全 文 ：安徽农业大学学报 , 2002, 29 ( 4): 403～ 406
Journal of Anhui Ag ricultural Univ e rsity
PCR在安祖花和白鹤芋属间杂交种早期鉴定中的应用⒇
李云善1 , Elzibieta Zenkteler2 , Andrzej Pacak2 , 李莲花 1 , 李虎林 1
( 1. 延边大学农学院 , 龙井 133400; 2. 波兰 A Mickiewicz大学 )
摘　要: 采用以 PCR技术为基础的 tRN ALeuCAA基因内序列细胞核标记和内部改写空间 2 ( ITS2)序列 2种方
法对 7个安祖花属的红鹤芋 (Anthurium andraeanum )和白鹤芋属的矮小苞叶芋 ( Spathiphy llum wallissii )的
属间杂交种进行鉴定。使用 tRNALeuCAA基因内序列细胞标记共扩增出 13个位点 ,供试杂种中均无父本特异性谱带
出现 , 仅在 1个杂种中出现新的谱带 , 表明该杂种为真正的属间杂种。 ITS2序列法扩增出 28个位点 , 杂种谱
带表现 3种类型: 无父本特异性谱带出现 ; 出现新谱带 ; 既出现父本特异性谱带又出现新谱带。应用 IT S2序列
法有 6个假定杂交种均被鉴定为真正的属间杂交种。试验结果表明 , t RN ALeuCAA基因内序列细胞核标记和内部改
写空间 2 ( ITS2) 序列 2种方法可以用于属间杂种的鉴定。
关键词: 安祖花属的红鹤芋 ; 白鹤芋 ; 属间杂种 ; PCR; t RN A; ITS2
　　中图分类号: Q789 文献标识码: A 文章编号: 1000-2197 ( 2002) 04-0403-04
安祖花 ( Anthurium andraeanum )和白鹤芋 ( Spathiphyl lum wal lisi i )是市场上倍受青睐的盆栽花
卉 ,有关 2个属的种间杂种的培育方面 [1, 2 ]有较多的研究 ,而对属间杂种的选育和应用方面研究较少。 t R-
N ALeuCAA基因内序列细胞核标记和内部改写空间 ( ITS)序列分析已经被用于植物的分类和进化的研究 [3, 4 ]。
这些标记能够有效地区分相近的种。但这些标记被用于杂种鉴定还未见报道。 1998年 M Zenkteler教授
通过胚挽救技术获得了一些安祖花属的红鹤芋和白鹤芋属的矮小苞叶芋 ( S. wall isii )的属间杂种。 本实
验通过以 PCR技术为基础的 tRN ALeuCAA基因内序列细胞核标记和内部改写空间 ( IT S) 序列分析来对其早
期的属间杂种进行鉴定。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
本试验选用 7个通过胚挽救技术获得的安祖花属的红鹤芋 ( A .andraeanum )和白鹤芋属的矮小苞叶
芋的属间杂种为试验材料 , 供试材料代号如下:
X5: 红鹤芋×矮小苞叶芋 ; Xa: 红鹤芋×矮小苞叶芋 ; Xh: 红鹤芋×矮小苞叶芋 ; Xi: 红鹤芋×矮
小苞叶芋 ; X7: 矮小苞叶芋×红鹤芋 ; Xe: 矮小苞叶芋×红鹤芋 ; Xf: 矮小苞叶芋×红鹤芋 ; A1: 红鹤
芋 ; S3、 S4、 S8: 矮小苞叶芋。
试验材料由波兰 A Mickiewicz大学生物系提供。
1. 2　 DNA提取液的制备
每一植株取 100 mg嫩叶 , DN A提取方法参照 Q IAGEN的 Dneasy Plant Mini Ki t方法 ,用 0. 8%的
琼脂糖电泳检验 DNA的浓度 , DN A样品溶于 100μL H2O中 , - 20℃保存备用。
1. 3　 PCR反应
1. 3. 1　 tRN ALeuCAA基因内序列细胞核标记　一对引物 ( PⅠ , PⅡ ) 用于 tRN ALeuCAA基因内序列细胞核标记
PCR反应 , 引物的核苷酸顺序为:
PⅠ : 5′-GGTTCAAATCCCACTTCT-3′( Fiedo row , et al. 2001)
⒇ 收稿日期: 2001-12-24
作者简介: 李云善 ( 1971- ) , 女 , 硕士 , 讲师。
DOI : 10. 13610 /j . cnki . 1672 -352x . 2002. 04. 021
PⅡ : 5′-GAACT TGAG TCGGGCG-3′( Fiedorow , et al. 2001)
　 M-marker, MBI Fermenta s Gene Ruler 100 bp
DN A ladder; 1-A1; 2-X5; 3-Xa; 4-Xh; 5-Xi;
6-X7; 7-Xe; 8-X f; 9-S3; 10-S4; 11-S8
图 1　使用 ITS 2A+ ITS 2B引物进行 PCR扩增
产物的电泳谱带
Figur e 1　 Elect ropho retic sepa ration o f PCR am-
plifica tion pr oducts derived f rom ITS
2A+ ITS 2B prime rs
PCR的反应体系为 10μL含 Tris-HCl 10 mmo l· L- 1
( p H8. 8) , KCl 50 mmo l· L- 1 , MgCl2 1. 5 mmol· L- 1 ,
dN TP 200μmo l· L- 1 , Taq DN A聚合酶 ( QIAGEN公司
生产 ) 0. 25单位 , 引物 0. 5 mmol· L- 1及模板 DNA 7. 5
ng。扩增反应在 PTC-200M J型 PCR仪上进行。 PCR反应
先在 95℃预失活 5 min,然后 94℃ 1 min, 56℃ 1 min, 72℃
1 min, 30个循环后 , 再在 72℃ 5 min。
1. 3. 2　内部改写空间 2 ( IT S2) 序列分析　一对引物
( IT S2A, I TS2B) 用于内部改写空间 2 ( ITS2) 序列 PCR
