全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（2）：240–250 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–11–06；修回日期：2011–01–11
基金项目：国家博士后基金项目（20080440161）；第 36 批国家留学基金项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：fanggg@njau.edu.cn；Tel：025-84399069）
葡萄 SPL9 和 SPL10 基因全长 cDNA 克隆、亚
细胞定位和表达分析
曹 雪，王 晨，房经贵*，杨 光，于华平，宋长年
（南京农业大学园艺学院，南京 210095）
摘 要：从‘夏黑’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca ‘Summer Black’）中克隆了 SBP（Squamosa promoter
binding protein）类重要转录因子基因 SPL9 和 SPL10 全长 cDNA 序列，在 GenBank 的登录号分别是
HM018600 和 HM018601，序列分析表明二者均具备完全保守的核定位信号序列（KKSR）、SBP 结构域以
及葡萄 microRNA156a（Vv-miR156a）的靶序列。进一步构建 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 亚细胞定位表达载体，
对其是否具有核定位功能进行了研究，并利用半定量、荧光定量 RT-PCR 研究了这两个基因与 Vv-miR156a
在葡萄不同组织的表达情况。结果表明：转录因子 SPL9 和 SPL10 均定位于细胞核中，而且两个基因在葡
萄各个组织中均有表达，但表达量存在差异，两者均在小果中的表达量最高。Vv-miR156a 的积累水平与
这两个基因在各个组织中的表达呈现一定的消长关系，并且在小果中最为明显。
关键词：葡萄；SPL9；SPL10；亚细胞定位；荧光定量 RT-PCR
中图分类号：S 663.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）02-0240-11

Cloning，Subcellular Localization and Expression Analysis of SPL9 and
SPL10 Genes from Grapevine
CAO Xue，WANG Chen，FANG Jing-gui*，YANG Guang，YU Hua-ping，and SONG Chang-nian
（College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）
Abstract：Firstly cloned two full length cDNAs of SPL9 and SPL10 SBPs（Squamosa promoter
binding proteins）transcription factors from Summer Black（Vitis vinifera × V. labrusca）with accession No.
of HM018600 and HM018601 deposited in GenBank database. The amino acid sequences of both genes
had a putative nuclear localization signal sequence（KKSR），highly conserved SBP domains and the
grapevine microRNA156a（Vv-miR156a）recognition sites. The sub-cellular location analysis using
expression vectors of SPL9 and SPL10 constructed showed that they were both located in nucleus. The
semi-quantitative and fluorescent quantitative RT-PCR were used to detect expression levels of Vv-SPL9，
Vv-SPL10 and miR156a in different tissues of grapevine. The result showed that the two genes were
expressed ubiquitously，but at different levels in different tissues. Their expression levels were the highest
in small fruit，where miR156a was accumulated at a lowest level. The expression levels of the two genes
showed some trade-off correlation with those of Vv-miRNA156a in various grapevine tissues，especially in

2 期 曹 雪等：葡萄 SPL9 和 SPL10 基因全长 cDNA 克隆、亚细胞定位和表达分析 241

the small fruit.
Key words：grapevine；SPL9；SPL0；sub-cellular localization；fluorescent quantitative RT-PCR

植物体内存在大量的转录因子，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）的27 000个基因中就有5.9%是
编码转录因子的（Riechmann et al.，2000）。根据其DNA结合域的特点可以把转录因子分成若干个家
族，如WRKY，AP2/EREBP，MYB，HB，MADS，SBP等（Birkenbihl et al.，2005），其中SBP家族
至今只在植物中发现，具有植物特异性。迄今已在拟南芥中发现该家族有17个成员，其中有11个
（SPL2、SPL3、SPL4、SPL5、SPL6、SPL9、SPL10、SPL11、SPL13和SPL15a/b）具有microRNA156
（miR156）的识别位点（Rhoades et al.，2002；Schwab et al.，2005；Wu & Poethig，2006；Gandikota
et al.，2007）。近年来，有关该基因家族在其他植物上的研究也得到了重视（Moreno et al.，1997；
Eriksson et al.，2004）。
SBP虽是较晚发现的转录因子家族，但其功能的研究一直备受关注（Cardon et al.，1997；Unte et
al.，2003；Stone et al.，2005；Wang et al.，2005；Manning et al.，2006；Schwarz et al.，2008）。自
