全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（4）：735–745 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–12–25；修回日期：2014–03–18
基金项目：教育部创新团队项目（IRT0963）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xiongxingyao@caas.cn）
致谢：王文明先生、衡周博士、张寒硕士、秦宇硕士、石梦蝶硕士等参与了野外采样；木德生先生和林涛博士为数据分析提供了技术
支持；周琼硕士和康信聪博士对本文英文摘要进行了校正；在此一并致以衷心的感谢!
南方红豆杉转录组 SSR挖掘及分子标记的研究
李炎林 1，杨星星 1，张家银 3，黄三文 2，熊兴耀 1,2,*
（1 湖南农业大学园艺园林学院，长沙 410128；2 中国农业科学研究院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3 国家中医药
管理局亚健康干预技术实验室，长沙 410128）
摘 要：利用 Trinity 软件对 NCBI 公共数据库中公布的南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根、
茎和叶的转录数据进行转录组的重新拼接。通过对 13 737 528条序列组装得到 96 279条Unigenes（38 Mb），
通过 SSR 检测程序从 96 279 条 Unigenes 中得到 2 160 个 SSR 位点（2.24%），其平均发生率为 1/18.01 kb，
基序长度为 14 ~ 25 bp 之间。优势重复基序为六核苷酸和三核苷酸，分别占总 SSR 位点的 38.56%和
37.08%。2 160 个 SSR 位点由 703 种重复基序构成，其中六核苷酸占 60.96%，主要分布在 3 ~ 4 重复；二、
三核苷酸占总 SSR 位点的 44.81%，其中以（AG/CT）n、（AT/AT）n、（AAG/CTT）n、（AGC/CTG）n、（AGG/
CCT）n 和（ATC/ATG）n重复基序最为丰富，合占总 SSR 重复类型的 34.73%，并出现少量的（CG/CG）n
和（CCG/CGG）n重复。通过 L9（34）正交试验得到最优的 SSR-PCR 体系，10 μL PCR 体系中含 DNA 20 ng，
1× PCR 缓冲液，MgCl2 20 mmol，dNTPs 0.35 mmol，引物 0.25 μmol，Taq 酶 0.45 U。随机挑选 62 对 SSR
引物进行 8 个南方红豆杉株系的 SSR 扩增，有效扩增率为 53.23%，多态性比率为 38.71%。这些多态性转
录组 SSR 引物的开发为红豆杉遗传多样性的分析、分子标记辅助育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘
提供了更丰富的标记。
关键词：红豆杉；转录本；引物；SSR
中图分类号：S 68 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）04-0735-11

Studies on SSR Molecular Markers Based on Transcriptome of Taxus
chinensis var. mairei
LI Yan-lin1，YANG Xing-xing1，ZHANG Jia-yin3，HUANG San-wen2，and XIONG Xing-yao1,2,*
（1College of Horticulture and Landscape，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2 The Institute of
Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；3 State Key Laboratory of
Subhealth Intervention Technology，Changsha 410128，China）
Abstract：To study the genetic diversity and genetic linkage mapping of Taxus chinensis var. mairei
without information of the whole genome，the SSR primers were designed based on the transcriptome data
（from NCBI）from roots，stems and leaves of 13 737 528 reads were assembled into 96 279 unique
sequences with 38 Mb total nucleotides，in which 2 160 SSRs（2.24%）were identified，with the average
frequency of 1/18.01 kb and the motifs length of 14 to 25 bp，by using SSR finding soft. Hexunucleotides

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（38.56%）and trinucleotides（37.08%）appeared to be the most abundant repeated motifs. Seven hundred
and three repeat motifs were composed of 2 160 SSRs，in which hexunucleotides were accounted for
60.96%，with the repeat frequency of 3 to 4 times. Among the dinucleotide and trinucleotides SSR motifs
（44.81%），the most abundant was（AG/CT）n，（AT/AT）n，（AAG/CTT）n，（AGC/CTG）n，（AGG/CCT）n
and（ATC/ATG）n accounting for 34.73% of the total SSRs. A small amount of repeats were（CG/CG）n and
（CCG/ CGG）n the optical amplifications were performed in 10 μL final volume containing 20 ng DNA，
1× PCR buffer（Tiangen），20 mmol MgCl2，0.35 mmol each of dNTPs，0.25 μmol each of primers，0.45
U polymerase Taq（Tiangen），according to the orthogonal test of L9（34）. Sixty-two potential markers sites
were randomly selected to validate the assembly quality and develop SSR markers. Among 8 Taxus
germplasms，effective PCR success rate and polymorphism rate of 62 markers were separately 53.23% and
38.71%. This study is important for analyzing genetic diversity，marker assisted selection，genetic linkage
mapping and functional gene mining of Taxus chinensis var. mairei by using SSR molecular markers.
