全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（8）：1600–1608 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–03–18；修回日期：2013–05–21
基金项目：北京市科技计划研发攻关项目（YLHH201200109）；中国农业科学院与北京市大兴区科技合作项目（YLHH200900106）；农
业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：liuchun@caas.cn）
利用免疫磁性分离–PCR 检测安祖花细菌性枯
萎病病原菌
王 钊 1，储丽红 2，赵 凯 1，彭佳佳 3，明 军 1，袁素霞 1，刘 春 1,*
（1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 南京林业大学风景园林学院，南京 210037；3 宁夏大学农学院，
银川 750021）
摘 要：根据地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae）的
RAPD 序列设计特异性引物，并对羧基化磁珠的结合性能进行检验，从而建立和优化了免疫磁性分离–
PCR 体系，对安祖花细菌性枯萎病进行早期检测。结果表明：1 mg 磁珠对多克隆抗体最大吸附值为 0.268
mg，进行免疫磁性捕获时免疫磁珠的最佳浓度是 0.566 ~ 0.741 mg · mL-1。免疫磁性分离–PCR 可以减少
PCR 反应中的抑制物质，对 X. axonopodis pv. dieffenbachiae 的检测灵敏度可以达到 10 ~ 100 cfu · mL-1，比
常规 PCR 检测灵敏至少 100 倍。
关键词：安祖花；地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种；免疫磁性分离–PCR；最大吸附值；捕获率
中图分类号：S 682.1+4 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）08-1600-09

Detection of Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae in Authurium
andreanum by Immunomagnetic Separation-PCR
WANG Zhao1，CHU Li-hong2，ZHAO Kai1，PENG Jia-jia3，MING Jun1，YUAN Su-xia1，and LIU Chun1,*
（1Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2College of
Landscape Architecture，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China；3College of Agriculture，Ningxia University，
Yinchuan 750021，China）
Abstract：According to the RAPD of Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae，specific primers
were designed，and binding ability of carboxyl magnetic beads were tested. The system of optimization of
immunomagnetic separation-PCR（IMS-PCR）protocol for detecting the Bacterial Blight of Anthurium
were establisted. The results showed that the saturate absorption of 1 mg carboxyl magnetic beads to the
polyclonal antibodys is 0.268 mg. The optimal concentration of immunomagnetic beads（IMB）is 0.566–
0.741 mg · mL-1 when X. axonopodis pv. dieffenbachiae is captured. The detection sensitivity for X.
axonopodis pv. dieffenbachiae，by IMS-PCR which can reduce the inhibitory substances in reaction，is 10–100
cfu · mL-1. It is 100 times more sensitive than ordinary PCR at least.
Key words：Authurium andreanum；Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae；IMS-PCR；
sensitivity；saturation absorption；capture rate