从金鱼草中分离出两个SBP蛋白SPL1和SPL2后，陆续发现SPL基因参与花和果实发育（Unte et al.，
2003；林志萍 等，2006）、孢子发育以及赤霉素介导的发育过程局部调控（Debouck，1995；Unte et
al.，2003；Zhang et al.，2007）等。而关于葡萄SBP转录因子家族的研究才刚起步（曹雪 等，2010）。
葡萄（Vitis vinifera L.）的基因组较小（约为 500 Mbp），大约是拟南芥基因组大小的 3 到 4 倍，
同时也是继拟南芥、水稻、杨树之后完成全基因测序的第 4 种开花植物（Jaillon et al.，2007；房经
贵 等，2008），因此葡萄分子生物学成为研究的热点（Schellenbaum et al.，2008；Muruganantham et
al.，2009；程和禾 等，2009；周军 等，2009；王晨 等，2010；王延书 等，2010；杨光 等，2010）。
本研究中利用 RACE 技术获得了葡萄 SBP 类两个重要转录因子 SPL9 和 SPL10 的 cDNA 全长，采用
半定量及荧光定量 RT-PCR 方法分析了 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 基因在葡萄不同组织中的表达情况，并
对其与葡萄 miRNA156（Vv-miRNA156）在不同组织中的表达水平进行了比较，对两个葡萄 SBP
类转录因子功能有了初步认识，这对于生产中更有效地利用该基因或有目的地进行基因调控具有重
要的理论指导意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
‘夏黑’（Summer Black）葡萄成熟叶、幼叶、花蕾、花、小果（直径约 0.5 cm）、中果（直径
约 1.0 cm）、大果（直径约 1.3 cm）于 2009 年 4 月中旬到 6 月中旬采自南京农业大学汤山葡萄园。
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株 DH5由本实验室保存。亚细胞定位载体 pJIT166-GFP 由南京
农业大学作物遗传与育种国家重点实验室惠赠。引物由上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen）合
成，其编号及序列见表 1。
1.2 SPL9 和 SPL10 基因 cDNA 全长的克隆
葡萄各个组织总 RNA 的提取参照改进 SDS/酚法提取，再分离 LMW RNA（张彦苹 等，2010）。
总 RNA 的纯化参照 TaKaRa 公司的 DNaseⅠ（RNase Free）说明书进行。以总 RNA 为模板，引物
P01 反转录合成 cDNA 第一条链，引物 P02 延伸加帽子，空气加热条件下 42 ℃保温 1 h，75 ℃保温
10 min，冰上冷却 2 min 后，–70 ℃保存备用。LMW RNA 参照 Shi 和 Chiang（2005）PAP 加尾法
242 园 艺 学 报 38 卷
加尾，再加 5′接头（序列见 P03），将获得的连有 3′端和 5′端接头的小 RNA 为底物，利用引物 P04，
参照 SuperScriptⅡ逆转录酶试剂盒说明书进行反转录（Fu et al.，2005）。
根据拟南芥 SPL9 和 SPL10 基因序列，参照宋长年等（2009）电子克隆方法克隆葡萄 SPL9 和
SPL10 基因。以 cDNA 为模板分别用引物 P05/P06 和引物 P09/P10 进行 PCR 扩增获得基因 SPL9 和
SPL10 的 3′末端。反应体系：Ex-Taq 酶 0.50 μL，10 × PCR buffer（Mg2＋ plus）5 μL，dNTP Mixture
4 μL，cDNA 2 μL，引物各 1 μL，用灭菌纯水补足到 50 μL。反应参数为 94 ℃预变性 3 min；94 ℃ 30
s，72 ℃ 3 min，5 个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 个循环；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，
72 ℃ 3 min，25 个循环；72 ℃延伸 10 min。琼脂糖凝胶电泳检测后用 DNA 回收试剂盒回收目标片
段，再连接到 pMD-18T simple 载体进行 T/A 克隆。DNA 测序由南京金斯瑞科技有限公司
（http://www.genscript.com.cn）完成。

表 1 引物序列及 PCR 扩增片段大小
Table 1 Sequence of primers and PCR amplified products
编号
Code
序列
Sequence（5′–3′）
预期片段大小/bp
Predicted size of
amplified product
用途
Use
P01 GCAGGACTGCAGCTGACTGACTACT30VN cDNA 合成
P02 GACCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG cDNA synthesis
P03 GAGGACTGCAGCTGACTGACTACT30VN LMWRNA 5′接头 LMWRNA 5′ joints
P04 ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT30VN cDNA 合成 cDNA synthesis
P05 CAATCACTTCCCAAGCACCT 扩增 Vv-SPL9 基因 3′端
P06 GCAGGACTGCAGCTGACTGACTAC
± 1 486
3′-end amplification
P07 CTTGCTTTGTTGCCTTCACA 扩增 Vv-SPL9 基因 5′端
P08 AATGACCGTTGGAGACTTCG
± 502
5′ -end amplification
P09 ATGGAGTGGAATTTAAGAACTCCCTCA 扩增 Vv-SPL10 基因 3′端
P10 GCAGGACTGCAGCTGACTGACTAC
± 1 656
3′-end amplification
P11 GCCTACAGACGGAAGATGCT 扩增 Vv-SPL10 基因 5′端
P12 CCGCCCACTCTTATCAACTC
± 374
5′-end amplification
P13 GTCGACATGGAAAGGGGTTCGAGCTCTTTGACCG Vv-SPL9 基因 ORF 扩增
P14 TCTAGACTAAAGTGACCAGTGCATCTGCTGAGTGGA
1 137
Complete ORF amplification
P15 AAGCTT ATGGAGTGGAATTTAAGAACTCCCTCA VV-SPL10 基因 ORF 扩增
P16 TCTAGATCAGTTAATTTGATTGGGATAAAAACAGCC
1 398
Complete ORF amplification
P17 CAGCAGATGCACTGGTCACT Vv-SPL9 半定量 RT-PCR
P18 GGAGGTATCCCCCTGAAAGA
113
Vv-SPL9 semi-quantitative PCR.
