全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（7）：1132–1138
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–06–15；修回日期：2010–06–22
基金项目：国家‘863’项目（2006AA100109）；教育部博士点基金项目（21512480）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：gaojp@cau.edu.cn）
切花月季 ACC合成酶基因的克隆和原核表达
谭远军 1，薛璟祺 2，仝 征 1，马 男 1，高俊平 1,*
（1中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100193；2中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要：克隆了与伤害诱导相关的 Rh-ACS1和与花朵开放进程及乙烯诱导相关的 Rh-ACS3基因全长。
结果表明，Rh-ACS1基因全长为 2 132 bp，开放阅读框（ORF）长度为 1 476 bp，推定编码 491个氨基酸。
Rh-ACS3基因的全长 1 734 bp，ORF长度为 1 545 bp，推定编码 514个氨基酸。对这两个基因编码的蛋白
进行原核表达分析，结果显示，在 37 ℃条件下，0.6 mmol · L-1 IPTG诱导 3 h后，携带 Rh-ACS1 ORF和
Rh-ACS3 ORF的原核表达载体分别在大肠杆菌中诱导生成了大量分子量约为 70和 60 kD的蛋白质，其大
小与根据基因序列预测的理论值相一致。
关键词：月季切花；ACS；基因克隆；原核表达
中图分类号：S 685.12 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）07-1132-07

Cloning and Recombinant Protein Expression of ACC Synthase Genes in
Cut Roses（Rosa hybrida）
TAN Yuan-jun1，XUE Jing-qi2，TONG Zheng1，MA Nan1，and GAO Jun-ping1,*
（1Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，
China；2Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：Our previous work showed that the expression of ACC synthase genes was contributed to
the effects of ethylene on hastening flower opening. In the present work，we isolated the wound-inducible
and ethylene up-regulated ACS genes，namely Rh-ACS1 and Rh-ACS3，from cut rose petals. The full length
of Rh-ACS1 is 2 132 bp，contains a 1 476 bp ORF which encodes a putative ACS protein with 491 aa，
while the entire Rh-ACS3 is 1 734 bp in length，and contains a 1 545 bp ORF which encodes a putative
ACS protein with 514 aa. The ORFs of Rh-ACS1 and Rh-ACS3 were inserted into pGEX-4T-1 and
pET-30a to express the recombinant proteins in E.coli，respectively. The expression of predicted 70 kD and
60 kD recombinant proteins were induced by isopropyl β-D-thiogalacto-pyranoside（IPTG）at a final
concentration of 0.6 mmol · L-1 for 3 h at 37 ℃.
Key words：cut rose；ACS；gene cloning；procaryotic expression

绝大多数切花月季品种的花朵开放都对乙烯处理敏感，外源乙烯处理能够促进花朵开放和衰老
（蔡蕾 等，2002；Tan et al.，2006）。研究表明，外源乙烯能够促进花瓣内源乙烯生成，但是乙烯
作用抑制剂 1–甲基环丙烯（1-MCP）对花瓣的乙烯生成不能起到抑制效果（Ma et al.，2006），表
明花瓣乙烯的生物合成不存在正反馈调节。研究还发现，对月季花朵而言，最先感受乙烯的部位是