8 期 王 钊等：利用免疫磁性分离–PCR 检测安祖花细菌性枯萎病病原菌 1601

安祖花（Authurium andreanum）细菌性枯萎病是由地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种
（Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae）引起的，该菌主要为害天南星科花烛属、花叶万年青
属、合果芋属的植物，尤其在花烛属安祖花上最为严重。受感染的植株首先在叶边缘和叶脉周围出
现水渍斑，之后感染区域逐渐变黄形成大的坏死斑。细菌通过植物的维管束组织扩散到植物生长点，
最终导致植物死亡。这种病害在黛粉万年青上第一次被记录（McCulloch &Pirone，1939），1981 年
安祖花细菌性枯萎病在夏威夷安祖花种植园大面积爆发，之后随着安祖花种植业的兴起，安祖花细
菌枯萎病也迅速蔓延到全球安祖花种植区域（Alvarez et al.，2006）。病原菌通过进口的安祖花种苗
进入中国，2003 年张荣意等（2003）首先在海南省发现，蒋桂芝和郭春雷（2003）在云南西双版纳
也报道了该种病原菌。该病害前期无任何症状，后期发病迅速，尚无有效药物控制，在安祖花种植
区域可造成 50% ~ 100%的种植量耗损，损失严重。
基于安祖花细菌性枯萎病发病潜伏期长的特点，建立一种灵敏有效的病原菌检测技术是控制病
害传播扩散的有效手段，在发病早期即可将带病植株发现并销毁，最大限度地确保植株盛花期健康
生长，减少病害所造成的经济损失。本研究中利用免疫磁珠结合普通 PCR，建立免疫磁性分离–PCR
（IMS-PCR）技术体系，快速灵敏检测安祖花细菌性枯萎病病原菌。
免疫磁珠（Immunomagnetic Beads，IMB）是指表面具有化学修饰的超顺磁性微粒与特异性多
克隆抗体结合，用以捕获富集特异性抗原的磁性微粒。以磁珠为载体，多克隆抗体与抗原在其上特
异性结合，形成的磁珠–抗原抗体复合物在磁场的作用下被吸附分离，再将抗原从复合物上洗脱下
来就达到了富集纯化的目的。将这种分离方法与 PCR 技术相结合可以更加灵敏特异地检测出标记有
目标 DNA 片段的抗原。这种结合免疫捕获，磁性分离和分子产物扩增的综合性检测技术在医学
（Chen et al.，2011）、食品（王晓闻和杨永莉，2009）等领域已成功应用，极大提高了对病原微生
物的检测灵敏度和准确度，但在植物病害检测领域还应用较少。本研究中以检测病害发生早期低密
度病原菌为目的，摸索植物病原微生物的 IMS-PCR 检测技术体系，供实际生产应用参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
试验于 2012—2013 年在中国农业科学院蔬菜花卉研究所完成。供试菌株安祖花细菌性枯萎病
标准菌株 X. axonopodis pv. dieffenbachiae（表 1，菌种编号 03522）和 9 株对照菌株来自中国农业微
生物菌种保藏管理中心，3 株安祖花细菌性枯萎病致病菌株 X. axonopodis pv. dieffenbachiae–
Xad_001、Xad_002、Xad_003 和 1 株对照菌株 X. axonopodis pv. begonia–Xab_001，由中国农业科
学院蔬菜花卉研究所从带病叶片中分离并保存（表 1）。所有菌株用 50%的甘油保存在–80 ℃环境
中。
感染 X. axonopodis pv. dieffenbachiae 病原菌的安祖花植株采自北京市大兴苗圃，健康的安祖花
植株采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所实验基地。羧基化磁珠购于河南惠尔纳米科技有限公司，
多克隆抗体由北京康为世纪生物科技有限公司制备。2× PCR MasterMix 反应试剂购于北京天根生化
科技有限公司。Bradford 蛋白测定试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司。
1.2 引物设计合成
通过 GenBank 中的 X. axonopodis pv. dieffenbachiae RAPD 序列（序列号为 AY923827.1），利用
Primer Premier5 设计。引物序列为 RAPD5-F：5′CAGGCAGCGGACTATCTC3′，RAPD5-R：5′CAGCAC
1602 园 艺 学 报 40 卷


表 2 不同浓度梯度多克隆抗体反应体系
Table 2 Different concentration gradient polyclonal antibody
reaction system
编号
No.
多克隆抗体
浓度/（mg · mL-1）
Polyclonal antibody
concentration
多克隆抗体
加入体积/μL
Volume of
polyclonal antibody
补充 PBS
体积/μL
Volume of
PBS buffer
1 0 0 50
2 0.2 5 45
3 0.4 10 40
4 0.6 15 35
5 0.8 20 30
6 1.0 25 25
7 1.2 30 20
8 1.4 35 15
TTGCGAATCTTG3′，扩增产物长 254 bp，位于该序列 191 ~ 444 bp 之间，由北京诺赛生物公司合成。

