全 文 ：植物生理与分子生物学学报 , oJ u rn a l of p al n t p h y s i o lo舒 a n d M Ol e e u al r B i o ot 舒 2 0 04 , 30 (3 ) : 3 5 1一3 5 5
L E
·
A C S 6 启动子在 L E · A C S :6 : G U S 转基因拟南芥中的特异性
樊 荣 ` 万小荣 ` ’ 张文涛 ` 王淑芳 ’ 王 勇 ` 朱亮基 ` 王宁宁 ` . 施明哲 ’ 常怡雍 ’ 杨祥发 `
(’ 南开大学生命科学学院生物化学与分子生物学系 , 天津 3 0 0 0 7 1 ; “ D印 a rtm e n r of B i o l o g i c a l S e i e n e e s , 山 i v e rs i卿 of ol w a , I o w a 5 2 2 4 2 ,
u s A : ’ nI s r i t u r e of 刀 i o a g r i e u l t u ra l S e i e n e e s , a c a d e m ia S i n ie a , T a ip e i 1 15 2 9 , T a i w a n ; 4Ma
n n L a b o ra t o 恻 , nU iv e r s i ty of C a l iof rn ia , C A
9 5 6 16
,
U S A )
摘要 : 通过对不 同发育时期 L E一 A C S :6 :G U s 转基因拟
南芥中G u S 表达特异性的研究 , 证明 LE 一A c 6S 基因的
启动子在拟南芥中也表现启动参与第一系统 乙烯合成
的关健酶基因的活性 。 在转基因拟南芥中 , L E 一 A C s6
启动子还表现响应外源生长素处理 、 伤害处理等多种
刺激因子的特点 。
关键词 : L E 一 A C S 6 基因 ; 启动子 ; 生长素 ; 伤害 ; 乙
烯 ; 转基因拟南芥
中图分类号 : Q 9 4 5 , Q7 5 3
气体植物激素乙烯对高等植物体的生长发育
具有重要 的调控作用 , 从种子萌发到各个器官的
衰老 , 以及植物体对各种环境胁 迫如 : 机械伤
害 , 寒害 , 淹水 , 干旱等的应答反应 过程中 ,
都有 乙烯参与调节 ; 由于其对果实成熟过程的调
节作用 , 乙烯又被称为 “ 成熟激素 ’ , ( r i p e in n g
h o r m o n e ) (A b e l e s 和 T h e o l o g i s 19 9 6 ) 。
乙烯在植物体内的生物合成受到正向 (p os it ve )
和负向 ( n e g a t i v e )两方面的反馈调控 ( f e e d b a e k
r e g u l a t i o n )
, 分别称为自催化 (a u t o e a t a l y t i e )和 自抑
制 (a u t o ihn ib i t i v e )调节 (K e n d e 19 9 3 ) 。 控制乙烯生
物合成的关键酶是 A c c 合成酶 ( A C C sy nt h “ s “ ,
A C S )( Y an g 和 H o f n l an 19 8 4 ) 。 目前己知各种因素
诱导植物体内乙烯生成都要通过 A C S 蛋 白的重新
合成 ( K e n d e 19 9 3 ) 。 A C C 合成酶是 由多基 因族
(m u l t i
一
g e n e fa 而 l y )编码的 , 番茄的 A C C 合成酶至
少由 8 个基因编码 , 分别响应番茄植株在对应诸
如淹水 、 果实成熟 、 创伤反应等过程中所需要的
乙烯合成反应 ( o l s o n 等 19 9 5 , R o t tm a n n 等 1 9 9 1 ,
O e t i k e r 等 1 9 9 7 , S h i u 等 1 9 9 8 ) 。
根据 果实成熟过程 中乙烯生成量 的变化 ,
M c M u cr hi e 等 ( 197 2) 首次提出第一系统 乙烯和第二
系统乙烯 ( s y s t e m l 和 s y s t e m 2 e t h y l e n e )的观念 。
第一系统乙烯多指具有呼吸跃变的果实在呼吸跃变
前 (p er 一c l im a e et ir e )所产生的基础水平 (b a s a l l e v e l )的
少量乙烯 ; 第二系统乙烯指随着果实成熟 , 伴随
呼吸跃变产生的大量乙烯 。 随着这方面研究的进
展 , 近年来杨祥发研究小组在此基础上提 出了第