反应 , 引物的核苷酸顺序为:
ITS 2A: 5′-CGGATATCTTGGCTCT TG-3′
ITS 2B: 5′-CCGCT TAGTGAT ATGCTT A-3′
PCR的反应体系为 10μL含 Tris-HCl 10 mmo l· L- 1
( p H8. 8) , KCl 50 mmo l· L- 1 , MgCl2 1. 5 mmol· L- 1 ,
dN TP 200μmo l· L- 1 , Taq DN A聚合酶 ( QIAGEN公司
生产 ) 0. 25单位 , 引物 0. 5 mmol· L- 1及模板 DNA 7. 5
ng , 扩增反应在 PTC-200M J型 PCR仪上进行。 PCR反应
先在 95℃预失活 5 min,然后 94℃ 1 min, 52℃ 1 min, 72℃
1 min, 30个循环后 , 再在 72℃ 5 min。
以上两对引物均由波兰 A. Mickiewicz大学生物工程
研究所提供。
1. 4　电泳
扩增产物在 8%的聚丙烯酰胺凝胶上在 30 mA电流下电泳 3 h, 紫外灯下观察 , 照相。每对引物对重
复扩增 2次 , 每次均有 1个泳道为不加模板 DNA的对照。 扩增谱带按有 ( 1) , 无 ( 0) 记录。
2　结果与分析
在 tRN ALeuCAA基因内序列细胞核标记分析中 , 7个属间杂种及其 4个亲本共扩增出 13个位点 (表 1)。
杂种获得的谱带表现的类型主要有 2种: 无父本特异性谱带出现 (X5, Xa, Xi, X7, Xe, Xf ) ; 有新的
谱带出现 (Xh)。属间杂种虽未见父本的谱带出现 , 但有父母本均未出现新的谱带出现。 Fiedo row等 [3 ]在
应用 t RN ALeuCAA基因内序列细胞核标记对獐耳细辛属植物进行欧洲种的发展史研究时也发现 , 属内的不同
种间的谱带也存在差异。 Huang等 [5 ]在利用 RAPD技术对 Chrysamthemum进行杂种鉴定时 ,也发现了在
杂种中出现了父母本均没有的新谱带 , 并认为这些新谱带的出现可以用于鉴定新杂种 , 因为这些新谱带
的出现表明了杂种的遗传组成同亲本相比发生了变化。因此 , 用 tRN ALeuCAA基因内序列细胞核标记分析只
鉴定出一个真正的安祖花属的红鹤芋和白鹤芋属的矮小苞叶芋属间杂种 (Xh)。
在内部改写空间 2 ( ITS2) 序列分析中 , 7个属间杂种及 4个亲本共扩增出 28个位点 (表 2)。杂种
谱带表现 3种类型: 无父本特异性谱带出现 (X5) ; 出现新谱带 ( Xe, Xf ) ; 既出现父本特异性谱带又出
现新谱带 ( Xa , Xh, Xi , X7)。既有父母本的谱带出现 , 又有新的谱带出现。 Padget t等 [7 ]在对 N uphar
× Ribrodisca的杂种起源进行 RAPD分析鉴定时 , 在杂种中 , 父母本的谱带均存在。 Narazaki等 [ 6]在对
Chmaecyparis的种间杂种鉴定时也得到类似结果。因此 , 普遍认为 , 杂种是父本的基因转移到母本中产
生的 , 在分子标记鉴定中以父本谱带的形式表现 , 特别对于种间或属间杂种的鉴定。 根据前人的研究结
果 , 父本谱带或新的谱带的出现均可作为鉴定杂种的依据。由此 , 应用内部改写空间 2 ( ITS2)序列分析
技术鉴定出 6个真正的安祖花属的红鹤芋和白鹤芋属的矮小苞叶芋属间杂种 (Xa, Xh, Xi , X7, Xe,
Xf )。
404 安 徽 农 业 大 学 学 报 2002年
表 1　应用 tRNALeuCAA基因内序列细胞核标记分析对安祖花属的红鹤芋 (A1) 和白鹤芋属的矮小苞叶芋 ( S3, S4, S8) 及其
属间杂种扩增出的 13个位点
Table 1　 13 bands obtained using mo lecula r analysis o f nuclear marke r t RNALeuCAA inte rg enic sequence in A . andraeaum
( A1) , S. wallisii ( S3, S4, S8) and their inter generic h ybrids
　 Primer sⅠ + Ⅱ
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
A1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1
X5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1
Xa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
Xh 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0
Xi 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0
X7 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1
Xe 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
Xf 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1
S3 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1
S4 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1
S8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