Key words：Taxus chinensis var. mairei；transcriptome；primer；SSR

简单重复序列（simple sequence repeat，SSR），又称微卫星，是一种广泛存在于原核生物和真
核生物基因组中的遗传标记（Kalia et al.，2011；黄海燕 等，2013），具有共显性、高信息量、广覆
盖性等特点（Agarwal et al.，2008；刘峰 等，2012；黄海燕 等，2013），已经在植物分子辅助育种、
遗传图谱构建、品种鉴定、遗传多样性分析、功能基因定位以及种子纯度鉴定等方面有广泛的应用
（Agarwal et al.，2008；黄海燕 等，2013；罗兵 等，2013）。SSR 标记引物的开发是 SSR 标记的前
提，传统的 SSR 引物标记开发方法费时费力，阳性克隆率低，获得成功的几率小（Röder et al.，1998；
Ujino et al.，1998；Uzunova & Ecke，1999），而利用富集技术筛选 SSR 标记，需要构建筛选基因文
库，操作过程繁琐（李齐发 等，2004），因此限制了 gSSR 标记开发的进程。表达序列标签（Expressed
Sequence Tag，EST）直接反应个体基因的表达信息，来源于基因的转录区，其在公共数据库中的数
据量与日俱增，但相对于转录组数据量相对缺乏，特别是在非模式物种中更为突出。随着测序技术
的飞速发展，相对于基因组测序更易于拼接的转录组研究在许多非模式生物中得到了广泛的应用
（Alagna et al.，2009；Barakat et al.，2009；Riggins et al.，2010；Der et al.，2011；Franssen et al.，
2011）。基于转录组的标记较一般的分子标记具有信息量大和通用性好的优势，在亲缘物种之间矫正
连锁图谱和比较作图方面具有较强的优势（李小白 等，2013），在柑橘（Luro et al.，2008）、淫羊
藿（Zeng et al.，2010）、豆类（Kaur et al.，2012）、芝麻（Zhang et al.，2012）、红薯（Schafleitner et
al.，2010）等物种有基于转录本数据库或者 EST 数据库成功开发 SSR 标记的报道。
南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei），雌雄异株，是中国特有的第四纪孑遗植物，具有重要
的观赏价值。其含有的紫杉醇更是重要的治疗癌症药物（Rowinsky et al.，1990；Holmes et al.，1991；
Foa et al.，1994）。中国拥有红豆杉属 11 种中的 4 种 1 变种资源，具有独特的资源优势，但目前红
豆杉遗传背景还不清晰。RAPD、ISSR、AFLP、gSSR、EST-SSR 等现代分子生物学手段为红豆杉
种质遗传多样性（张宏意 等，2003；李乃伟 等，2010，2011；Chybicki et al.，2011）、分类学（王
艇 等，2000）、性别鉴定（肖璐 等，2011）和性状连锁的标记（Göçmen et al.，1996；苏建荣 等，
2009）、分子标记开发（Dubreuil et al.，2008；Yang et al.，2009；Mahmoodi et al.，2010；Liu et al.，
2011；吴琼 等，2012）等研究带来了方便。
目前关于红豆杉的 gSSRs、genic-SSRs 和 EST-SSRs 通过验证的不超过 100 对，且 NCBI 中公布
的红豆杉EST序列只有 510条。红豆杉基因组二倍体在 20.68 ~ 23.81 Gb之间，目前只有 102个RAPD
标记定位到 17 个太平洋红豆杉连锁群上，平均 207.61 ~ 239.03 Mb 一个分子标记，远不能满足红豆
4 期 李炎林等：南方红豆杉转录组 SSR 挖掘及分子标记的研究 737



表 1 南方红豆杉转录组 SSR-PCR体系反应
体系（10 μL）正交设计表
Table 1 Orthogonal design for the 10 μL SSR-PCR reaction