表 1 供试菌株
Table 1 Bacteria strains used in the test
编号
Number
菌种 Strains
04239 嗜麦芽寡养单胞菌 Pseudomonas maltophilia
01616 斯氏假单胞菌 P. stutzeri
02951 墨西哥假单胞菌 P. mexicana
10145 大肠杆菌 Escherichia coli
10049 野油菜黄单胞菌 X. campestris
03520 地毯草黄单胞菌猩猩木致病变种 X. poinssttiaecoli
03532 甘蓝黄单胞菌萎叶致病变种 X. campestris pv. betlicola
11705 黄单胞菌 Xanthomonas
03530 稻黄单胞菌稻白叶枯致病变种 X. oryzae pv. oryzae
03522 地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种 X. axonopodis pv. dieffenbachiae
Xad_001 地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种 X. axonopodis pv. dieffenbachiae
Xad_002 地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种 X. axonopodis pv. dieffenbachiae
Xad_003 地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种 X. axonopodis pv. dieffenbachiae
Xab_001 地毯草黄单胞菌秋海棠致病变种 X. axonopodis pv. begoniae

1.3 样品制备
1.3.1 菌悬液制备
X. axonopodis pv. dieffenbachiae 标准菌株在 NA 培养基上 28 ℃培养 48 h。挑取单菌落接种到 LB
液体培养基中，28 ℃ 200 r · min-1 震荡培养 24 h，取 3 mL 菌液，10 000 r · min-1 离心 1 min，弃上清
液，用无菌水将菌体配置成菌悬液母液（约 109 cfu · mL-1），用血细胞计数板测定菌体浓度。分别取
10 μL 菌悬液母液用无菌水（用于普通 PCR）和 PBS 缓冲液（用于 IMS-PCR，成分：NaCl 8.0 g，
Na2HPO4 1.15 g，KH2PO4 0.2 g，KCl 0.2 g，无菌水定容至 1 L，pH 7.4），将其稀释为 108、107、106、
105、104、103、102 和 10 cfu · mL-1 的菌悬液备用。
1.3.2 模拟带菌样液制备
取健康安祖花叶片 10 g，在无菌环境下切碎，分别用 50 mL 无菌水（用于普通 PCR）和 PBS
缓冲液浸泡（用于 IMS-PCR），在 100 r · min-1 的摇床上震荡 2 h，用无菌滤纸分离出浸提液，采用
1.3.1 的方法配制菌悬液母液，用上述两种浸提液制备 10 ~ 108 cfu · mL-1 的 10 倍浓度梯度模拟带菌
样液。
1.4 羧基磁珠对多克隆抗体最大吸附值的测
定
采用何磊等（2008）的方法并略加改动，进
行羧基磁珠对多克隆抗体最大吸附值的测定：
用碳二亚胺（EDC）和 N–羟基琥珀酰亚胺
（NHS）对羧基磁珠进行活化。取 5 μL（10
mg · mL-1）活化后的羧基磁珠为固定质量，加
入不同体积的多克隆抗体（浓度为 2 mg · mL-1），
用 PBS 缓冲液补充至 50 μL 配置成含有不同质
量浓度梯度的反应液（表 2），混合均匀后在 37
℃摇动孵化 3 h，进行磁分离后，吸取上清液，
8 期 王 钊等：利用免疫磁性分离–PCR 检测安祖花细菌性枯萎病病原菌 1603