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雌蕊，然后依次是花瓣、花托等，并且雌蕊同样不存在乙烯生成的正反馈调节（Xue et al.，2008）。
在植物的乙烯生物合成过程中，由 S–腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine）形成 ACC
（1-aminocyclopropane-1-carboxylate）和由 ACC形成乙烯是两个关键步骤，前者被证明是整个合成
途径的限速步骤，ACC合成酶（ACC synthase，ACS）是乙烯生物合成的限速酶（Adams & Yang，
1979；Abeles et al.，1992）。作者前期工作已从月季花朵中分离了 4个 ACS基因，分别命名为 Rh-ACS1、
Rh-ACS2、Rh-ACS3、Rh-ACS4。其中，Rh-ACS1在花瓣中的表达特征为受机械伤害所诱导，但对乙
烯处理不发生响应；Rh-ACS2主要在花朵开放末期，即进入衰老期时表达；Rh-ACS3在花瓣中的表
达可以迅速地被乙烯处理所诱导，表达量在盛开之前逐渐上升，盛开时达到高峰，然后减弱 （Ma et
al.，2005；Xue et al.，2008）；Rh-ACS4已有的结果表明对乙烯处理不发生响应（Xue et al.，2008），
对伤害和花朵开放的响应目前正在探讨中。
在月季切花的采后流通中，各个环节的机械伤害和由环境污染或植物本身积累的乙烯气体是两
个不可避免且严重影响切花品质的因素。本研究中选择了 Rh-ACS1和 Rh-ACS3两个与此相关的 ACS
基因，在获得基因全长序列的基础上，通过原核表达获得了两个基因编码的重组蛋白，为进一步研
究月季切花花瓣内的乙烯生物合成调节提供了一定的基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
试验于 2004—2006年间在北京进行。切花月季（Rosa hybrida）‘Samantha’的花枝采自北京
市朝阳区十八里店月季切花生产基地。采切 2级花（Ma et al.，2005）立即插在水中， 2 h内运回
实验室。将花枝在水中剪切至 25 cm，上部保留 3片复叶，去离子水室温瓶插。瓶插条件为温度 23 ~
25 ℃，相对湿度 50% ~ 60%，光/暗周期为 12/12 h，光照强度保持在 40 µmol · m-2 · s-1。
花瓣切伤处理后放置 3 h，液氮速冻后于–80 ℃保存，用于 Rh-ACS1 的基因克隆。花朵经 10
µL · L-1 乙烯处理 24 h 后，收集花瓣，液氮速冻并于–80 ℃保存，用于 Rh-ACS3的基因克隆。
1.2 总 RNA提取和 ACS基因克隆
总 RNA提取采用 Hot borate法（Wan & Wilkins，1994）。从总 RNA反转录生成 cDNA，并以
此为模板进行基因的克隆。将已发表的不同植物中分离的 ACS基因序列进行比对后，根据其中的保
守序列设计简并引物，包括 Rh-ACS forward和 Rh-ACS reverse（表 1）进行 PCR扩增。PCR扩增条
件为：94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 30个循环。
基于 PCR扩增得到的 cDNA片段，设计出 3′RACE引物，Rh-ACS1 GSP forward和 Rh-ACS3 GSP
forward；5′RACE引物，Rh-ACS1 GSP reverse和 Rh-ACS3 GSP reverse。再将 3′RACE和 5′RACE得
到的序列进行拼接，最终获得基因的全长序列。扩增 Rh-ACS1全长的引物是 Rh-ACS1 FL forward和
Rh-ACS1 FL reverse，扩增 Rh-ACS3全长的引物是 Rh-ACS3 FL forward和 Rh-ACS3 FL reverse，引物
序列见表 1。本试验中选用的 DNA凝胶回收试剂盒购自 Axygen，各种限制性内切酶和 DNA聚合酶
等为大连宝生物公司产品。引物合成及测序在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。
1.3 Rh-ACS1和 Rh-ACS3的原核表达
根据已经得到的 Rh-ACS1和 Rh-ACS3的 cDNA全长序列，设计上游引物 Rh-ACS1 ORF（open
reading frame，开放阅读框）forward（5-CCGGAATTCATGGCCTCGAACTCACTCT-3）和下游引物
Rh-ACS1 ORF reverse（ 5-GAGGTCGACCTTAACTTGCTCGAAG-3）、 Rh-ACS3 ORF forward
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（ 5-CCGGGTACCATGAGAGTTATAGTCCCT-3）和 Rh-ACS3 ORF reverse（ 5-CGGCTCGAG
TTCAACTGTGTGATTTAC-3）扩增 ORF，分别引入 EcoR + Ⅰ SalⅠ酶切位点（Rh-ACS1，下划线）
和 Kpn + Ⅰ XhoⅠ酶切位点（Rh-ACS3，下划线）。
Rh-ACS1和 Rh-ACS3对应的酶切位点及载体（表 2）。将扩增的片段插入到 pGEM-T Easy载体
（购自 Progema），进行测序。对测序正确的质粒进行 EcoR +Ⅰ SalⅠ（Rh-ACS1）或 Kpn + Ⅰ XhoⅠ
（Rh-ACS3）双酶切，之后将酶切片段连接到 pGEX-4T-1（购自 GE）和 pET-30a（+）（购自 Novagen）
载体中，分别命名为 pGEX-ACS1 和 pET-ACS3。将重组质粒分别转化到大肠杆菌 JM109
（pGEX-ACS1）和 BL21（pET-ACS3）菌株中，菌液 PCR和质粒酶切确定阳性质粒。
挑取阳性克隆接种于 LB 液体培养基，37 ℃培养过夜。次日，按 1/100 比例接种到新鲜的 LB
培养基中，培养至 OD600为 0.5时，加入 0.6 mmol · L-1 IPTG诱导 3 h。以刚加入 IPTG的时间为 0 h，
分别在 0和 3 h取样。每次取 1.5 mL菌液，离心收集菌体，加入 SDS-PAGE上样缓冲液煮沸 5 min
以裂解细胞。室温下，12 000 r · min-1离心 5 min，取上清液进行 SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。