system of transcriptome in Taxus chinensis var. mairei
编号
Number
MgCl2/
mmol
dNTPs/
mmol
引物/μmol
Primer
Taq/U
1 15 0.15 0.25 0.25
2 15 0.25 0.35 0.45
3 15 0.35 0.45 0.65
4 20 0.15 0.35 0.65
5 20 0.25 0.45 0.25
6 20 0.35 0.25 0.45
7 25 0.15 0.45 0.45
8 25 0.25 0.25 0.65
9 25 0.35 0.35 0.25
杉遗传图谱构建的需要。红豆杉公共转录组数据种类多，但 SSR 引物开发报道较少，转录组拼接软
件的更新为通过其开发 SSR 标记成为了一种可能。本研究中利用 NCBI 中公布的南方红豆杉转录组
数据，进行系统的分析，通过 PCR 体系的优化和引物的验证筛选，最终找到适用于红豆杉 SSR 标
记研究的引物，为进行红豆杉遗传多样性分析、雌雄植株的鉴定、遗传图谱构建、功能基因挖掘和
分子标记辅助育种等奠定基础。
1 材料与方法
1.1 转录组数据来源
本研究于2013年在湖南省作物种质资源与利用重点实验室完成。转录组数据来源于公共数据NCBI
中南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根、茎和叶的全转录组 Illumina 第 2 代测序技术的高通
量深度测序 SRA 数据包，压缩文件 1.01 Gb（Hao et al.，2011）。通过 sratoolkit.2.3.2-5 centos 软件将
SRR350719.sra 文件转化成 SRR350719.fastq 数据，共得到 5.0 Gb 的数据量。
1.2 转录组 SSR位点鉴别及 SSR引物设计
南方红豆杉转录组数据采用 Trinity 软件（Grabherr et al.，2011）进行拼接，拼接参数参照 Henschel
等（2012）略有修改，命令参数为 Trinity.pl–SeqType fq–JM 40 G–single SRR350719. fastq–CPU
20。通过拼接得到 Unigenes 库，并对南方红豆杉根、茎和叶混合的 Unigenes 库利用 MISA 程序进
行 SSR 位点搜索（Guo et al.，2010）。
调用 Primer 3.0 引物批量设计程序对含有 SSR 位点的 Unigenes 序列设计引物，并且 SSR 位点
侧翼序列长度 ≥ 50 bp。引物设计的主要参数：（1）退火温度（Tm）在 55 ~ 70 ℃之间，上、下游
引物的 Tm值相差 ≤ 5 ℃；（2）PCR 扩增产物大小在 50 ~ 500 bp 之间，引物长度在 18 ~ 25 bp 之间；
（3）GC 含量在 40% ~ 65%之间，且上、下游引物之间无引物二聚体和二级结构的出现。对批量设
计的 SSRs 引物对在 Unigenes 库中进行 SSR 引物的 blast 验证。
1.3 植物材料与 DNA提取
选取 8 株采自湖南省浏阳市大围山区南方红豆杉的成熟叶片（雄株 5 棵，雌株 3 棵），用 CTAB
法分别提取 DNA（李炎林 等，2009），–20 ℃保存备用。
1.4 PCR扩增体系的优化
以南方红豆杉叶片 DNA 为模板，参照
Dubreuil 等（2008）SSR-PCR 为基本条件和扩
增程序。10 μL PCR 体系含 DNA 20 ng，通过
对 Mg2+、dNTPs、引物和 Taq 的 L9（34）试验
优化 SSR-PCR 体系（表 1），选用两对来源于
转录组的 SSR 引物。TSSR-31：上游序列，TCCC
TGTCTCTGCCTCTGT，下游序列，TGCAGAC
AATGGAGGGCT，扩增产物为179 bp；TSSR-45：
上游序列，TGGAGATGACCAGCTTCAGC，
下游序列，GGCAAATGCAGCCGCTTT，扩增
产物为 161 bp。在 Bio-RAD T100TM Thermal