采用 Bradford 蛋白测定试剂盒用酶标仪（SpectraMax M2/M2e）在 595 nm 波长下测定反应后上清液
中剩余多克隆抗体的浓度。应用公式 1 计算 1 mg 羧基磁珠对多克隆抗体的最大吸附值。
公式 1：1 mg 羧基磁珠对多克隆抗体的最大吸附值 =（吸附前多克隆抗体浓度–吸附后剩余多
克隆抗体浓度）× 反应总体积/羧基磁珠质量（mg）。
1.5 IMS-PCR 方法的建立
1.5.1 免疫磁珠制备
按照羧基磁珠使用程序，取 30 mg · mL-1活化后的羧基磁珠悬浮液 250 μL加入 1.5 mL离心管中，
加入 1 mL PBST（1 L PBS 缓冲液中加 Tween-20 0.5 mL）缓冲液洗涤 2 次，磁分离后加入 950 μL PBST
缓冲液，再加入 2 mg · mL-1 多克隆抗体 50 μL，室温下缓慢摇动反应 3 h。用 500 μL PBST 缓冲液洗
涤偶联上多克隆抗体的磁珠 2 次，加入 500 μL 含 1% BSA 的 PBST 缓冲液封闭磁珠 30 min。用 500
μL PBST 缓冲液洗涤封闭后的磁珠 2 次，再用 750 μL PBST 缓冲液重悬磁珠，最终磁珠浓度达到 10
mg · mL-1，4 ℃保存备用。
1.5.2 病原菌的捕获
吸取 1 mL 一定浓度的 PBS 缓冲液稀释菌悬液置于 1.5 mL 的离心管中，向离心管中加入制备好
的免疫磁珠悬浮液 60 μL，室温下缓慢摇动孵化 1 h，用磁分离架分离捕获到细菌的磁珠，用 PBST
缓冲液洗涤磁珠 3 次，再用无菌水洗涤 1 次，最后用 50 μL 无菌水重悬磁珠。磁珠重悬液用沸水加
热 15 min，5 000 r · min-1 离心 5 min，取上清液用于 PCR 反应，–20 ℃保存备用。
1.5.3 PCR方法建立
以 1.5.2 制备的上清液为模板 DNA 进行 PCR 扩增。优化后的 PCR 反应体系为：2 × PCR
MasterMix 12.5 μL，10 μmol · L-1 引物 RAPD5-F/RAPD5-R 各 0.5 μL，上清液 2.0 μL，加 ddH2O 至
25 μL 反应体积。PCR 反应参数如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；
72 ℃ 10 min 结束反应。取 6 μL 扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳 20 min（150 V），用紫外凝胶成像
仪拍摄 PCR 扩增产物电泳图。
1.6 免疫磁珠的捕获率检测
参照张体银等（2010）和唐倩倩等（2009）的方法检测免疫磁珠的捕获率。选取菌体浓度约为
106 cfu · mL-1 的 PBS 缓冲液稀释菌悬液作为检测菌液，对检测菌液适当稀释后进行菌落计数，计算
出准确的细菌悬浮液浓度。分别吸取制备好的免疫磁珠悬浮液（10 mg · mL-1）20、40、60、80 和
100 μL 加入 1.5 mL 的离心管中，向以上各管中加入上述检测菌液 1 mL，各管最终的免疫磁珠浓度
分别是：0.196、0.385、0.566、0.741、0.909 mg · mL-1，室温下缓慢摇动孵化 1 h，用磁分离架分离