一系统乙烯和第二系统乙烯在果实成熟过程中的作
用模型 ( Y a n g 19 8 7 , o e ti k e r 等 1 9 9 7 ) 。
在番茄果实成熟过程 中 , A C C 合成酶 L E -
A C S Z 和 LE 一C’S 4 基因的表达导致第二系统乙烯的
显著增加 , 这两个基因的转录本 (t r an s er i tP )分别在
呼吸跃变前和呼吸跃变过程中迅速累积 , 而且可
以在成熟绿果 (m a t u r e g r e e n fr u i t )中被低量乙烯诱
导表达 , 其中 , L E 一A C S Z 基因转录本在呼吸跃变
过程中的累积量达 LE 一 C S 4 的 or 倍之多 (O lso n 等
19 9 5
,
R o t tm a n n 等 1 9 9 1 , L i n e o l n 等 1 9 9 3 ) 。 目前 ,
人们普遍认为 LE 一A C S Z 和 乙石一 C万4 基因的表达是
导致番茄果实呼吸跃变和果实成熟过程中大量乙烯
(第二系统 乙烯 )产生的主要原因 。 这一 论点己被
反义 ( a n t i s e n s e ) R N A 技术所证实 : 反义 L E 一A C S Z
转基因的番茄果实如不经外源乙烯处理则无法成熟
(O e l l e r 等 1 9 9 1 ) 。
与此相反 , 目前对于第一系统 乙烯生成的调
节 及其在果实成熟过程中的作用 都了解甚少 。
1 9 9 7 年杨祥发实验室从番茄中克隆到一个新的
A C C 合成酶 乙吞 A C s 6 的 c D N A ( O e ti k e : 等 19 9 7 ) ,
最近 , N a k at s u k a 等人发现这一 A C C 合成酶可能
参与第一系统乙烯的合成 : L E 一 A C s 6 m RN A 在番
茄绿果中累积但在果实成熟过程中消失 。 以乙烯
结构类似物处理可以抑制 L E 一A C S 6 基因在绿果中
表达 , 而乙烯作用抑制剂则可诱导该基因在成熟
过程中的番茄果实中表达 , 这说明在番茄果实中
2 0 0 3
一
0 1
一
2 3 收到 , 2 0 0 4 一0 3 一 2 5 接受 。
国家自然科学基金项目 (N o . 3 0 07 0 0 7 5 )和教育部优秀青年教师计划
项目 ( N o . 2 0 4 3 )资助 。
` 现地址 : 华南师范大学生命科学学院 , 广州 5 1 0 6 3 1 。
’ ` 通讯作者 ( E 一 m a i l : w a n g n n @ e y o u . e o m : T e l : 0 2 2一 2 3 5 0 3 7 14 ) 。
植物生理与分子生物学学报 30卷
第一系统乙烯和第二系统乙烯的合成是分别通过对
特定的 A C C 合成酶基因的负向和正 向反馈控制来
调节的 (N欧a t s u k a 等 199 8 ) 。 B团r y 等 (20 0 )的实验
进一步证实了这种推论 。
除了在果实发育过程起重要调控作用 以外 ,
第一系统乙烯还指在植物正常发育的营养生长期各
组织器官中产 生的基础水平 的 乙烯 ( B a r r y 等
2 0 0 0 )
。 到 目前为止 , 乙烯合成 的负调控机制以
及第一系统乙烯的生理功能和作用机制还不清楚 。
为了分析 L E 一A C S百基因的转录调节机制及其启动
子 ( p or m ot er )的组织特异性 , 我们利用分子生物学
方法 , 克隆了 L E 一A C S 6 基因的启动子 ( G en B an k ,
A F 1 5 3 6 88)
, 构建了 L E 一A CS ` 启动子与报告基因
G U S 的嵌合基 因 , 分 别稳 定转化微 型 番 茄
M i e r o T o m 和模型植物拟南芥 ( A r a b i d o 尸 5 1 5
rh a l i a n a )
, 发现 L E 一 A C S 6 : : G u S 转基因拟南芥中
G U S 的表达特点与转基因番茄中的表达具有很大
的相似性 , 说明具有非肉质果实的拟南芥在发育过
程中可能也存在类似 “ 第一系统 乙烯 ” 的调控机
制 , 同时 , 转基因拟南芥中的 G U S 表达又有一些
不同的特点 。 本文报告对 L E 一A C S 6 启动子活性在
转基因拟南芥中的发育特异性研究的初步结果 。
1 材料与方法
L l 植物材料及处理
野生型拟南芥(A ar b id o尸5 15 rh a l i a 九a )种子播种
在泥炭土 、 蛙石和珍珠岩 ( l : l 二 l) 的混合土壤
