全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（6）：1080–1088 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–01–17；修回日期：2014–05–28
基金项目：国家自然科学基金项目（31272136）；陕西省重点科技创新团队葡萄种质资源与育种应用项目（2013KCT-25）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wangxiping@nwsuaf.edu.cn）
葡萄白粉病菌应答基因VpSTART的克隆及表达
分析
闫筱筱 1，侯鸿敏 2，焦 晨 1，王西平 1,3,*
（1 西北农林科技大学园艺学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100；2 青岛农业大学园艺学院，
山东青岛 266109；3 农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点开放实验室，陕西杨凌 712100）
摘 要：在前期获得葡萄白粉病菌应答基因 VpSTART 的 EST 基础上，采用 RACE 和 RT-PCR 技术克
隆该基因 cDNA 全长序列。VpSTART 全长 1 321 bp，3′端非编码区 114 bp，包含一个 1 206 bp 开放阅读框，
编码 401 个氨基酸。VpSTART 蛋白分子量为 45.3 kD，与欧亚种葡萄、玉米、拟南芥、蒺藜状苜蓿和蓖
麻的蛋白同源性分别为 99%、64%、58%、46%和 25%。实时荧光定量 PCR 表明，VpSTART 在‘商–24’
葡萄花序、卷须和茎中表达量较高；感白粉病的‘湖南–1’葡萄叶片接种白粉病菌后 VpSTART 表达量与
对照没有显著差异，而抗白粉病的‘商–24’葡萄接种 12 h 后 VpSTART 表达量增加，在 24 ~ 96 h 表现显
著性差异；用 SA、MeJA 和 Eth 等不同信号分子分别处理‘湖南–1’和‘商–24’葡萄叶片 1 ~ 48 h 后，
VpSTART 基因的表达受 SA 负调控，受 MeJA 和 Eth 正调控。
关键词：葡萄；白粉病菌；VpSTART；基因克隆；表达分析
中图分类号：S 663.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1080-09

Cloning and Expression Analysis of Powdery Mildew Fungus Responsive
Gene VpSTART in Grape
YAN Xiao-xiao1，HOU Hong-min2，JIAO Chen1，and WANG Xi-ping1,3,*
（1College of Horticulture，State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas，Northwest A & F University，
Yangling，Shaanxi 712100，China；2College of Horticulture，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，
China；3Key Laboratory of Horticultural Crop Biology and Germplasm Development in Northwest China，Ministry of
Agriculture，Yangling，Shaanxi 712100，China）
Abstract：Based on previous EST sequence of grape powdery mildew fungus responsive gene
VpSTART，a full-length cDNA sequence was cloned through RACE and RT-PCR technologies in this study.
The full-length cDNA of VpSTART was 1 321 bp with 114 bp 3′UTR，contained a 1 206 bp open reading
frame encoding 401 amino acids residues. VpSTART protein showed a calculated molecular weight of
45.3 kD，and shared 99%，64%，58%，46% and 25% homology with that of Vitis vinifera，Zea mays，
Arabidopsis thaliana，Medicago truncatula and Ricinus communis. Real-time quantitative PCR indicated
the expression level of VpSTART was high in inflorescence，tendril and stem of Shang-24 grape
abundantly；Accumulation of VpSTART transcripts in Hunan-1 grape leaf that is susceptible to powdery

6 期 闫筱筱等：葡萄白粉病菌应答基因 VpSTART 的克隆及表达分析 1081

mildew showed no significant difference with that in contrast after E. necator inoculation，while the
accumulation increased in Shang-24 grape for 12 h that is resistant powdery mildew and showed a
significant difference during 24–96 h inoculation；After 1–48 h treatment with SA，MeJA and Eth signal
molecules in Hunan-1 and Shang-24 grape leaf，the expression patterns of VpSTART showed negative
regulation by SA，positive regulation by MeJA and Eth.
Key words：grape；powdery mildew；VpSTART；gene clone；expression analysis