捕获到细菌的磁珠，用 PBST 缓冲液洗涤磁珠 3 次，最后用 100 μL PBST 缓冲液重悬磁珠。将捕获
到细菌的上述不同浓度磁珠悬浮液进行 10 倍梯度稀释，取各稀释度磁珠悬浮液 100 μL，涂布在 NA
培养基上，进行平板菌落计数，重复 3 次。选取合适的稀释度统计免疫磁珠捕获细菌的菌落数。应
用公式计算免疫磁珠的捕获率和单位质量免疫磁珠捕获细菌数量。
公式 2：捕获率 = 磁珠捕获菌落数/待检测菌落数 = 同一稀释度下 3 个平板菌落数平均值 × 10 ×
稀释倍数/（检测菌液浓度 × 菌液体积）。
公式 3：单位质量免疫磁珠捕获菌落数 = 磁珠捕获菌落数/消耗磁珠质量（mg）。
1.7 IMS-PCR 特异性检测
将表 1 中的 10 株对照菌株和 4 株 X. axonopodis pv. dieffenbachiae 菌株按 1.3.1 中的方法进行活
1604 园 艺 学 报 40 卷
化扩繁，制备成 104 cfu · mL-1 浓度的 PBS 缓冲液菌悬液，采用 1.5 的方法进行 IMS-PCR，对 IMS-PCR
扩增结果进行检测。
1.8 IMS-PCR 和普通 PCR 灵敏性检测对比
1.8.1 菌悬液的检测
分别吸取用 PBS 缓冲液稀释的浓度为 108、107、106、105、104、103、102 和 10 cfu · mL-1 菌悬
液 1 mL 置于 1.5 mL 离心管中，采用 1.5 的方法进行 IMS-PCR 灵敏度的检测。以普通 PCR 灵敏度
检测为对照组试验，分别吸取 2 μL 用无菌水稀释的浓度为 108、107、106、105、104、103、102 和 10
cfu · mL-1 菌悬液作为扩增模板，采用 1.5.3 的方法进行普通 PCR 反应。
1.8.2 模拟带菌样液的检测
分别吸取用 PBS 缓冲液制备的浓度为 108、107、106、105、104、103、102 和 10 cfu · mL-1 模拟
带菌样液 1 mL 置于 1.5 mL 离心管中，采用 1.5 的方法检测 IMS-PCR 对模拟带菌样液的灵敏度。以
普通 PCR 检测带菌样液为对照组试验，分别吸取 2 μL 用无菌水制备的浓度为 108、107、106、105、
104、103、102 和 10 cfu · mL-1 带菌样液作为扩增模板，采用 1.5.3 的方法进行普通 PCR 反应。
1.9 安祖花样品检测
在安祖花种植基地随机采集无明显病症的安祖花叶片 10 份。每份称取 10 g，在无菌环境下切
碎，用 50 mL PBS 缓冲液浸泡并在 100 r · min-1 的摇床上震荡 2 h，分离出浸提液，采用 1.5 的方法
进行 IMS-PCR，以有明显病症叶片浸提液为阳性对照，以健康叶片浸提液为阴性对照，以无菌水代
替浸提液为空白对照，对安祖花的带菌情况进行检测。
2 结果与分析
2.1 羧基磁珠对多克隆抗体最大吸附值的测定结果
如图 1 所示，多克隆抗体浓度小于 1 mg · mL-1 时，羧基磁珠对多克隆抗体的吸附值随着多克隆
抗体浓度的增大而增大，说明在此范围内羧基磁珠并未达到吸附饱和。当多克隆抗体浓度大于 1 mg · mL-1
时，羧基磁珠对多克隆抗体的吸附值没有太大变化，达到最大吸附值。
应用公式 1 计算 1 mg 羧基磁珠对多克隆抗体最大吸附值为 0.268 mg。