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Cycler PCR 仪上进行扩增，采用 Touchdown 模式：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，63 ℃退火 40 s
（每个循环降低 0.5 ℃），72 ℃ 延伸 40 s，10 个循环；95 ℃变性 30 s，59 ℃退火 40 s，72 ℃ 延
伸 40 s，25 个循环；72 ℃延伸 7 min。扩增产物用 6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶检测，170 V 电压，
60 min，银染显色。
1.5 SSR引物筛选
挑选 62 对引物由上海生工生物工程技术有限公司（中国上海）合成，用于扩增，PCR 扩增体
系选自正交试验的最优体系。
2 结果与分析
2.1 转录组数据的组装
来自公共数据库的南方红豆杉转录组数据一共有序列 13 737 528 条，数据格式转化为 fasta 后数
据量为 2.2 Gb，平均序列长度为 148 bp。通过 Trintiy 软件组装得到 Unigenes 96 279 条，数据量为
38 Mb，最短序列长为 201 bp，最长序列为 4 573 bp，N50 值为 290 bp。
2.2 转录组中 SSR位点的分布特点
在南方红豆杉转录组的 96 279 条 Unigenes 序列中发现 2 160 个 SSR 位点，发生频率为 2.24%。
其中有 1 995 条 Unigenes 序列中只含有 1 个 SSR 位点，发生频率为 2.07%，含两个及以上 SSR 位点
的 Unigenes 序列有 148 条，发生频率为 0.15%，南方红豆杉转录组序列中平均 18.01 kb 就能发现一
个 SSR 位点。非混合的 SSR 基序长度因核苷酸类型的不同而互异，最短 SSR 基序为 14 bp 的二核
苷酸，最长 SSR 基序为 25 bp 的五核苷酸（表 2）。
表 2 南方红豆杉转录组中 SSR重复单元分布特征
Table 2 Distribution of the SSR motifs T. chinensis var. mairei transcriptome
SSR 类型
Type of SSR
数量
Number
发生频率/%
Frequency
平均距离/kb
Average
distance
基序长度/bp
Motifs length
主要 SSR 单元
Main repeat motif
二核苷酸
Dinucleotide
167 0.17 233.00 14 ~ 24 AC/GT，AG/CT，AT/AT/CG/CG
三核苷酸
Trinucleotide
833 0.87 46.71 15 ~ 24 AAC/GTT，AAG/CTT，AAT/ATT，ACC/GGT，
ACG/CGT，AGC/CTG，AGG/CCT，ATC/ATG，
CCG/CGG
四核苷酸
Tetranucleotide
80 0.08 486.40 16 ~ 24 AAAC/GTTT，AAAT/ATTT，AAAG/CTTT，
AAGG/CCTT
五核苷酸
Pentanucleotide
279 0.29 139.50 20 ~ 25 AAAAC/GTTTT，AAAAT/ATTTT，AAATG/ATTTC，
AAGAG/CTCTT，AGAGC/CTCTG，AGAGG/CCTCT
六核苷酸
Hexunucleotide
801 0.83 48.58 18 ~ 24 AACAGC/CTGTTG，AAGAGG/CCTCTT，
AAGATG/ATCTTC，AAGGAG/CCTTCT，
AGAGGC/CCTCTG，AGAGGG/CCCTCT，
AGATGG/ATCTCC，AGCAGG/CCTGCT
总计 Total 2 160 2.24

南方红豆杉转录组中 SSR 的主要重复类型为三核苷酸重复和六核苷酸重复，分别占 37.08%和
38.56%；其次是五核苷酸，占总数的 12.92%；二核苷酸和四核苷酸重复类型数量很少，总计 11.43%。
红豆杉转录组 SSR 重复单元的重复次数分布在 1 ~ 35 次之间，其中 1 ~ 5 次重复的 SSR 位点有