中 , 光照 16 h ld 、 温度 23 ℃ 日 1/ 8 ℃夜条件下生
长 , 并按照 C l o u g h 和 B e n t ( 1 9 9 8 )的方法进行土壤
农杆菌介导的转化 。
转基 因拟南芥经含相应抗生素培养基上筛选
及分子生物学检测确定 以后 , 转入土壤与野生型
植株在同样条件下培养 。
伤害处理 : 以直径 5 m m 打孔器分别在同龄
野生型和转基因拟南芥成熟叶片打孔后 , 将被伤
害叶片置于含有或不含有N A A I任 4 m o比的 112 M S
基本培养基上 l h 后 , 进行 G U S 组织化学染色 。
生长素处理 : 将在含潮霉素 5 0 m gl L 的 12/
M S 培养基上萌发 3 d 的野生型或转基因拟南芥幼
苗转至含 N A A 10 一 4 mo l几的 12/ M S 培养基上再培
养 3 d 后 , 将 6 d 龄的幼苗与未处理对照组一起测
定 G U S 的荧光活性变化 。
乙烯处理和乙烯 + 生长素处理 : 将在含潮霉
素 5 0 m g几 的 12/ M S 培养基 上萌发 3 d 的野生型或
转基因拟南芥幼苗转至含或不含 N A A 10 一4 m o比的
12/ M S 培养基上 , 在含有 10 林L/ L 乙烯的密闭容
器中培养 l d 后 , 将 4 d 的幼苗与未处理对照组一
起测定 G U S 的荧光活性变化 。
每一种处理数据均为不同转基因株系经 3次以
上 重复 , 显示 相同趋势 的结果 。
1
.
2 嵌合基因构建
以引入 cE 口班 和 Nc ol 两个酶切末端的 A TG 上
游约 1 . 3 k b 的 L E 一 A C S 6 启动子替代双元载体
p c A M BI A 130 1上 T 一D N A 左右边界内驱动 G US 基
因的 C a M V 3 5 5 启动子 , 获得含有 L E 一A C S 6 一G U S
嵌合基因的双元载体 (命名为 p L E一 A C S 6) , 转化
根癌上壤农杆菌 L B A 4 4 0 4 , 用于拟南芥转基因 ,
筛选标记为 C aM V 35 5 启动子驱动的潮霉素抗性 。
1
.
3 转基因植株的筛选与检测
收取经上述土壤农杆菌转化的拟南芥种子 ,
铺在含潮霉素 5 0 m gl L 的 112 M S 培养基上培养 ,
抽取具有潮霉素抗性植株的基因组 D N A , 以 L E -
A C S 6
一
G U S 嵌合基因特异性引物进行 PC R 扩增检
测 (只有转基因阳性植株可扩增出约 1 . 5 k b 的产
物 , 图 l) , 并辅以 G U S 表达检测来确定阳性转化
植物 。 经检测 , 共获得 4个不同的转基因株系 (A , E
M 1 2 3 4 5 6 7 8
.
5 k b
.
4 kb
图 1 Pc R 检测 pLE 一cA s 6 转基因拟南芥植株
F i g
.
1 P C R e h e e ik n g o f t h e tr a n s g e in e A ar b id( 叨 s is Pl an t s
L an e M : D N A m a r ker D L Z (叉X) . L a n e l : P o is it v e e o n tr o l o f P C R
w i ht P la s而 d D N A a s te m lP aet L an e s 2 t o 7 : CP R aJ 旧 P li if e iat o n
w i ht g e n o而 e D N A o f li ne s A , F , G an d H o f L E 一 A C S6 : : G U S
tr an s g e in e A ar b idop s is
,
lin e B o f D L E
一
A C S 6
一
1: :G U S tr a n s g e n ie
A川 b id( 护 515 an d w i ld ty pe A ar b i成明 515 re s pe e it v e l y as te m P late s
.
L a n e s : N e g iat v e e o n tor l o f PC R w i ht n o t e m Pl at e in t h e P C R
r e ac t i o n s y s te m
.
3期 樊 荣等 :E L一A CS6 启动子在 E L一A CS 6 :二G u S 转基因拟南芥中的特异性
G
,
H )
。
1
.