图 1 羧基磁珠对多克隆抗体吸附值的变化
Fig. 1 Changes of absorption of carboxyl magnetic beads to the polyclonal antibodys
8 期 王 钊等：利用免疫磁性分离–PCR 检测安祖花细菌性枯萎病病原菌 1605

2.2 免疫磁珠的捕获率检测
试验结果表明对捕获细菌后的免疫磁珠悬浮液进行 103 倍稀释，适合菌落计数，待测 1 mL 细菌
悬浮液准确菌落数为 1.47 × 106 cfu。
应用公式 2 和公式 3 计算免疫磁珠的捕获率和单位质量免疫磁珠捕获菌落数，由表 3 可以看出，
随着免疫磁珠浓度的增加，免疫磁珠对细菌的捕获率不断提高，当免疫磁珠浓度到达 0.909 mg · mL-1
时，捕获率可达 85.42%。单位质量磁珠捕获菌落数随着免疫磁珠浓度的增大呈现出先增加再减少的
规律，浓度为 0.566 ~ 0.741 mg · mL-1 时单位质量磁珠捕获的细菌数量最多，此浓度范围是免疫磁珠
的最佳浓度配比。

表 3 不同浓度免疫磁珠捕获菌落数分析
Table 3 Analysis of colonies in different IMB concentration
免疫磁珠浓度/（mg · mL-1）
IMB concentration
捕获菌落数/cfu
Captured colonies
捕获率/%
Capture efficiency
单位质量磁珠捕获菌落数/（cfu · mg-1）
Colonies were captured by a unit mass IMB
0.196 0.24 × 106 16.27 1.20 × 106
0.385 0.59 × 106 40.00 1.47 × 106
0.566 0.93 × 106 63.05 1.55 × 106
0.741 1.21 × 106 81.70 1.51 × 106
0.909 1.26 × 106 85.42 1.26 × 106

2.3 IMS-PCR 的特异性检测
通过引物筛选获得了特异性较好的引物对RAPD5-F/R，将其和可以专一性结合X. axonopodis pv.
dieffenbachiae 菌体的多克隆抗体结合，进一步增加了 PCR 反应的特异性，试验结果表明，应用
IMS-PCR，可以从供试的 4 株 X. axonopodis pv. dieffenbachiae 菌液中扩增出 254 bp DNA 片段，其它
10 株对照菌株均无扩增产物生成（图 2），说明该方法可用于 X. axonopodis pv. dieffenbachiae 的检测。


图 2 IMS-PCR 的特异性检测
M：DNA marker；Blank：水。菌种编号同表 1。
Fig. 2 Specific detection by IMS-PCR
M：DNA marker；Blank：Water. The strains number is in Table 1.

2.4 IMS-PCR 灵敏度检测
IMS-PCR 扩增结果（图 3，A）表明，该方法可以检测浓度从 108 ~ 10 cfu · mL-1 的 X. axonopodis
pv. dieffenbachiae 菌悬液，检测的灵敏度可达到 10 cfu · mL-1。普通 PCR（图 3，B）扩增的下限只
能达到 103 cfu · mL-1。
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图 3 IMS-PCR 灵敏度检测（A）和普通 PCR 灵敏度检测（B）
M：DNA marker；Blank：水。
Fig. 3 The sensitivity of detection of IMS-PCR（A）and PCR（B）
M：DNA marker；Blank：Water.

采用 IMS-PCR可以使检测的灵敏度提高100倍，说明免疫磁珠对X. axonopodis pv. dieffenbachiae
有很好的捕获富集作用，在相同浓度的菌悬液中相对提高了 PCR 反应中细菌的浓度，使检测的灵敏
度提高两个数量级。
2.5 IMS-PCR 对模拟带菌样液的检测
以含有不同浓度 X. axonopodis pv. dieffenbachiae 的安祖花叶片浸提液为检测对象，模拟常规病
原菌检测样液，IMS-PCR 扩增结果（图 4，A）表明，该方法可以检测到浓度为 100 cfu · mL-1 病原
菌的模拟带菌样液，灵敏度比用菌悬液检测下降了一个数量级。普通 PCR 扩增结果（图 4，B）表
明其检测灵敏度只有 106 cfu · mL-1，与用菌悬液检测相比，灵敏度下降了 3 个数量级。结果同时表
明，安祖花叶片浸提液中含有大量 PCR 抑制物质，直接将浸提液用于 PCR 反应，这些物质抑制了
扩增反应。


图 4 IMS-PCR 对模拟带菌样液检测（A）和普通 PCR 对模拟带菌样液检测（B）
M：DNA marker；Blank：水。
Fig. 4 Detection of simulation of carrier extraction by IMS-PCR（A）and PCR（B）
M：DNA marker；Blank：Water.