1 399 个，占总个数的 64.77%；6 ~ 10 次重复的 SSR 位点有 408 个，占总个数的 18.89%；其次为大
4 期 李炎林等：南方红豆杉转录组 SSR 挖掘及分子标记的研究 739

图 1 南方红豆杉 SSRs重复次数分布
Fig. 1 Distribution of SSRs with repeat numbers in
T. chinensis var. mairei
于 20 次重复和 11 ~ 15 次重复；16 ~ 19 次重复
仅有 51 个，占 2.36%。三核苷酸基序重复数最
多为 53 次，其次为二核苷酸重复基序，最多为
32 次（图 1）；另外，六核苷酸重复单元最多为
12 次，四、五核苷酸重复单元最多重复分别为
4 次和 7 次。
2.3 转录组 SSR基序重复类型和频率特征
从南方红豆杉转录组 SSR 核苷酸基序类
型来看，其 2 160 个 SSR 位点包含 703 种重复
单元，二、三、四、五、六核苷酸重复各有 11、
55、45、147、445 种；从 SSR 重复频率来看，
二核苷酸主要分布在 7 ~ 12 次，三核苷酸主要
分布在 4 ~ 8 次，四核苷酸主要分布在 4 ~ 6 次，
五核苷酸主要分布在 3 ~ 5 次，六核苷酸主要分布在 3 ~ 4 次。
从不同 SSR 基序出现频率来看（表 2），二核苷酸中以（AG/CT）n 和（AT/AT）n 最多，分别占
二核苷酸 SSR 总数的 45.51%和 35.33%，共计占 SSR 总数的 6.25%，CG/CG 二核苷酸重复最少，约
占 SSR 总数的 0.05%；三核苷酸中以（AAG/CTT）n、（AGC/CTG）n、（AGG/CCT）n和（ATC/ATG）n
最多，分别占三核苷酸总数的 26.67%、16.69%、19.21%、11.61%，共计占 SSR 总数的 28.48%；四
核苷酸中以（AAAC/GTTT）n 和（AAAT/ATTT）n 最多，分别占四核苷酸 SSR 总数的 17.5%和 18.75%；
五、六核苷酸 SSR 基序种类较多，各自所占 SSR 总数相对较少，其中以（AAGAG/CTCTT）n、
（AGAGG/CCTCT）n、（AAGAGG/CCTCTT）n、（AAGATG/ATCTTC）n、（AAGGAG/CCTTCT）n
和（AGAGGG/CCCTCT）n 居多，合计占 SSR 总数的 5.83%。
表 3 基于南方红豆杉重复基序类型的转录组 SSRs分布
Table 3 The distribution of transcriptome-SSRs on dissimilar repeat motifs in T. chinensis var. mairei
主要 SSR 单元
Main repeat
motif
占各类 SSR 重复基
序比例/%
The ratio of each type
of SSR repeat motif
占总 SSR 重复
基序比例/%
The ratio of total
SSR repeat motif
主要 SSR 单元
Main repeat
motif
占各类 SSR 重复基
序比例/%
The ratio of each type
of SSR repeat motif
占总 SSR 重复
基序比例/%
The ratio of total
SSRrepeat motif
AG/CT 45.51 3.52 AAAT/ATTT 18.75 0.69
AT/AT 35.33 2.73 AAGAG/CTCTT 7.89 1.02
AAG/CTT 26.77 10.32 AGAGG/CCTCT 7.89 1.02
AGC/CTG 16.69 6.44 AAGAGG/CCTCTT 3.87 1.44
AGG/CCT 19.21 7.41 AAGATG/ATCTTC 3.37 1.25
ATC/ATG 11.16 4.31 AAGGAG/CCTTCT 2.87 1.06
AAAC/GTTT 17.50 0.65 AGAGGG/CCCTCT 2.87 1.06
2.4 转录组 SSR-PCR体系的优化及引物有效性验证
根据 L9（34）正交试验方案，得到了南方红豆杉 SSR-PCR 优化体系（图 2）。依据目的扩增条带