自 1985 年首次指出类固醇激素合成急性调节基因（StAR）响应在合成类固醇激素的组织后，动
物体内该蛋白的合成途径与调控关系得到了深入研究（Liza & Nanette，1985，1986；Linda & Nanette，
1991）。StAR 基因在小鼠 MA-10 细胞中被克隆研究后命名为 steroidogenic acute regulatory protein，
简称 StAR（Douglas & Thomas，1991；Barbara et al.，1994）。StAR 基因在人类、小鼠、鸟类、脊椎
动物和鱼类等有高度的保守性（Meng et al.，1995；Sugawara et al.，1995；Bauer et al.，2000），后
来在鸡、短尾猴、牛、鼠和绵羊等相继被克隆并深入研究（Walter，2007）。StAR 蛋白促进胆固醇
从线粒体外膜转运到内膜，其作用于应答元件结合蛋白 CREB 和应答元件 CRE 来激活 cAMP
（Maheshinie et al.，2013）。StAR 蛋白羧基端 210 个氨基酸被称为 StAR 相关转运结构域（START）。
研究表明，START 结构域被确认是一种功能宽泛的脂类结合结构域，可以参与防止蛋白酶水解，有
的参与脂质转运、信号转导及转录调控等过程，也能参与植物胁迫与病原菌反应（Lakshminarayan et
al.，2001）。
研究表明植物比动物更加富集 START 结构域，拟南芥、水稻、小麦、高梁和细菌等中存在包
含 START 结构域的相关基因。对小麦 Yr36（WKS1）基因通过图位克隆等方法分析发现该基因中存
在 START 结构域，并表明该结构域的作用提高了小麦在一定温度范围内对条锈病的抗性（Fu et al.，
2009）。马媛媛等（2005）的研究表明，START 基因对动物和植物的生理和发育的调控极为重要，
动物体内含有与其结合的核受体，但在植物中只在细胞质膜上发现了类似的受体，这表明 START 基
因参与植物信号与动物信号的转导机制可能不同。
葡萄白粉病（Erysiphe necator）是世界葡萄生产上重要真菌病害之一（Wan et al.，2007），起源
于中国的野生葡萄资源对白粉病具有很高的抗性（王跃进和贺普超，1997），因而挖掘白粉病抗性基
因具有重要的理论意义和实践价值。本研究在前期通过 mRNA 差异显示技术获得中国野葡萄华东葡
萄白粉病病菌诱导应答基因 VpSTART 的 EST 基础上，采用 RACE 与 RT-PCR 技术，进行中国野生
葡萄 VpSTART 克隆和不同组织表达特异性，不同信号分子、逆境胁迫下的表达分析，为深入了解
VpSTART 基因功能提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
中国野生华东葡萄抗病株系‘白河 35-1’（Vitis pseudoreticulata‘Baihe-35-1’）、华东葡萄感病
株系‘湖南–1’（V. pseudoreticulata‘Hunan-1’）和毛葡萄抗病株系‘商–24’（V. heyneana ‘Shang-24’）
种植于西北农林科技大学园艺学院葡萄种质资源圃（陕西杨凌）。于 2012 年 6—7 月取‘商–24’葡
萄的根、茎、叶、完全开放的花序、卷须和花后 33 d 的果实作为组织表达分析的材料。
2012 年 6 月采用人工压片法用白粉病菌分别接种处理‘湖南–1’和‘商–24’葡萄幼嫩叶片
（Wang et al.，1995），以无菌水处理为对照。分别于接种后 6、12、24、48、72、96 和 120 h 收集
1082 园 艺 学 报 41 卷
样品。2012 年 6 月使用 100 µmol · L-1 水杨酸（SA）、50 µmol · L-1 茉莉酸甲酯（MeJA）和 0.5 g · L-1
乙烯（Eth）分别处理‘湖南–1’和‘商–24’葡萄幼嫩叶片（Wen et al.，2012），以无菌水为对照，
处理后 1、6、12、24 和 48 h 收集样品。以上每个处理选择 15 株生长一致的葡萄材料，每重复 5 株，
共 3 个重复。以上样品于–80 ℃长期保存。
1.2 RNA的提取及纯化
总RNA提取与纯化采用SDS/酚法（张今今 等，2003）。利用 JASCO核酸微量分光光度计（V-550）
测量吸光值，记录浓度（ng · µL-1）、计算 A260/A280 和 A260/A230，用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA
的完整，并于–80 ℃长期存放。
1.3 5′RACE及 VpSTART克隆
根据前期研究获得的 START 基因 EST 序列（登录号 FG269366）设计 5′RACE 引物 GSP1：5′-
CGTACATATCCCTTCTGTCGTGATGCCA-3′。按照 Clontech SMARTTM RACE 试剂盒合成 5′RACE
cDNA 第一链，然后进行 RACE PCR 扩增，PCR 反应条件为 94 30 s℃ ，72 3 min℃ ，2 次循环；94
30 s℃ ，68 30 s℃ ，72 3 min℃ ，5 次循环；94 30 s℃ ，64 30℃ s，72 3 min℃ ，5 次循环；94 30 ℃
s，61 30 s℃ ，72 3 min℃ ，25 次循环；72 10 min℃ 。PCR 产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，使
用天根公司DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，回收产物连接到pGEM-T Easy载体，转化E. coli DH
5α 感受态细胞，筛选阳性克隆，酶切鉴定，最后送至华大公司进行测序验证。
将 VpSTART 基因 5′RACE 全长序列与 EST 序列拼接，获得 VpSTART 基因全长 cDNA 序列，利
用 Primer 5.0 软件设计 VpSTART 基因引物 ORF-F：5′-ATGGGGGTGGAAAAAGTGAGGT-3′，ORF-R：
5′-ACTACATGCTGTATGCAGGGCT-3′。利用提取的‘白河 35-1’总 RNA，反转录得到 cDNA 第一
链，产物稀释 6 倍后于–40 ℃保存。采用 PCR 反应条件为 94 5 min℃ ；94 30 s℃ ，58 2 min℃ ，
72 30 s℃ ，35 次循环；72 10 min℃ 进行 VpSTART 克隆测序。
1.4 生物信息学分析
使用 DNAStar 软件进行基因序列拼接，根据 ORF Finder 程序预测序列的开放阅读框 ORF 区域
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），并分析 VpSTART 基因保守结构域（http://prosite.expasy.
org/和 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）。根据葡萄基因组网站进行 VpSTART 基因
的染色体定位（http://www.genoscope.cns.fr/spip/-Vitis-vinifera,370-.html）。利用 NCBI 数据库进行
BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析，并进行进化和蛋白多序列比对分析。利用 Prosite
数据库（http://www.expasy.org/tools/）分析蛋白质的理化性质，使用 ProtParam 程序（http://web.expasy.
org/protparam/）预测氨基酸分子量。
1.5 VpSTART实时荧光定量分析
根据 VpSTART 基因序列用 Primer 5.0 软件设计定量引物 RT-F：5′-TCGAAACCTCTGCTGCA
AGT-3′，RT-R：5′-TGTCTCAACTTTGCCCGCTT-3′。以葡萄 VvActin1（GenBank 登录号：AY680701）
为内参基因，引物为 Actin-F：5′-GATTCTGGTGATGGTGTGAGT-3′，Actin-R：5′-GACAATTTCCC
GTTCAGCAGT-3′。实时荧光定量 RT-PCR 按照 TaKaRa 公司 SYBR-Green 试剂盒进行。按照说明书
配制 20 µL 反应体系：SYBR® Premix 10.0 µL，上、下游引物（10.0 µmol · L-1）各 0.8 µL，cDNA 1.0
µL，Sterile Water 7.4 µL。在 IQ5 荧光定量 PCR 仪上进行 PCR 扩增，反应条件为 95 3 min℃ ；95 ℃
10 s，60 30 s℃ ，72 30 s℃ ，40 次循环；在 72 ℃延伸步骤收集荧光信号，重复 3 次。结果由 SPSS
Statistics17.0 软件进行数据分析，显著性差异分析使用 LSD 法。
6 期 闫筱筱等：葡萄白粉病菌应答基因 VpSTART 的克隆及表达分析 1083