表 1 切花月季‘Samantha’Rh-ACS1和 Rh-ACS3基因克隆引物
Table 1 Primers used to isolate Rh-ACS1 and Rh-ACS3 in cut rose‘Samantha’
引物 Primer 引物序列 Primer sequence
Rh-ACS forward 5′-AACCC（C\G）GA（G\T）GG（G\T）GTTATTCAG-3′
Rh-ACS reverse 5′-GTTG（A\G）G（A\T）T（G\T）GGG（A\C）GGAGA-3′
Rh-ACS1 GSP forward 5′-GATCCTGATCGCGTAGTCAT-3′
Rh-ACS1 GSP reverse 5′-GGACCTCTGTAACGCAAGTG-3′
Rh-ACS3 GSP forward 5′-GCAGGATTCATGTCTAAGGC-3′
Rh-ACS3 GSP reverse 5′-GCACTCTGTTCTGGTCGAGA-3′
Rh-ACS1 FL forward 5′-CAGAGTACGCGGGAACACTC-3′
Rh-ACS1 FL reverse 5′-GAACTGCAAAGATATTCAGATCACT-3′
Rh-ACS3 FL forward 5′-GCCTTGGCTTTCCTCCCTTC-3
Rh-ACS3 FL reverse 5′-GAGTAGAATGAACGAACATTTCAACT-3

表 2 切花月季‘Samantha’Rh-ACS1和 Rh-ACS3原核表达载体和菌株
Table 2 Vectors and E. coli strains for recombinant protein expression of Rh-ACS1 and Rh-ACS3 in cut rose‘Samantha’
基因 Gene 酶切位点 Restriction site 载体 Vector 菌株 E. coli
Rh-ACS1 EcoRⅠ+ SalⅠ pGEX-4T-1 JM109
Rh-ACS3 KpnⅠ+ XhoⅠ pET-30a（+） BL21
2 结果与分析
2.1 Rh-ACS1和 Rh-ACS3基因全长的克隆和序列分析
根据 ACS基因的保守序列设计简并引物（表 1），从切花月季‘Samantha’花瓣中扩增出 Rh-ACS1
和 Rh-ACS3保守区域的 cDNA片段。在 NCBI上进行的 Blast分析表明，这两个片段与多种植物的
ACS基因有很高的同源性。以扩增得到的片段为模板，设计特异引物（表 1）进行 3′ RACE和 5′ RACE，
对得到的序列拼接后获得 Rh-ACS1和 Rh-ACS3的全长序列。
Rh-ACS1的序列全长 2 132 bp，包含一个 1 476 bp的 ORF，编码一个包含 491 aa的肽链，其理
论分子量为 54.9 kD，等电点为 4.98。Rh-ACS3的全长为 1 734 bp，ORF为 1 545 bp，编码一个包含
514 aa的肽链，其理论分子量为 58.7 kD，等电点为 4.99。对推测的 Rh-ACS1和 Rh-ACS3氨基酸序
列进行分析，发现了 ACS的 7个保守结构域（Zarembinski & Theologis，1994）（图 1）。
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图 1 由切花月季‘Samantha’中分离的 Rh-ACS1和 Rh-ACS3基因推定的氨基酸序列
ACS的 7个保守结构域用箭头表示，3个磷酸化位点用方框表示。
Fig. 1 Deduced amino acid sequence of Rh-ACS1 and Rh-ACS3 in cut rose ‘Samantha’
Seven conserved ACS domains were marked with arrows，and three phosphorylation sites were marked with frames.