P19 TGTGATGCATTGGAGAAAGC Vv-SPL10 半定量 RT-PCR
P20 CCATGAAACAAACGGATTCA
138
Vv-SPL10 semi-quantitative PCR
P21 GCTCGCTGTTTTGCAGTTCTAC 扩增 UBI
P22 AACATAGGTGAGGCCGCACTT
151
UBI amplification
P23 CTCGGCAACGGATATCTCGGCTCT 扩增 5S rRNA
P24 CTAATGGCTTGGGGCGCAACTTG
110
5S rRNA amplification
P25 TGACAGAAGAGAGGGAGCAA 78 扩增 miR156
P26 ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG miR156 amplification
注：下划线为添加的酶切位点，AAGCTT 为 HindⅢ，TCTAGA 为 XbaⅠ，GTCGAC 为 SalⅠ。
Note：AAGCTT，TCTAGA，GTCGAC underlined in primers indicates restriction enzyme sites of HindⅢ，XbaⅠand SalⅠ.


2 期 曹 雪等：葡萄 SPL9 和 SPL10 基因全长 cDNA 克隆、亚细胞定位和表达分析 243

用引物 P07/P08 和 P11/P12 进行 PCR 扩增分别获得基因 SPL9 和 SPL10 的 5′末端，反应参数和
反应体系同 3′末端扩增。以来源葡萄幼叶的 cDNA 为模板，利用引物 P13/P14 和 P15/P16 进行 PCR
扩增分别获得 SPL9 和 SPL10 的 ORF。反应体系、反应参数、回收、克隆与测序同上。
利用 DNAMAN 5.22 软件对 ORF、3′末端和 5′末端等 3 个序列进行拼接分析；核苷酸和氨基酸
序列分别利用 NCBI 的 BLASTn 和 BLASTp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行相似性分析；
用 DNAMAN 5.22 软件通过氨基酸序列分析葡萄 SPL9 和 SPL10 与其他植物的关系。
1.3 亚细胞定位载体构建及 35S-GW-GFP-HM018600/ HM018601-GFP 转化洋葱表皮细胞
分别从上面测序正确的 SPL9 和 SPL10 的 ORF 菌液中提取质粒，分别再用 SalⅠ和 XbaⅠ、Hind
Ⅲ和 XbaⅠ进行双酶切，用 T4 DNA 连接酶连接到 pJIT166-GFP 载体从而得到 35S-GW-GFP-
HM018600/HM018601-GFP 融合表达载体，转入 DH5α，PCR、酶切筛选阳性克隆，并对阳性克隆
进行测序验证。
DNA 的钨粉包埋按照 Biolistic PDS-1000/ He Particle Delivery System 的方法（徐淑平和卫志明，
1998）。取钨粉悬液 50 μL（50 mg · mL-1），加入 50 μL 的 CaCl2（2.5 mol · L-1），20 μL 亚精胺（0.1
mol · L-1），5 μg 的载体质粒充分混匀，12 000 r · min-1 离心 1 min，冰上静置 15 min，分别用 70%
乙醇和无水乙醇洗涤沉淀 1 次，重新悬浮沉淀于 50 μL 无水乙醇中。
将幼嫩的洋葱表皮摆放在 MS 高渗培养基上，25 ℃预培养 4 h。选用 1 100 psi 的压力膜，将 20
μL 钨粉 DNA 混合物点在轰击膜中央，洋葱表皮（约 1 cm ×1 cm 的小块）放在 10 g · L-1 琼脂培养
基上，采用 PDS1000/He 型基因枪（Bio-Rad）进行轰击，轰击距离 6 cm，真空度为 25 in.Hg。轰击
后的洋葱表皮 25 ℃暗培养 24 h 后制片，于激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP2）下观察细胞中的荧
光。将转化后的洋葱表皮用 20%蔗糖进行质壁分离处理后，再分别用蓝光（395 nm）和紫外光激发
成像，选用 B（IF2490）激发滤光器，用 PM230 全自动显微照相装置拍照。
1.4 葡萄 Vv-SPL9、Vv-SPL10 基因及 miR156 的表达分析
分别提取葡萄成熟叶、幼叶、花蕾、花、小果、中果及大果等组织的总 RNA，并分离 LMW RNA
（张彦苹 等，2010）。以反转录后的 cDNA 为模板，用 Primer 3 Input（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）
设计引物 P17/P18 和 P19/P20，分别研究 SPL9 和 SPL10 在不同组织中的表达情况。内标基因利用葡
萄 UBI（GenBank accession number：XM_002266714）的特异性引物 P21/P22 进行测定。另以 5S（特
异性引物 P23/P24）为内标基因，利用 P25/P26 检测 miR156 在相应组织中的积累情况。
2 结果与分析