图 1 VpSTART基因 5′ RACE
Fig. 1 5′ RACE PCR amplification of VpSTART

2 结果与分析
2.1 VpSTART基因的克隆
提取接种白粉病菌 48 h 的华东葡萄‘白河
35-1’叶片总 RNA，琼脂糖凝胶电泳检测，28S
与 18S RNA 带型清晰，28S 亮度为 18S 的两倍。
微量紫外分光光度计测定，A260/A280 的比值介于
1.9 ~ 2.0 之间，A260/A230 的比值大于 2.0，RNA
质量较高，完整性好。以该 RNA 为模板，反转
录合成 cDNA，用 GSP1 进行 5′RACE PCR 扩增。
取产物 10 µL 进行 1.2%的琼脂糖凝胶电泳，EB
染色后将目的片段回收，测序得到了 1 120 bp
的 cDNA 片段（图 1）。
获得的 cDNA片段和EST序列拼接得到一
条完整的序列。采用特异引物，以‘白河 35-1’的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，获得了 VpSTART
基因 cDNA 全长序列，全长为 1 321 bp，开放阅读框为 1 206 bp，3′端非编码区为 114 bp（图 2）。
图 2 VpSTART基因 cDNA序列及其编码的氨基酸
ATG 和 TGA 分别表示起始和终止密码子*。
Fig. 2 cDNA and deduced amino acid sequences of VpSTART
ATG and TGA respectively shows initiation codon and termination codon *.
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2.2 生物信息学分析
在葡萄基因组网站搜索 VpSTART 基因序列，结果显示 VpSTART 基因定位在第 9 条染色体，基
因登录号为 KJ546145。
在 Prosite 网站分析发现 VpSTART 基因具有 StAR-related lipid-transfer（START）结构域，该结
构域由 112 ~ 298 个氨基酸构成。
在 Prosite 网站上分析 VpSTART 蛋白的理化性质结果表明，该蛋白编码 401 个氨基酸，分子量
为 45.3 kD，理论等电点为 9.55，酸性氨基酸残基总数（Asp + Glu）为 38，碱性氨基酸残基总数
（Arg + Lys）为 57，其分子式为 C3470H5373N915O1038S37。
蛋白序列比对分析结果表明，VpSTART 蛋白与欧亚种葡萄、玉米、拟南芥、蒺藜状苜蓿和蓖麻
START 蛋白同源性分别为 99%、64%、58%、46%和 25%（图 3）。
图 3 VpSTART蛋白与近缘物种同源蛋白的多序列比对分析
VvSTART：欧亚种葡萄 CBI18373；AtSTART：拟南芥 NP568805；ZmSTART：玉米 BT064412；
MtSTART：蒺藜状苜蓿 XP003604116；RcSTART：蓖麻 XP002513295。
Fig. 3 Multiple sequence alignment of VpSTART protein and relative species homolog protein
VvSTART：Vitis vinifera CBI18373；AtSTART：Arabidopsis thaliana NP568805；ZmSTART：
Zea mays BT064412；MtSTART：Medicago truncatula XP003604116；
RcSTART：Ricinus communis XP002513295.


系统进化树分析（图 4）表明，双子叶植物 START 基因和单子叶植物的亲缘关系较远，如中国
野生华东葡萄与玉米。双子叶植物进化支系中华东葡萄 VpSTART 基因与欧亚种葡萄亲缘关系最近，
与拟南芥亲缘关系最远。

6 期 闫筱筱等：葡萄白粉病菌应答基因 VpSTART 的克隆及表达分析 1085

图 4 START基因的系统进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree of START gene

2.3 VpSTART基因在葡萄不同组织中的表达
VpSTART 基因在‘商–24’葡萄的根、茎、叶、花序、卷须和果实中均有表达。该基因在花序
中表达量最高，其次是卷须，在叶片和茎中也大量表达。花序和卷须中 VpSTART 基因的表达水平说
明了该基因还能参与花器官发育相关的信号转导（图 5），这也表现了类固醇激素能广泛参与植物发
育信号的感知和传导。










图 5 VpSTART基因在‘商–24’葡萄不同器官中的表达结果
Fig. 5 Result of VpSTART expression in different organs of‘Shang-24’grape

2.4 VpSTART基因在接种白粉病菌的葡萄叶片中的表达
如图 6 所示，抗病的葡萄‘商–24’接种白粉病菌 12 h 的表达量增加，接种 72 h 达到最大值，
较对照增加 1.5 倍，接种 24 ~ 96 h 的基因表达量较对照显著提高。而 VpSTART 基因在易感病的葡萄
‘湖南–1’接种白粉病菌的叶片中的表达量在接种 12 ~ 96 h 增加，但与对照都没有显著差异。
VpSTART 基因在抗病葡萄材料中的表达显著增加，说明该基因可以在白粉病侵染途径中发挥一定的
作用。








图 6 ‘商–24’和‘湖南–1’葡萄接种白粉病菌后 VpSTART的表达模式
Fig. 6 VpSTART expression pattern following powdery mildew treatment of Shang-24 and Hunan-1 grapes
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2.5 VpSTART基因在‘商–24’和‘湖南–1’葡萄不同激素处理后的表达
分别采用 100 µmol · L-1 SA、50 µmol · L-1 MeJA 和 0.5 g · L-1 Eth 处理‘商–24’和‘湖南–1’
葡萄，结果如图 7 所示。SA 处理‘商–24’葡萄 1 ~ 6 h 基因表达量较对照增加，1 h 时为对照的
1.82 倍，24 h 后开始降低，而 SA 处理‘湖南–1’葡萄后 VpSTART 表达量显著降低，其表现受到
负调控作用。MeJA 处理‘商–24’和‘湖南–1’后均表现为显著增加，‘商–24’中 VpSTART 表
达增加量比‘湖南–1’葡萄中的表达增加量大，两者都表现为受 MeJA 正调控作用。其中‘商–24’
葡萄的基因表达量较对照在 12 h 达到最大值，是对照的 3.68 倍，‘湖南–1’葡萄中在 1 h 达到最大
值，是对照的 2.97 倍。Eth 处理‘商–24’葡萄 1 ~ 48 h 表现显著上调，且处理后 12 h 达到最大值，
是对照的 2.49 倍，‘湖南–1’也表现显著上调，处理 48 h 后达到最大值，是对照的 2.11 倍，两者
表现为受 Eth 正调控作用。