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通过对 17个物种的 22个 ACS蛋白进行 Blast分析，把 ACS蛋白分成 3大类（El-Sharkawy et al.，
2008）。其中 Rh-ACS1分在第 1类，与梅花中的 Pm-ACS1（Q9MB95）同源性最高；Rh-ACS3 分
在第 3类，与水稻中的 Os-ACS（NP_001056689）同源性最高，但是 Rh-ACS1和 Rh-ACS3之间的
同源性较低（图 2）。
ACS基因是一个序列变异性很高、家族成员功能差异较大的多基因家族。在拟南芥（Liang et al.，
1996）、番茄（Oetiker et al.，1997）、水稻（Zarembinski & Theologis，1993）以及绿豆（Kim et al.，
1997）等植物中都有关于 ACS 基因家族不同成员差异表达的报道。作者在月季花瓣中克隆得到
Rh-ACS1和 Rh-ACS3的氨基酸序列同源性只有 30%，Rh-ACS1和 Rh-ACS3在基因表达上存在明显
差异（Rottmann et al.，1991；Ma et al.，2005）。
MAPKs（Mitogen-activated protein kinases）调节植物的生长发育，响应环境胁迫。在拟南芥上
的研究表明，ACS是MPK6的底物，C–末端具有磷酸化位点（Liu & Zhang，2004）。通过对 Rh-ACS1
和 Rh-ACS3的 C–末端的比较，发现月季花瓣中的 Rh-ACS1具有和拟南芥 At-ACS6相似的磷酸化
位点，而 Rh-ACS3却没有（图 1），暗示这两个蛋白在转录后的修饰方面可能存在差异。
图 2 切花月季‘Samantha’中获得的 Rh-ACS1和 Rh-ACS3与其他物种的 ACS的同源性分析
Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别表示不同的亚家族。
Fig. 2 Homology analysis of predicted amno acid sequences of Rh-ACS1 and Rh-ACS3 from cut
rose‘Samantha’compared with other plant species
Ⅰ，Ⅱ and represent different subfamily respectively.Ⅲ

2.2 Rh-ACS1和 Rh-ACS3基因的原核表达
为验证在切花月季中克隆得到的 Rh-ACS1和 Rh-ACS3是否能够翻译预计大小的酶蛋白，构建了
pGEX-ACS1和 pET-ACS3表达载体，酶切检测后转入到 E. coli中。以 IPTG为诱导剂，进行了诱导
表达。
根据 Rh-ACS1和 Rh-ACS3基因的 ORF和载体上标签蛋白的大小，推测在大肠杆菌中表达的重
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组蛋白分别约为 70 kD和 60 kD。在 37 ℃，0.6 mmol · L-1 IPTG诱导 3 h后，在 70 kD（图 3）和 60
kD（图 4）处都有蛋白被大量诱导，而转化空载体的菌株未见相应蛋白大量表达，这与预测的结果
相一致，同时也说明克隆的 Rh-ACS1和 Rh-ACS3基因具有完整的读码框。
目前只在拟南芥（Liang et al.，1992）、番茄（Tatsuki & Mori，2001）以及烟草（Liu & Zhang，
2004）等物种上获得了 ACS重组蛋白。本试验中克隆得到了月季中的 Rh-ACS1和 Rh-ACS3基因全
长序列，并对其进行了原核表达分析，得到了相应的重组蛋白，为进一步探讨这两个酶蛋白的生化
特性打下基础。
图 3 重组质粒 pGEX-ACS1的酶切鉴定（A）和 Rh-ACS1的原核表达（B）
Fig. 3 Digestion of pGEX-ACS1（A）and expression of recombinant Rh-ACS1 protein（B）
图 4 重组质粒 pET-ACS3的酶切鉴定（A）和 Rh-ACS3的原核表达（B）
Fig. 4 Digestion of pGEX-ACS3（A）and expression of recombinant Rh-ACS3 protein（B）

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