2.1 葡萄 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 基因 cDNA 全长的电子克隆
根据拟南芥的 SPL9 基因序列 AT2G42200 和 SPL10 基因序列 AT1G27370，经 BLAST 检索，分
别得到葡萄高相似的 EST 序列 EC934615 和 CB970427，然后以此序列作为种子序列在葡萄 EST 数
据库中再进行 BLAST 检索，将检出的与种子序列同源性较高的或有部分重叠的 EST 序列
（EV239750、EC934615、EV241638、GR905745、EC989040、CF413649、DT039919 和 EC940210、
EC926087、EE068129、EE067765、EE093085、DT022393、EE085683）拼接组装为重叠群（Contig），
再以此重叠群序列重复以上 BLAST 检索过程，反复进行 EST 重叠群序列的拼接和比对，尽可能获
得葡萄 SPL9 和 SPL10 的 cDNA 全长。
244 园 艺 学 报 38 卷
2.2 葡萄 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 基因 cDNA 全长的获得
以葡萄幼叶 cDNA 为模板进行克隆与测序，分别得到 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 基因的 3′末端（1 486
bp 和 1 656 bp）和 5′末端（502 bp 和 374 bp）。利用加入 SalⅠ和 XbaⅠ，Hind Ⅲ和 XbaⅠ酶切位点
引物 P13/P14 和 P15/P16，以葡萄幼叶 cDNA 为模板，克隆得到长度为 1 137 bp 和 1 398 bp 的全长
ORF。对 3′端、5′端以及 ORF 全长拼接分别获得葡萄 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 cDNA 全长为 1 649 bp
和 1 709 bp，分别有一个 1 134 bp 和 1 500 bp 完整的开放阅读框（ORF），163 bp 和 53 bp 的 5′非翻
译区（5′ UTR），352 bp 和 156 bp 的 3′非翻译区（3′ UTR）以及 32 bp 和 28 bp 的 poly+（A）尾，二
者还均有相同的 Vv-miR156a（5′-UGACAGAAGAGAGGGAGCAC-3′）的识别靶序列位点（5′-GUGCU
CUCUCUCUUCUGUCA-3′），且两者之间仅存在 1 个碱基的错配，符合 microRNA 与其靶位点序列
互补错配少于 3 个碱基的原则，进一步说明成功地从葡萄中分离得到了 SPL9 和 SPL10 的同源基因。
2.3 葡萄 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 氨基酸序列分析
由 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 的 ORF 区推导出它们分别编码 378 和 500 个氨基酸（图 1），将其氨
基酸在 NCBI 的 BLASTp 进行相似性比较，发现它们具有高度保守 SBP 结构域序列，即含有 79 个
保守的氨基酸，内含两个锌指蛋白域和一个高度保守的双向核定位信号 KRXXXRRRK（Klein et al.，
1996；Birkenbihl et al.，2005）。
A
1 CTTGCTTTGTTGCCTTCACAAACTGCTTTTGAAACCCCCCACTCTTCTATCGGTATCTGTTGCTTTTGTCACTCTTTACACAAGTGTTTC
91 CTTTTCCCCTCTTTTCTATATCTTCGTGACCCACAAGAAAAATACCCATGAATGGACTCTAGGAGCGCCACAC
164 ATGGAAAGGGGTTCGAGCTCTTTGACCGTTTCCAGCTCTTCGGCCAACTCGTCTGAGTCGCTCAACGGGTTGAAATTTGGGCAGAAGATA
M E R G S S S L T V S S S S A N S S E S L N G L K F G Q K I
254 TATTTTGAAGATTTGGGTGTTGGAGCTCCGGCCAAATCGGGAACCGGGTCCTCCTCCTCCTCTGCCGCCGGCTCCGGTGGTCGCCCACCT
Y F E D L G V G A P A K S G T G S S S S S A A G S G G R P P
344 CCGGCGCCACCAAAGAAGGTAAGAGGTAGTGGGGTTGTTCAGGGAGGCCAACCACCGAGGTGTCAAGTTGAAGGGTGTAAAGTAGATCTG
P A P P K K V R G S G V V Q G G Q P P R C Q V E G C K V D L
434 AGTGATGCCAAAGCTTACTATTCAAGGCATAAAGTGTGTGGTATGCATTCGAAGTCTCCAACGGTCATTGTTGCGGGCCTTGAGCAGAGG