图 7 水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯处理‘商–24’和‘湖南–1’葡萄后 VpSTART的表达模式
Fig. 7 VpSTART expression pattern following SA，MeJA and Eth treatments
of Shang-24 and Hunan-1 grapes
3 讨论
本研究中克隆获得中国野生华东葡萄 VpSTART 基因，全长为 1 321 bp，编码的蛋白含有保守的
START 结构域。同源比较发现，VpSTART 蛋白与欧亚种葡萄的同源性最高，与玉米的同源性为 64%，
与拟南芥的同源性为 58%，与蒺藜状苜蓿的同源性为 46%，与蓖麻的同源性最低。系统进化树分析
表明，华东葡萄与欧亚种葡萄为一个亚家族，其与拟南芥亲缘关系较远。拟南芥和水稻中分别存在
6 期 闫筱筱等：葡萄白粉病菌应答基因 VpSTART 的克隆及表达分析 1087

35 和 29 个包含 START 结构域的基因，分别有 21 和 17 个与同源结构域 HD 融合，这表明包含 START
结构域的基因在植物中具有重要作用（Kathrin et al.，2004）。基因结构研究发现，在多结构域蛋白
中，START 结构域结合配体后能调节并影响相互作用的其他结构域的活性及整体功能，如 Rho-gap
和同源 HD 结构域等（Lakshminarayan et al.，2001）。EDR2 基因由 START（PF01852）、PH（PF00169）
和功能不明确的 DUF1336（PF07059）结构域构成，拟南芥接种白粉病菌后发现 PH 结构域结合的
磷脂酰肌醇–4–磷酸阻止了信号传导，START 结构域结合脂类物质后的活性受影响，限制了植物
细胞程序性死亡发生（Tang et al.，2005a，2005b，2006；Sonja et al.，2007）。
Fu 等（2009）研究发现由 START 结构域构成的小麦 WKS1 基因在接种条锈病菌后表达上调，
WKS1 基因的 START 结构域在高温条件下结合脂类物质并引起构象发生变化，这种现象促使激酶作
用引起信号重叠而导致病原菌诱导小麦叶片细胞死亡，从而发挥抗条锈病的功能。本试验验证了
START 结构域的抗病功能，对‘湖南–1’和‘商–24’两种葡萄叶片接种白粉病菌后发现 VpSTART
基因在抗白粉病的‘商–24’葡萄中的转录水平明显升高，较对照最高增加 1.5 倍。
Sonja 等（2007）研究发现 edr2-6 突变体株系对胁迫反应很敏感，能激活 SA 反应且产生依靠
SA 途径的植株表现型，由 START 结构域参与的 EDR 基因作用于 MAPK 反应的顶端，负调节 SA
介导的抗病反应途径（Jörg et al.，1997；Catherine et al.，2001）。其他研究发现 SA、MeJA、Eth 等
信号分子参与的抗病反应都有脂类信号传导的参与，固醇类物质信号传导与 SA 途径相互负调控作
用，且 edr2 株系对乙烯引起的衰老反应有高度的敏感性（Ashis et al.，2004）。这与本试验不同信号
分子作用‘湖南–1’和‘商–24’两种葡萄的结果相同，VpSTART 受 SA 下调作用，处理后的抗白
粉病的‘商–24’葡萄较感白粉病的‘湖南–1’葡萄中基因表达量高，‘商–24’葡萄中基因表达
量在 1 h 增加 1.82 倍，‘湖南–1’葡萄处理 1 ~ 48 h 与‘商–24’葡萄处理 1 ~ 6 h 都存在显著差异。
MeJA 处理‘湖南–1’和‘商–24’两种葡萄后 1 ~ 48 h 表现显著性差异，‘商–24’葡萄中 VpSTART
表达量在 12 h 达到最大值，较对照增加 3.68 倍，‘湖南–1’葡萄在 1 h 达到最大值，较对照增加
2.97 倍。Eth 处理后‘湖南–1’葡萄中 VpSTART 表达量表现显著的正调控和正向增加，处理 48 h
后达到最大值增加 2.11 倍，‘商–24’葡萄中基因表达量表现显著上调，且处理后 12 h 达到最大值，
增加 2.49 倍。本研究为进一步探究 VpSTART 基因在葡萄抗白粉病途径中的调控机制提供理论依据。

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