4 转基因拟南芥中 G U S 表达水平的检测
G U S 组织化学染色法按照 J e f fe r s o n ( 19 87 )的方
法进行 , 染色时间 12 h 。 G U S 活性的荧光测定法
按照 J e fe r s o n 和 认了i zs o n ( 2 9 9 2 ) 的方法进行 , 反
应时 f司 l h 。
2 结果
我们以平末端限制性内切酶降解的番茄基 因
组 “ 库 ” (P 0 01 )为模板 , 利用基因组 D N A 步巡法
(g e n o m i c D N A w a l ik n g )克隆了3 s l o bP 的LE 一A C S 6
基因的启动子片断 ( G e n B a n k , A F 1 5 3 6 8 s ) , 5几 端系
列缺失结合基因枪法进行番茄果实上的瞬时表达实
验证实 : 该基因 A T G 上游 1 . 3 kb 左右的启动子片
断 (包括 5’ 一U T R 区 )就可以驱动 L U C 报告基因在番
茄果实中的瞬时表达 ( t r a n s i e n t e x p r e s s i o n ) , 表现
出受乙烯和果实成熟负调控的特点 (结果待发表 ) 。
因此 , 我们选用 了 A T G 上游 1 293 b p 片断 (序列
中包含的重要顺式作用元件见表 l) 构建与 G u S 嵌
合的基因 , 分别稳定转化微型番茄 M icr o T o m 和模
型植物拟 南芥 。
表 1 序列分析推测 L E 一 A C S 6 启动子片断中所包含的重要
顺式作用元件
aT bl
e 1 uP at ti v e
c is 一 le me n st h a厂b o ir n g 盛n L E钱C S 6 rP O i n o etr
ft ag m e n t i n PLE
一
A C S 6 c o n sutr
e t
P u t at i v e e is
一 e le m e n t s P ( 〕s i t i o n s
D P B FC O R E D C D C 3 一 128 9 一 一 12 83
N T B B F IA R RO L B 一 1 16 5 一 一 1 16 0
N T B B F I A R R O L B 一 1153 一 一 11 4 8
A B RE L A T E R D I 一 998 一 一 99 4
M Y B IA T
一 7 70 一 一 76 5
E B O X B N N A P A /M Y C A T R D 2 2 一 68 6 一 一 6 80
A U X R E P S IA A 4/ G G T C C C A T GM S A U R
一 6 1 1 一 一 604
P Y R IM ID IN E B O X O SR A M Y I A 一 143 一 一 136
ER F I F F 4 一 103 一 一 98
P o s i t i o n s o f s e q u e n e e s h o m o l o g o “ s 之0 A B A er la et d e l e m e n ts
A B R E L A T E R D I
,
D P B F C O R E D C D C 3
,
B O X B N N A P A
,
M Y B I A T
,
M Y C A T R D 2 2
, a u x i n r e s P o n
s iv e e l e m e n t s
A U X R E P S IA A 4
,
G G T C C C A T GM S A U R
,
N T B B F IA R R O L B
,
e ht y le n e re s Po n s i ve e le me
n t E RE L E 4E an d G i bbe re ll i
n re sOP n
-
s iv e e le m e n t P Y R D以ID IN E B O X O S R A M Y IA 肛 e s h 0 W n .