S D A K A Y Y S R H K V C G M H S K S P T V I V A G L E Q R
524 TTTTGCCAGCAGTGTAGCAGATTTCATCAGCTTGCCGAATTTGACCAAGGAAAACGAAGTTGTCGTAGGCGCCTGGCTGGTCATAATGAG
F C Q Q C S R F H Q L A E F D Q G K R S C R R R L A G H N E
614 CGTCGCAGGAAGCCACCACCTGGATCTTTATTGTCCTCACGCTATGGGCGACTTTCTTCATCCATTTTTGAAAACAGCAGCAGGGTGGGA
R R R K P P P G S L L S S R Y G R L S S S I F E N S S R V G
704 GGAGGCTTTCTGATGGACTTTGCTGCATACCCAAGGCATCCCGAGAGGGATACTTGGCCAACTACAAGAGCATCTGATCGGGTACCTGGA
G G F L M D F A A Y P R H P E R D T W P T T R A S D R V P G
794 AATCAAACCACTGCGATGGGAAGGTTTCTTCCACATCCATGGCAGAGCAACTCTGAGAATCCTCTCTTTCTGCAAGGTTCAGCAGGCGGG
N Q T T A M G R F L P H P W Q S N S E N P L F L Q G S A G G
884 ACCAGCTTTCATGGTCCTGGAATTCCTTCAGGAGAATGTTTCACAGGGGCCTCCGACTCAAGCTGTGCTCTCTCTCTTCTGTCAAATCAG
T S F H G P G I P S G E C F T G A S D S S C A L S L L S N Q
974 CCATGGAGCTCCAGGAATCGAGCATCTGGTCTTGGAGCAAACAGCTTCATGAATCCTGAAGGGGCATCCATGGCGCAACCCACAGCTCCT
P W S S R N R A S G L G A N S F M N P E G A S M A Q P T A P
1064 CATAGTGCAGCTATCAATCACTTCCCAAGCACCTCGTGGGATTTCAAGGGCAATGAAGGTAGTAGCAGTTCGCAGGAGATGCCACCTGAT
H S A A I N H F P S T S W D F K G N E G S S S S Q E M P P D
1154 CTTGGTCTTGGTCAAATTTCACAGCCTATTAATAGCCAGTTCTCAGGTGGGGGCGAGTTGCCCCAACAGAGTGGAAGGCAATACATGGAA
L G L G Q I S Q P I N S Q F S G G G E L P Q Q S G R Q Y M E
1244 CTCGAGCACTCCAGGGCTTATGACTCTTCCACTCAGCAGATGCACTGGTCACTTTAGGTGCCAACTTCCCATTTGGTTTGTATGAACACC
L E H S R A Y D S S T Q Q M H W S L *
1334 TTTAACAGCTTTGGTTCAAAAAAGTACTTACGAATATCTTTCAGGGGGATACCTCCTGATCCCAATTTTGTTAGGAGAAAACCCAAATGG
1424 TTCATGATCATTGTTTTGCTGGGAAAAACCTAAATGGTTCTTGATCTTTGTTTTTGAGACTTAAATGGGGGGTGATTTTTGTTTTGCTGG
1514 GAGACCTTAATGGCTGTTATCTGTGCTTGGTTTGAGTTTCTCAATATTGAGAAGCAAAAAAAAGCTTGTTAAAATTGCTCTTAATAAGAT
1604 CATAAGACCTTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
2 期 曹 雪等：葡萄 SPL9 和 SPL10 基因全长 cDNA 克隆、亚细胞定位和表达分析 245

B
1 GCCTACAGACGGAAGATGCTGTTTGAATTCTTTTCATGAGGTTTCTTTCTGTG
54 ATGGAGTGGAATTTAAGAACTCCCTCAGAATGGGACTGGGAGACCCTAACAGCGTTTAATACTAGGGCTTTCGAATTTCCTGGGCGGGTA
M E W N L R T P S E W D W E T L T A F N T R A F E F P G R V
144 CAACTGTCAAACCATGATATTGAAGTAGATGGAGGGGTGGATAATGGATCTGTATACTCATCTGGAGGTGGTGGCTTCTCTGGTTCTGAT
Q L S N H D I E V D G G V D N G S V Y S S G G G G F S G S D
234 TTGGGTCATGGCTCTTCTTCCAGGAGCTCCATCTCTGTTTCAGGTGATTCTTCGTTGAAAGAGGGAATAAAGAAATTTAGGAATGTTGAA