的有无、稳定性和清晰度，选择试验 8 为最优 SSR-PCR 扩增体系，10 μL 体系中含 MgCl2 20 mmol，
dNTPs 0.35 mmol，引物 0.25 μmol，Taq 酶 0.45 U，用 ddH2O 补足。
合成的 62 对 SSR 引物，包括 2 ~ 6 核苷酸 SSR 重复单元。试验选取 5 份雌株和 3 份雄株的 DNA
为模板对 62 对引物进行扩增检测，其中有 33 对扩增出特异条带，有效扩增率为 53.23%；有 24 对
引物扩增产物具有多态性，占设计引物总数的 38.71%（表 4）。
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图 2 南方红豆杉 SSR–PCR正交试验扩增产物电泳结果
A：TSSR-31；B：TSSR-45。M：Marker；1 ~ 9：SSR–PCR 扩增体系，见表 1。
Fig. 2 Electrophoreses of orthogonal design of SSR-PCR products in T. chinensis var. mairei
A：TSSR-31；B：TSSR-45. M：Marker；1–9：Application system of SSR-PCR（Table 1）.


表 4 SSR引物及重复类型
Table 4 SSR primer sequences and repeat types
引物序列 Primer sequence 5′–3′ 引物编号
Primer No. 正向 Forword 反向 Reverse
SSR 类型
SSR motif
产物大小/bp
Size
TSSR-16 TGGACAATTGGTGGAGAGGTC TCCCTCACCCTTTGCAGC （GAA）6 164
TSSR-17 TCGAAGATGGGGGTGGGT AGGGCCCCGAGTCTAAGG （GTTAGG）3 179
TSSR-24 GGGGCTGCTCCTCATGTG GGCTTTGCTCTGAGCTGC （TCTGTA）3 170
TSSR-28 AGAGGGAGAGGAGTGGGC AACACACTGTCGGGCCTC （CCTCTC）3 149
TSSR-31 TCCCTGTCTCTGCCTCTGT TGCAGACAATGGAGGGCT （CCTCTA）3 179
TSSR-32 CCTTGGCGATCACTGGCT CGCCAAACTTTGTCTCGTGT （GAA）5 156
TSSR-34 AAGTGACAAGGCAGAAGAGAA ACCGGGGAATCTCGTGAAC （GAG）5 188
TSSR-37 CGCTGGACATTTGCAGAGC CGCCAGAACCGCTCTCAT （GGAGAC）3 151
TSSR-39 GCAGGTGCAGGGGATTGT CCCCAACAACGGAGGCTT （GATGGA）3 142
TSSR-40 CTTCGACCCGCCTTGTGT CGTGCTCGGGTTCTGTGT （GCATT）3 190
TSSR-41 CGCTACTACCACGCCCAC TCATGGCTTAGAGCGGCG （CGGCCT）3 190
TSSR-45 TGGAGATGACCAGCTTCAGC GGCAAATGCAGCCGCTTT （TGGGTT）4 161
TSSR-50 CCTTCACCTGGCCCTGTC TCGACTGCTAGGGGTTCAGA （CTCCT）3 205
TSSR-51 AGTGGGGAAACGTGAGCG AGCGATGGAATTGCATGCTC （GAGCT）4 194
TSSR-53 TGGCTTCTGCACCACCAA AAGGCGCGTCTTTTCCCT （TAA）6 188
TSSR-55 GCCTGCTTCACTTTCTCCCT CCGCCATTCCTCCTCGTT （ATCTTC）3 203
TSSR-56 GGGCGGTGTAGCAAACGA CCAGTGAAAAACTCGCCGC （GAAAGG）4 184
TSSR-58 GCCCACCAGCAGTCGAG AAACGCATTCGCAAGGGC （AGG）6 146