.2 1 L E
一
A C S :6 : G U S 转基因拟南芥中 G U S 表达的
发育特异性
分别选取生长 6 、 4 0 d 和开花 以及结实期的
L E
一
A C S :6 : G U S 转基因拟南芥植株 , 取不同部位
进行 G U S 组织化 学染色 。 结 果表 明 : 在 L E -
A C S 6 : : G U S 转基因拟南芥的幼苗期 , 子叶和下胚
轴中都表现很强的 G U S 活性 , 而初生的第一对真
叶中没有 G U S表达 (不着色 )(图 ZA ) ; 莲座 ( r o s e t te )期
顶部的幼叶及基部以及近基部的老龄叶片中 G U S
活性很弱 , 中间部分的展开叶片中 G U S 活性较
强 , 根中几乎无 G U S 的表达 (图 ZB ;) 抽蔓开花后 ,
转基因拟南芥快速生长的茎顶端有很强烈的 G U S
活性 (图 Z C ) 。
拟南芥抽蔓开花后 , 随着茎的生长不断形成
新的荚果 , 同一条茎从顶部到基部荚果的年龄逐
渐增加 , 可以很方便地检测处于不同发育时期的
果实和种子中 L E 一A C S 6 启动子的活性变化 。 染色
结果表 明 : 不 同发育时期 的转基 因拟 南芥荚果
中 , G U S 基因表达以接近成熟 以及刚成熟的绿果
荚中最强 , 随着荚果的完全成熟和衰老 , G U S 的
活性 明显降低 , 幼果中 G U S 活性也很低 , 种子
中没有检测到 G U S 活性 (图 Z D ) 。 从此图中还能看
到 G U S 在转基因拟南芥茎顶部强烈表达 , 而野生
型植株在我们 的检测条件下 各部分都没有着色 。
这些研究结果与我们在 L E一A C S 6 : : G U S转基因番茄
中观察到的实验结果相一致 (待发表 ) , 表 明 L E -
A c S 6 启动子在 LE 一A c s 6 : : G U s 转基因拟南芥的荚
果成熟过程中也表现出类似启动第一系统乙烯合成
酶基 因在肉质果实番茄中表达的特点 。
2
.
2 生长素对 L E 一 A C S 6 : : G U S 转基因拟南芥中
G U S 表达的促进作用
将 3 d 苗龄的 L E一A C S 6 : : G U S 转基因拟南芥幼
苗从正常培养基转至含 N A A I沪mo 比的培养基上
培养 3 d 后 , 进行 G U S 的荧光活性测定 , 发现无
论环境中是否存在 10 林U L 的乙烯 , N A A 都能明显
促进转基因拟南芥中 L E ~ A C S 6 启动子的活性 , 而单
独 10 川LJ 的乙烯处理 , 则明显抑制转基因拟南芥幼
苗中的 G U S 活性 (图 3) , 再次表明 LE ~ A C S 6 启动子
在转基因拟南芥中也表现乙烯的负调控特点 。
.2 3 伤害诱导 G U S 基因在 L E 一A C S 6 : : G U S 转基因
手以南芥叶片中的表达
以直径 S ln 们。 打孔器分别在同龄野生型和转基
因拟南芥成熟叶片打孔后 , 发现伤害处理会在转
基因拟南芥叶片的伤 口边缘迅速诱导 G U S 基因的
表达 (图 4) , 其他形式的伤害处理如切割 、 止血
植物生理与分子生物学学报 3 0 卷
图 2 L E 一A c S 6 启动子驱动的 G s u基因在转基因拟南芥 6 d 幼苗(A ) 、 莲座期叶片 ( ) B、 茎 ( ) C和不同发育时期荚果中(D )
的表达
i Fg
·
2 G S Ue xPe rs s in oin 6 d s e e d il n g (A )
,
or s e te le af( B )
,
set m( C ) an d d ifl 七r e n t de v e lo P m e in al s t ag e s of Po d s (D ) in L E 一 A C S 6 : :G U S
tr a n s g e币 e A ar b id口P s is
7 0 0
6 0 0 0
5 0 0 0
4 0 0 0
3 0 0 0
2 0 00
1 0 0 0
O
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图 3 生长素对转基因拟南芥幼苗中 G U S 表达活性的影响
F i g
.
3 E fe c t o f e x o ge n o u s N A A o n ht e G U S e x P er s s io n in L E
~
A C S6 : : G U S tar n s g e n i e A ar b i成叨 5 15 s e e d li n g s
w t : W i ld ty Pe : tP : T anr
s g e in e Pl a n t : E : E th y le n e t er a tme
n t
.
图 4 伤害处理对转基因拟南芥叶片中 G U S 表达活性的影响
iF g
·
4 E fe
e t o f w o u n d o n G U S e x Per s s io n i n L E
一
A C S6 : :G U S
t r a n s g e n ie A ar b i成少 515 Ie a v e s
钳伤害等也具有打孔器伤害同样的效果 (结果未展
示 ) , 这表明 LE 一 A C S 6 启动子在拟南芥中具有响应
伤害刺激的活性 。 N A A 1 0碑 m ol 几 处理能够显著
提高被伤害叶片伤 口边缘 G U S 的表达水平 (图 4) 。
伤害以及 N A A 处理都不能诱导野生型叶片 G U S 染
色本底的提高 。
3 讨论
3
.