L G H G S S S R S S I S V S G D S S L K E G I K K F R N V E
324 GATATTCATAAAGATTTTAGTGAGAACAAAGAGTTGATAAGAGTGGGCGGTAGTGGAAATTGTCCGACTGTAGGGACTTCTGATGGCTCT
D I H K D F S E N K E L I R V G G S G N C P T V G T S D G S
414 GGTGAAGCAATGATTGGTTTAAAACTGGGGAAGCGGCCTTACTTTGAAGATGTTTGTGCCGCTAGCACCGCTAAAACTACAACTTCTTCT
G E A M I G L K L G K R P Y F E D V C A A S T A K T T T S S
504 GTCAATCCTGCATCATCTGTTTCTGCAACAAAGCGATTTAGAACATCTTATCAGAGTTCGCAAACCCCTCGTTGCCAAGTTGAAGGATGC
V N P A S S V S A T K R F R T S Y Q S S Q T P R C Q V E G C
594 AACCTTGACCTCAAGTCAGCTAAGGATTACCATCGCAGGCATAGAATCTGTGAAAACCATTCCAAAAGCCCCAAGGTCATTGTAGCTGGT
N L D L K S A K D Y H R R H R I C E N H S K S P K V I V A G
684 TTGGAGCGCCGGTTTTGTCAACAGTGCAGCAGGTTCCATGAGTTGACAGAGTTTGATGACAAGAAGCGAAGTCGTCGTAGGCGCCTCAAT
L E R R F C Q Q C S R F H E L T E F D D K K R S R R R R L N
774 GACCACAATGCACGGCGCCGCAGGCCACATCCAGAGTCAATCCAATTTAGCTCTGGAAGGCTGCCTTCATCACTATATGATGGCAGACAG
D H N A R R R R P H P E S I Q F S S G R L P S S L Y D G R Q
864 CAGATTAATCTTGCATGCAACAGGTTACCAATCCCTGTTGCAACTCCTATGTGGCAAAATCCATGCAGCTTTAAGGACACCCAGACTGGA
Q I N L A C N R L P I P V A T P M W Q N P C S F K D T Q T G
954 GGTTCTTTGATTAGGCCTGTAAAAGCAGTAGGCATTGATAAGCAGCTGCATTTGCCCACTGATGAGATGCCGGATGCTATTTCTATGCTA
G S L I R P V K A V G I D K Q L H L P T D E M P D A I S M L
1044 CATGTTAACTCAGAGAGGATGTTGTCTTTTGATGGCAGTACACCTCGGGTCCTTAACCAAGGTTTAGAGGCATCTGCAATTGCTTCTAAT
H V N S E R M L S F D G S T P R V L N Q G L E A S A I A S N
1134 TCAAATGTAGCACCAGATTTCCGGCGTGCTCTCTCTCTTCTGTCAACTAATTCTTGGGGTTTGAATGATCCTGGACCTACTTCTTTGGAC
S N V A P D F R R A L S L L S T N S W G L N D P G P T S L D
1224 CAGCTCATGCATGTAAACCAATCCAGCATGGCCCAGCCCACGATGCATGTTGAACCACACAATTGGGCTCTTGCTTCATCAGAAAATATG
Q L M H V N Q S S M A Q P T M H V E P H N W A L A S S E N M
1314 CACGTTCAACAAACACCTTCAGAGATTCGGGGACATTCATTGGATTTGCATAATAATGAAGCAGCATGTTTCAAGAGTTTCAATTATTTA
H V Q Q T P S E I R G H S L D L H N N E A A C F K S F N Y L
1404 AAGCCCCTTATGAGTCTGGCTGTTTTTATCCCAATCAAATTAACTGAGAACCAAGTTTGCTTCCAGTGTCAAAAAGAACTGCAAATAAAG
K P L M S L A V F I P I K L T E N Q V C F Q C Q K E L Q I K
1494 TGTAGTCCGTGTGATGCATTGGAGAAAGCAATAATGGGGATTAGGATGCCTTTTGTCCATTGATCCAAAATATTTTTTCAAATGTATAAT
C S P C D A L E K A I M G I R M P F V H *