TSSR-78 TGGCGTTGGGTACAGCAG GGCCATCATGCCGTCTGA （CAG）5 199
TSSR-82 GCGATGCCAAGAACGGGA TCTGTTCCCGCGCCAAAT （AAAAGG）3 156
TSSR-85 GCCACATGTGCCGACAAC CGGGGGAGGTGACAGAGA （CAG）5 174
TSSR-86 ATCAGCGATTCGGCAGCA GCTGCAGCCTACGCTTCT （ATT）5 180
TSSR-87 ATCAGCGATTCGGCAGCA GCTGCAGCCTACGCTTCT （AGA）5 206
TSSR-88 CCGTCCAAGGAAAGGGCC TTTTTCGCCCGGCCATCT （CCG）5 185


引物 TSSR-16、TSSR-17、TSSR-45 和 TSSR-46 在 8 个南方红豆杉株系之间进行扩增（图 3），
这 4 对引物扩增的目的片段长度分别对应在 100 ~ 150、100 ~ 150、100 ~ 200 和 150 ~ 200 bp 之间。

4 期 李炎林等：南方红豆杉转录组 SSR 挖掘及分子标记的研究 741

图 3 引物 TSSR-16、TSSR-17、TSSR-45和 TSSR-46在 8个南方红豆杉株系间的扩增多态性
Fig. 3 Polymorphism of primer TSSR-16，TSSR-17，TSSR-45 and TSSR-46
showed in eight clones of T. chinensis var. mairei
3 讨论
由于高通量技术的发展和其成本优势，测序数据几乎涵盖了特定组织和特定时期的所有转录
本，特别是那些缺乏基因组信息的物种，其转录组学的研究越来越广泛。基于转录组建立的标记是
根据基因本身的差异而建立，检测方法基于 PCR，操作简便、经济、信息量大的优势（李小白 等，
2013），得到了广泛的应用。
转录组的拼接对后续研究至关重要。在许多没有合适参考基因组的非模式生物中，从头拼接就
成为唯一选择。NGS 数据量比传统的毛细管数据量大，且有不同程度的错误率，因此拼接方法和拼
接工具尤为重要（李小白 等，2011）。常见的拼接软件众多，如 gsAssembler、SOAPdenovel、Velvet
等，Trinity 是一款用来拼接动植物转录组的软件，对 Illumina 测序数据和有多重复基因的大数量的
测序数据拼接有优势，在拼接非模式物种的 NGS 数据上较其他软件拼接结果更好（Grabherr et al.，
2011；李小白 等，2011）。南方红豆杉属于基因组序列比较庞大的裸子植物，本研究中对其根、茎、
叶的转录组数据利用 Trinity 软件拼接，通过对 13 737 528 条序列组装得到 96 279 条 Unigenes，数
据量为 38 Mb，序列长度从 201 ~ 4 573 bp 之间，较 Hao 等（2011）利用 SOAPdenovo 软件拼接 112
769 Uniges 数少，而 N50 小于 384 bp。这种拼接结果为南方红豆杉 SSR 标记开发提供了较好的基础。
南方红豆杉转录组中微卫星的种类较为丰富，对其 96 279 条 Unigens 进行 SSR 搜索，筛选得到
2 160 个 SSR 位点（发生频率为 2.24%），平均密度为每 18.01 kb 分布一个 SSR 位点。这种频率分布
与同为裸子植物类的银杏 12.02 kb 低（樊洪泓 等，2009），但高于松类 Pinus taeda（1.2%）和 P. pinaster
（2.1%）（Chagné et al.，2004）；较同为木本类植物如杨树 14.0 kb（Cardle et al.，2000）、柑橘 5.7 kb
（Chen et al.，2006）、北美鹅掌楸 8.5 kb（Xu et al.，2010）低；同样也低于大麦（3.4%）、小麦（3.2%）、
水稻（4.7%）和高粱（3.6%）等禾本科植物（Kantety et al.，2002）。另外，南方红豆杉转录本的发
生密度较同属不同种的东北红豆杉 SSRs 发生频率（3.1%）低。转录组中 SSRs 发生频率和密度在不