2.6 IMS-PCR 对安祖花样品的检测
应用免疫磁性捕获 PCR 对随机采集的 10 份无明显病症的安祖花叶片浸提液进行检测（图 5），
其中有 4 份样品扩增出了 254 bp 的特异性 DNA 条带，其余 6 份浸提液未扩增出条带。检测的安祖
花样品扩增条带与阳性对照有明显病症的叶片相比，扩增条带明显偏暗，说明这些受检叶片内携带
的 X. axonopodis pv. dieffenbachiae 密度没有发病叶片高，检测信号稍弱，该方法可以在病害潜伏期
将其检测出来。阴性对照健康叶片浸提液并未扩增出特异性条带，进一步说明该检测方法的可行性。
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图 5 IMS-PCR 检测实际安祖花样品
M：DNA marker；1 ~ 10：受检叶片样品；11 ~ 13：阳性对照（发病叶片）；14：阴性对照（健康叶片）；Blank：水。
Fig. 5 Detection of real Anthuriums by IMS-PCR
M：DNA marker；1–10：Authuriums leaves samples；11–13：Positive（infected leaves）；
14：Negative（healthy leaf）；Blank：Water.
3 讨论
安祖花细菌枯萎病长久以来制约着其种植业的发展，对病害进行准确灵敏地检测是解决其细菌
性枯萎病传播蔓延的一个重要手段。Isabelle 等（2006）采用 Nested-PCR 技术对安祖花 DNA 进行
了病原菌检测，检测灵敏度为 103 cfu · mL-1。为了能在安祖花无病症的情况下检测出携带病原菌的
植株，本试验中采用了灵敏度更高的 IMS-PCR 技术，使检测的灵敏度达到 10 ~ 100 cfu · mL-1。Taban
和 Aytal（2009）也报道了利用 IMS-PCR 技术可以检测到 25 g 鸡肉中 1 ~ 10 cfu 的沙门氏菌。相对
其他的分子检测技术，IMS-PCR 不需要提取 DNA，简化了操作以及 DNA 在提取过程中的损失。利
用免疫磁珠比表面积大的优势，可以吸附更多细菌，最大程度富集纯化样品中的细菌，消除样品中
多糖、酚类化合物对后续 PCR 反应的抑制作用（何丹丹 等，2010）。
PCR 技术检测病原菌最重要的因素是引物设计和模板浓度。本试验中采用的引物 RAPD5-F/R
来自 X. axonopodis pv. dieffenbachiae 的 RAPD 序列，Khoodoo 和 Jaufeerally-Fakim（2004）利用 RAPD
对天南星科植物的细菌枯萎病病原菌进行了遗传多态性分析，证明了 RAPD 分子标记可以用于安祖
花细菌性枯萎病病原菌检测的引物开发，本试验在前期的引物筛选中也证明了 RAPD5-F/R 的特异性
（电泳图未列出）。利用多克隆抗体与病原菌的特异性结合，在磁珠的富集作用下增加了病原菌的浓
度，一方面增加了后续 PCR 反应的模板浓度，另一方面也进一步提高了反应的特异性，X. axonopodis
pv. dieffenbachiae 只有与包被抗体的磁珠结合，PCR 反应才能扩增出特异性的条带。
羧基磁珠对多克隆抗体有较强的吸附能力，1 mg 羧基磁珠的最大吸附值为 0.268 mg，证明羧基
磁珠表面结合多克隆抗体的位点密度高，完全满足富集细菌的要求，在应用中可采用适度多克隆抗
体吸附量，磁珠表面未结合多克隆抗体的位点用 BSA 封闭，既可节约多克隆抗体用量也可达到满意
的磁珠包埋效果。免疫磁珠的捕获率检测分析过程中，随着免疫磁珠浓度增加，捕获率提高，但单
位质量免疫磁珠捕获细菌数量先增大后减小，说明免疫磁珠捕获细菌时，免疫磁珠浓度和细菌浓度
有一个最佳比例。在应用中综合考虑，既要确保高的捕获率又要最经济地使用免疫磁珠，以 106 cfu · mL-1
的高浓度菌悬液来探索免疫磁珠浓度和细菌浓度的最佳比值，选择免疫磁珠在 0.566 ~ 0.741 mg · mL-1
的范围内进行免疫捕获，可满足免疫磁珠对安祖花浸提液中低密度细菌高效捕获的要求。

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