1584 GTGTGTTAGAAACAAGACAATGCACCTGCATTATGGTTGAATCCGTTTGTTTCATGGAAAGTGAGTTTTTTTCATGGCTTCTTGCCGTCA
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图 1 Vv-SPL9（A）和 Vv-SPL10（B）cDNA 全长与推导的氨基酸序列
灰色突出显示为 SBP 结构域；方框为两个锌指蛋白域 Zn-1 和 Zn-2，分别含有保守的半胱氨酸和组氨酸用波浪线表示；
粗线表示双向核定位信号 KRXXXRRRK；下划线是 microRNA156a 的识别位点。
Fig. 1 Nucleotide sequence of complete Vv-SPL9（A）and Vv-SPL10（B）cDNA and their deduced amino acids
SBP domain is Highlighted in gray；The two boxes stand for the two zinc finger protein domain Zn-1 and Zn-2 respectively，which containing
conserved cysteine and histidine underlined；Wave line is bi-directional nuclear localization signal KRXXXRRRK；
Underlined regions are the complementary sequences of Vv-miR156a recognition sites.

BLAST 结果显示葡萄 Vv-SPL9 与杨树（XP_002322678）的同源性较高，达到了 66%，与拟南
芥（AAK76681）和玉米（NP_001136945）的同源性分别为 47%和 44%，而葡萄 Vv-SPL10 与杨树
（XP_002304686）的同源性较高，为 50%，与拟南芥（CAB56577）和玉米（NP_001145727）的同
源性分别为 37%和 41%。用DNAMAN 5.22软件对葡萄Vv-SPL9氨基酸序列与杨树（XP_002322678）、
金鱼草（CAB56570）、拟南芥（AAK76681）、柑橘（ACL51015）、苜蓿（ABN08632）、蓖麻
（XP_002532343）、高粱（XP_002444771）、玉米（NP_001136945），以及对葡萄 Vv-SPL10 氨基酸
246 园 艺 学 报 38 卷
序列与蓖麻（XP_002514905）、玉米（NP_001145727）、拟南芥（CAB56577）、大豆（ACU18328）、
桉树（BAH80551）、杨树（XP_002304686）、水稻（EAY84676）、小立碗藓（ABM67305）氨基酸
序列进行分析（图 2）获得了类似结果：葡萄 Vv-SPL9 与杨树同源基因关系较近，Vv-SPL10 则与玉
米、水稻等的同源基因关系较近。以上结果表明不同植物中 SPL9 和 SPL10 的同源基因所编码氨基
酸序列存在差异，致使其功能也可能不同。

图 2 Vv-SPL9（A）与 Vv-SPL10（B）推导的序列与多种植物氨基酸系统树
Fig. 2 Phylogenetic tree of the amino acid sequence of Vv-SPL9（A），Vv-SPL10（B）and their homologues in other plants
2.4 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 GFP 表达载体的构建与亚细胞定位
在融合基因表达载体构建完成后，对载体目标区域进行测序验证，插入片段与预期序列完全一
致，表明载体构建成功。为了确定相关基因表达的蛋白在细胞中发挥功能的具体部位，构建了绿色
荧光蛋白与基因的融合表达载体，利用基因枪法将这两个基因 ORF 分别插入到 35S 启动子和绿色荧
光蛋白基因之间形成融合蛋白（GFP）基因，转化到洋葱表皮细胞中，获得高效瞬时表达，绿色荧
光蛋白在 475 nm 蓝光激发下产生 509 nm 的绿色荧光。由图 3 可以看出两者都仅在核内产生绿色荧
光，即表明 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 均具有核定位功能。
图 3 Vv-SPL9（A）与Vv-SPL10（B）融合蛋白在洋葱表皮细胞中的定位
Fig. 3 Subcellular localization of Vv-SPL9（A）and Vv-SPL10（B）proteins in onion epidermal cells
2 期 曹 雪等：葡萄 SPL9 和 SPL10 基因全长 cDNA 克隆、亚细胞定位和表达分析 247

2.5 Vv-SPL9、Vv-SPL10 及 miR156 在葡萄不同组织中的表达分析
半定量和荧光定量 RT-PCR 检测结果（图 4）基本一致，Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 在不同组织间均
有表达，但表达水平存在较大差异。两者均在小果中的表达量较高，在中果及大果中表达量渐弱。