同物种间存在较大差异，这可能与物种、转录组测序的方法和数据量的大小和数据处理采用的方法
不同有较大的关系（Varshney et al.，2005；吴琼 等，2012；黄海燕 等，2013）。
在大多数物种中二核苷酸和三核苷酸是最常见的EST或者转录组SSR重复基序类型（Kantety et
742 园 艺 学 报 41 卷
al.，2002；Chagné et al.，2004；Liang et al.，2009；吴琼 等，2012；黄海燕 等，2013）。但南方红
豆杉中丰富的 SSR 重复基序是六核苷酸重复，其次是三核苷酸重复，分别占 SSR 总数的 38.56%和
37.08%，合计占总 SSR 的 75.64%，再次为 12.92%的五核苷酸重复，最少的是二核苷酸和四核苷酸
基序重复。南方红豆杉中以六核苷酸和三核苷酸为主要 SSR 重复基序的情况与东北红豆杉（吴琼
等，2012）和拟南芥（Morgante et al.，2002）类似。相关研究表明自然选择机制对转录区的三核苷
酸基序表现出积极选择作用，在编码区由于受重大突变压力的影响而存在丰富的三核苷酸重复基序
（Metzgar et al.，2000；Blanca et al.，2011；Garg et al.，2011）。如果在编码区的单核苷酸、二核苷
酸、四核苷酸或者五核苷 SSR 重复基序的突变会导致移码突变而发生蛋白质结构和功能的改变，这
对物种的延续和生存可能产生不利（Chagné et al.，2004）。六核苷酸 SSR 重复基序的突变情况与三
核苷酸类似，可能是一种有利于植物进化的突变，南方红豆杉中这种以六核苷酸和三核苷酸 SSR 基
序为主体，而二核苷酸、四核苷酸和五核苷酸 SSR 基序占少数的分布可能是自然选择的结果。在报
道的大多数双子叶植物中常见的重复基序类型有 AG、AT、AAG、AGG 和 AGC 等（Chagné et al.，
2004），这与南方红豆杉中表现一致。另外，在大多数单子叶植物中 CCG/CGG 三核苷酸是常见的重
复基序，而在双子叶植物很少见（Morgante et al.，2002；Varshney et al.，2002）。南方红豆杉中
CCG/CGG 三核苷酸重复基序仅占 SSR 总数的 2.78%，结合松类、银杏等裸子植物的结果，南方红
豆杉 SSR 重复基序组成更接近于双子叶植物，这可能是由于其 G + C 含量较单子叶植物低、密码子
的偏倚性、搜索条件等有关。
扩增产物与预期大小不符、非特异性扩增（或者多扩增条带）是研究物种转录组 SSR或者EST-SSR
时常见的问题，而且这些扩增是可重复的，这可能产生于扩增片段中内含子的插入、基因组或者染
色体的复制或者基因的复制等（Saha et al.，2004，2006）。通过 L9（34）试验优化方案得到了南方
红豆杉 SSR-PCR最优体系，随机选择 62对 2 ~ 6核苷酸重复基序的 SSR引物，有效扩增率为 53.23%，
具有多态性位点的引物占扩增引物总数的 38.71%。这包括了在 PCR 扩增过程中出现的与预期扩增
不符或者非特异性的扩增这类可重复的扩增，这类引物的有效性在小麦（Yu et al.，2004），高羊茅
（Saha et al.，2004，2005，2006）中得到验证。高多态性比率的 SSR 引物开发是 SSR 标记技术应
用的一个重要技术因素。多重复数短 SSR 重复基序因其变异频率高通常较重复次数少的长 SSR 重
复基序引物多态性高（Kelkar et al.，2008），南方红豆杉转录本的 SSR 重复基序长度在 14 ~ 25 bp
之间，多态性引物占有效扩增率的 72.72%，这也验证了短 SSR 重复基序多态性比率较高这一推论。
本研究结果表明利用南方红豆杉转录组数据开发 SSR 标记的可行性，同时这些标记的开发为红
豆杉种质资源遗传多样性分析、分子标记辅助育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘等奠定了基础。

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