran concentration on the partition coefficient
PEG/%
分配系数 K
SP partition
coefficient
蛋白质/mg
Protein
content
比活性/
（U · mg-1）
Ratio activity
纯化倍数
Purification
fold

葡聚糖/%
Dextran
concentration
分配系数 K
SP partition
coefficient
蛋白质/mg
Protein
content
比活性/
（U · mg-1）
Ratio activity
纯化倍数
Purification
fold
10 不成相
No phase
4 0.39 21.68 0.19 0.61
16 0.81 21.38 0.32 0.80 6 8.63 20.14 0.67 2.10
18 4.72 22.67 0.56 1.38 8 8.84 19.50 0.69 2.17
20 2.16 21.25 0.49 1.22 10 4.72 22.58 0.55 1.73
22 1.75 20.48 0.47 1.18 12 1.30 20.27 0.55 1.32
24 0.89 18.93 0.38 0.94 14 0.98 19.76 0.38 1.18
26 0.60 16.23 0.35 0.88
30 不成相
No phase

粗酶液
Crude
enzyme
47.53 0.40 1 粗酶液
Crude
enzyme
47.35 0.32 1


在 PEG/(NH4)2SO4 双水相体系中，控制
PEG 18%，当(NH4)2SO4 浓度为 20%时，K 值
和纯化倍数均达最大（表 2）。继而控制
(NH4)2SO4 20%，当 PEG 29%时，K 值和 SP 纯
化倍数均达最大（表 2）。此条件下，加入的
NaCl 质量分数为 0.008%时，SP 活性最大（图
2）。综上可知，在PEG/葡聚糖和PEG/(NH4)2SO4 图 2 NaCl 浓度对双水相系统中分配系数的影响
Fig. 2 Effects of NaCl concentration on the partition coefficient
8 期 孙红梅等：百合鳞茎淀粉磷酸化酶分离纯化及酶学性质研究 1525

双水相系统中应分别使 PEG、葡聚糖含量为 18%和 8%；PEG1000、(NH4)2SO4 分别为 29%和 20%，
且后者加入 0.008% NaCl 较适。

表 2 体系中(NH4)2SO4 和 PEG 浓度对分配系数的影响
Table 2 Effects of (NH4)2SO4 and PEG concentration on the partition coefficient
(NH4)2SO4/%
分配系数 K
SP partition
coefficient
蛋白质
含量/mg
Protein
content
比活性/
（U · mg-1）
Ratio
activity
纯化
倍数
Purifi-
cation
fold
PEG/%
分配系数 K
SP partition
coefficient
蛋白质
含量/mg
Protein
content
比活性/
（U · mg-1）
Ratio
activity
纯化
倍数
Purifica-
tion fold
16 不成相
No phase
24 0.91 20.01 0.19 1.52
17 0.91 14.62 0.26 0.78 25 1.09 19.88 0.21 1.67
18 1.55 18.09 0.27 0.80 26 1.56 18.86 0.26 2.06
19 1.55 19.50 0.25 0.74 27 1.33 25.27 0.17 1.31
20 7.33 19.50 0.40 1.16 28 2.83 21.68 0.28 2.17
21 5.00 19.11 0.37 1.08 29 4.75 21.68 0.31 2.43
22 2.67 18.22 0.31 0.91 30 2.28 21.30 0.26 2.08
粗酶液
Crude
enzyme
12.44 0.34 1 粗酶液
Crude
enzyme
16.68 0.12 1

2.2 SP 的分离纯化及鉴定
2.2.1 离子交换条件的确定
由图 3，A 可知，应选用 pH 8.0 的 Tris-HCl 作为层析的平衡缓冲液，原因在于此时 SP 活性最
低，DEAE-Sepharose CL-6B 对 SP 的结合能力最强，而对总蛋白的结合能力较差。
层析缓冲液中 NaCl 浓度达 0.20 mol · L-1 时，SP 活性已有较大值，但总蛋白含量并不高（图 3，
B）。


图 3 最适洗脱 pH、离子强度和上样量的确定
Fig. 3 Determination of the optimal elution pH，ionic strength and sample amount

1526 园 艺 学 报 39 卷
图 6 SP 催化 G-1-P 的 Lineweaver-Burk 图
Fig. 6 Lineweaver-Burk diagram of SP catalysis at G-1-P
酶液加入量为 0.4 mL 时上清液中 SP 活性约为加入总量的 10%，超过 90%的杂蛋白游离在上清
液中；0.5 mL 时体系中 SP 含量已超过试管中 DEAE-Sepharose CL-6B 的结合能力（图 3，C）。
综上，最适洗脱离子浓度和上样量分别为 0.20 mol · L-1 和 0.4 mL。
2.2.2 DEAE-Sepharose CL-6B 层析及鉴定
洗脱过程中产生了 3 个较大的蛋白峰（图 4），收集第一个蛋白峰时的洗脱液，即为纯化的 SP，
经 SDS-PAGE 检测后得单一条带，计算分子量约为 62.5 kD（图 5）。由于 SP 是由 2 个大小相等的
亚基构成，故推测百合鳞茎中 SP 全酶的分子量在 125 kD 左右。经过一系列分离纯化，最终 SP 的
纯化倍数是 14.78，得率为 23%。