表 2　应用内部改写空间 2 ( ITS2) 序列分析对安祖花属的红鹤芋 ( A1) 和白鹤芋属的矮小苞叶芋 ( S3, S4, S8) 及其属
间杂种扩增出的 28个位点
Table 2　 28 bands obtained using mo lecula r analy sis o f ITS2 in A . andraeanum ( A1) , S. wallisii ( S3, S4, S8) and th eir in-
ter generic h ybrids
　 Primer s ITS 2A+ ITS 2B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
A1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
X5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Xa 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Xh 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Xi 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
X7 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Xe 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
X f 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
S3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
S4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
S8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
　　根据本试验结果 , 有 6个安祖花属的红鹤芋和白鹤芋属的矮小苞叶芋属间杂种 ( Xa , Xh, Xi , Xe,
Xf) 被鉴定。同时 , 本试验结果也表明 , 可以应用以 PCR技术为基础的 t RN ALeuCAA基因内序列细胞核标记
和内部改写空间 ( ITS)序列分析对早期的属间杂种进行鉴定。但至于父本的哪些基因片段被转移到杂种
中 , 以及杂种同母本相比遗传组成发生了怎样的变化 , 还有待于今后进一步进行基因测序研究。
参考文献:
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Amplification of PCR in Idetifica tion of Intergeneric Hybrids
between Anthurium andraeanum and Spathiph yllum wallisii
LI Yun-shang
1
, Elzbieta Zenkteler
2
, Andrzej Pacak
2
, L I Lian-hua
1
, L I Hu-lin
( 1. Ag riculture Co llege o f Yanbian Univ er sity , Long jing 133400; 2. A. Mickiewicz Univ er sity , Po znan, Poland 60-649)
Abstract: 7 interg eneric hybrids betw een Anthurium andraeanum and Spathiph yl lum wall isi i were i-
denti fied by using nuclear ma rkers tRN A
Leu
CAA interg enenic sequence and internal t ranscribed spacer 2
( ITS2) based on PCR technique. 13 si tes were obtained by using nuclea r markers tRN A
Leu
CAA interg eneric
sequence. No speci fic-male band was observed in hybrids. N ew hybrids w ere v isualised in one hybrids.
So only one hybrids was identified to be a real interg eneric hybrid. 28 bands were ampli fied by ITS 2 se-
quence. It show ed 3 band types: No specific-male bands type; N ew bands type; Speci fic-male and new
bands type. 6 hybrids w ere suggested to be the real interg eneric hybrids betw een A. andraeanum and S.
wall isii . Furthemo re, the resul ts indica ted tha t these mo lecula r markers can be used fo r identifying inter-
generic hybrids.
Key words: Anthurium andraeanum; Spathiphy llum wall isi i; intergeneric hybrid; tRN A; IT S2
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