Vv-SPL9 除在果中表达量高外，在幼叶中也有较高表达，在花蕾中的表达较低。Vv-SPL10 在幼叶与
花蕾中的表达量差异不大，而在成熟叶中表达很低，这就说明 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 可能参与葡萄
营养器官与生殖器官的发育，其中与葡萄果实的生长发育关系尤为密切。
鉴于二者均含有 Vv-miR156a 的识别靶序列位点的特点，为探讨 miR156 是否参与了这两个基因
表达，本研究应用荧光定量 PCR 方法检测了 miR156 在各个组织中的积累水平。研究结果发现，
Vv-miR156 在小果中的积累水平最低，花蕾及花次之，在幼叶中的积累量较多，且 Vv-miR156 与这
两个侯选靶基因的表达存在一定的消长关系，而以小果中的情况最为明显。由此可以推测 miR156
可能调控这两个基因的表达，并且其调控作用的发生可能具有一定的时空性。
图 4 Vv-SPL9（A）、Vv-SPL10（B）和 miR156（C）在不同组织中的表达
1 ~ 7 分别是成熟叶、幼叶、花蕾、花、小果、中果、大果样品。
Fig. 4 Expression of Vv-SPL9（A），Vv-SPL10（B）and miR156（C）in different tissues of grapevine
1. Mature leaf；2. Young leaf；3. Flower bud；4. Flower；5. Small fruit；6. Middle size fruit；7. Large size fruit.
248 园 艺 学 报 38 卷
3 讨论
拟南芥转录因子数据库 DATF 中部分为植物特异转录因子家族，至今只在植物中发现。SBP 基
因家族就是一个植物特异转录因子家族，首先是在金鱼草中发现的，之后在拟南芥和苔藓上发现有
多个 SBP 转录因子基因拷贝（Cardon et al.，1999；Riese et al.，2007），它们都具有 DNA 结合结构
域的保守核苷酸序列，即 SBP 结构域（SBP-domain），含 79 个氨基酸残基。Yamasaki 等（2004）
发现该类基因均含两个锌指结构（Zinc finger），可能为双向核定位信号（nuclear localization signal，
NLS）（Birkenbihl et al.，2005）。本研究中从葡萄幼叶的 cDNA 中成功分离出 SPL9 和 SPL10 的同源
基因 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10，由测序结果看出两个基因编码的蛋白质均具有 SBP 转录因子的典型特
征，即含有保守性很高的两个识别并结合 DNA 顺式作用元件的花分生组织启动子 SBP 结构域、两
个锌指蛋白域 Zn-1 和 Zn-2，分别含有保守的半胱氨酸和组氨酸和一段双向核定位序列
KRXXXRRRK（Klein et al.，1996；Birkenbihl et al.，2005），并且具有 VvmiR156a 识别位点，这与
拟南芥上相关研究相一致，其表达在一定程度上受 microRNA 调控。本研究通过构建
35S-GW-GFP-HM018600/ HM018601-GFP 的融合表达载体，利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱
内表皮进行亚细胞定位，结果表明其表达的蛋白定位于细胞核中，说明 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 的编
码产物亦为转录因子，具有核定位功能。
对拟南芥的研究证明，所有的 SPL 基因在生长发育和形态建成过程中起调控作用（Yang et al.，
2008；Wang et al.，2008，2009；Wu et al.，2009）。除拟南芥外，SBP 转录因子促进花和果实发育
在白桦、西红柿上也有报道（Lännenpää et al.，2004；Manning et al.，2006）。本试验半定量及荧光
定量研究结果证明 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 在葡萄花器官形成、果实发育等生长发育阶段都具有一定
表达，其中在小果表达量最高，说明其与小果的发育联系最为密切。Vv-miR156a 积累水平的研究表
明其在葡萄各个组织中也存在着一定差异，在小果中积累水平最低。结合 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 的
表达情况，发现其与这两个基因在葡萄不同组织的表达存在一定的消长关系，可以推测 miR156 可
能调控这两个基因的表达，并且是以调控靶基因降解或抑制靶基因翻译的方式起作用，该调控具有
一定的时空性。
为了更好地认识 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 的功能，将利用已经构建的 Vv-SPL9 和 Vv-SPL10 正义和
反义表达载体转化葡萄开展进一步的功能研究。

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