2.3 酶学性质研究结果
2.3.1 反应动力学和矿质元素研究
以 G-1-P 为底物，在 0.1 ~ 5.0 mmol · L-1
的不同底物浓度下测定 SP 活性，按照
Lineweaver-Burk 法（双倒数法）作图（图 6），
计算得百合鳞茎中 SP 的 Km 值为 2.84
mmol · L-1。
如图 7 所示，在 1 mmol · L-1 浓度下，K+、
Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Co2+对 SP 活性有促
进作用，而 Na+、Ba2+、Mn2+、Fe2+则有抑制作
用，其中 Mg2+、Ca2+、K+和 Zn2+对 SP 活性的
促进作用显著。低浓度下对 SP 活性表现出促
进作用的离子，随浓度的增加，作用减弱；浓
度继续升高，则表现为抑制，且浓度越高，抑制作用越明显，Na+除外。综合比较来看，低浓度离
子对 SP 活性有促进作用，而高浓度则有抑制作用。


图 4 SP 在 DEAE-Sepharose CL-6B 层析柱上的洗脱图
Fig. 4 Elution profiles of SP on DEAE-Sepharose CL-6B
图 5 SDS-PAGE 图谱
Fig. 5 SDS-PAGE patterns
8 期 孙红梅等：百合鳞茎淀粉磷酸化酶分离纯化及酶学性质研究 1527


图 7 不同种类离子及其浓度对 SP 活性的影响
Fig. 7 Effects of different ion species on SP activity

2.3.2 pH、温度和化学剂的影响
如图 8 所示，SP 活性随体系 pH 的变化较为平缓，pH 5.0 时有最大值；SP 活性在 30 ℃时有最
大值，故 SP 最佳反应 pH 和温度分别为 pH 5.0 和 30 ℃。如图 9 所示，抗坏血酸浓度为 10 mmol · L-1
时，SP 活性最大；随着 PVP 含量增加，显色反应所产生的 OD 值成比例升高，可能是因为反应体
系中的某种物质与 PVP 发生显色反应，产生了深蓝色，对 SP 的显色反应造成干扰。综上可得，在
SP 反应体系中加入的抗坏血酸含量应为 10 mmol · L-1，且不宜加入 PVP。











图 8 pH 和反应温度对 SP 活性的影响
Fig. 8 Effects of pH value and reaction temperature on SP activity













图 9 抗坏血酸和 PVP 含量对 SP 活性的影响
Fig. 9 Effects of ascorbic acid and PVP content on SP activity
1528 园 艺 学 报 39 卷
3 讨论
盐析作为一种传统的生物大分子分离方法，适用范围广泛且效果稳定。不同的植物材料和酶类，
其盐析范围都会呈现出一定的差异。水稻种子（Hsu et al.，2004）SP 纯化过程中(NH4)2SO4 盐析的
范围在 40% ~ 60%；兰州百合鳞茎苯丙氨酸解氨酶（PAL）选用 40% ~ 75%的(NH4)2SO4 进行分离纯
化（孙红梅 等，2008）；而本试验确定 30% ~ 60% (NH4)2SO4 的饱和度为纯化兰州百合鳞茎 SP 的较
适盐析范围。双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法，在植物香料（陆
永梅 等，2006）、酶（冯自立和马娜，2010）和蛋白质等（Long & Keating，2006）分离纯化方面
受到广泛重视。本试验中，PEG1000、(NH4)2SO4 和 NaCl 含量分别为 29%、20%和 0.008%，是百合
鳞茎中 SP 双水相最佳提取条件。这一结果比发酵液中的溶菌酶（张亚杰 等，2008）和 α–淀粉酶
（董海莉 等，2011）等的提取效果差，可能是由于百合鳞茎内淀粉含量高，提取体系成分更为复杂。
SDS-PAGE 在蛋白质纯化、鉴定等方面应用广泛，聚合酶（李国辉 等，2011）、葡聚糖酶（徐
伟佳 等，2011）基因的克隆、表达及酶学性质研究，唐菖蒲中的同工酶比较分析（张志伟 等，2007）
等方面都有应用。目的蛋白 SP 的纯化倍数和回收率都比较低，可能是由于硫酸铵分段盐析法历时
长，步骤多，本身会使蛋白由于水解等因素损失较多，而双水相萃取法在百合鳞茎中蛋白质的提取
上应用还不够成熟。百合鳞茎中存在着大量淀粉，对蛋白质的提取和纯化都造成了相当程度的干扰，
如何有效去除体系中的淀粉，建立一套更为高效的分离纯化体系，仍需进一步的探索。
SP 的酶学性质研究表明其最适反应温度为 30 ℃，比马铃薯中的反应温度要低（王鹏 等，2003），
这可能与植物的起源和生长适应性有关。因为百合本身是一种不耐高温的植物，自然分布区在温带
和寒带。由于 SP 对低温的适应性，在生产中采用低温这样单一的的条件来调控淀粉的降解，可能
不会带来理想的效果（Shin et al.，2002）。另外，百合鳞茎中 SP 的 Km 值为 2.84 mmol · L-1，比水
稻中的 2.1 mmol · L-1 略大（Hsu et al.，2004），这种 Km 值的差异可能是由于不同植物中 SP 的作用
底物不同引起的。分离纯化 SP 并进行酶学性质研究，可以为进一步探索鳞茎内整个淀粉变化过程
提供理论基础，最终实现人工调节百合鳞茎内淀粉代谢，并为其工业化生产提供理论依据。

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