1 L E
·
A C S 6 启动子在非肉质果实植物拟南芥中
表现类似启动 “ 第一系统乙烯 ” 合成酶基因表达
的特点
N a k a t s u k a 等 ( 19 9 8 )的实验结果表明 , 在呼吸
跃变前的番茄果实中 , 第一系统乙烯的形成可能
3期 樊 荣等 : L E一 A C S 6启动子在 EL一 A C S 6 : :G S U转基因拟南芥中的特异性
是由组成型表达的 L E一 A C S I A和 L E一 A C S 3、 受乙
烯负反馈调控的 L E一 A C S 6基因表达 , 以及预先存
在的 L E一 A C O I 和 L E 一A C O 4 转录本翻译过程综合
调控的 ; 果实发育进入呼吸跃变期 , 第二系统 乙
烯开始形成 , 此时 L E 一 A C S Z 、 L E 一 A C S 4 、 L E -
A C O I 和 L E 一 A CO4 的转录本都大量累积 , 并响应
乙烯的正反馈调节 , 导致大量 乙烯生成调控果实
的成熟过程 。 因此可 以推断在番茄果实中第一系
统乙烯和第二系统乙烯的合成是分别通过对特定的
A C C 合成酶基因的负向和 正向反馈控制来调节
的 , 其中 L E 一A C S 6 基因是这个过程中唯一受到严
格成熟负调控的 A C C 合成酶基因 。
一般说来 , 特定的植物基因表达所表现出来
的在时间和空间上的特异性和发育可诱导性 , 多
受该 基因启动子区域内各种顺式作用元件 ( ic , -
el e me nt s) 与不同反式作用因子 ( atr ns 一 ac it n g acf ot )r 之
间相互作用的协调控制 。 L E一 A C S 6基因的启动子
可以驱动报告基 因 G U S 在转基因拟南芥的营养体
和果荚中 、 在莲座期的成熟叶片和开花结实后的
成熟果荚中大量表达 , 而在幼嫩和衰老叶片 以及
幼嫩和衰老果荚中则很少表达的特点 (图 2) , 这与
其在番茄不 同发育阶段作为 “ 第一系统乙烯合成
酶基 因 ” 的表达特点非常相似 , 说明在十字花科
植物拟南芥中 , 也具有类似番茄中识别 L E 一 A C S 6
启动子上各特殊顺式作用元件并与之相互作用以调
控 L E 一 A C S 6 基因特异性表达的反式作用因子 。 根
据 L E 一A C S 6 启动子活性在转基因拟南芥中表现 出
的上述发育特异性 , 以及外源乙烯抑制转基因拟
南芥中 L E 一 A C S 6 启动子活性的观察 (图 3) , 我们
推测 , 在拟南芥中很可能也存在着类似 “ 第一系
统乙烯 ” 调控植株生长发育过程的分子生物学机
制 。 目前我们正在进行 L E 一A C S 6 启动子上各种假
定顺式作用元件的缺失构建 , 以深入分析调控
L E
一
A C S 6 发育特异性的分子机制 。
除了调节果实发育 , 第一系统乙烯还指在植
物正常发育的营养生长期各组织器官中产生的基础
水平的乙烯 (B a n 下等 2 0 0 0) 。 我们观察到的 G U S 基
因在转基因拟南芥幼苗以及快速生长的茎顶端的高
水平表达 , 说明 L E一 A C S 6 基因的功能并不仅仅局
限于与器官成熟和衰老有关的发育过程 。 很可能
基础水平的乙烯是植物某些旺盛的生长发育阶段所
必 须 的 。
.3 2 L E
一
A C S 6 启动子在转基因拟南芥中表现响应
多种刺激因子的活性特点
外源生长素和伤害处理可以分别诱导 G U S 基
因在 L E 一A c s 6 : : G u S转基因拟南芥幼苗和叶片中高
水平表达 (图 3 、 4) , 说明 L E 一 A C S 6 启动子在拟
南芥中可以接受多种刺激因子的诱导 。
近年来 , 关于生长素与 乙烯控制植物生长发
育的协调作用多有报告 , 如用生长 素处理根部可
以 诱导猪秧秧茎部 的 乙烯合成 ( H a n s e n 和
G r o s s m a n n 2 0 0 0 ) ; 拟南芥下胚轴失去向光性的
突变体 n p h 4 , 其生长素诱导下胚轴弯曲功能受
损 , 外施 乙烯能逆转这一过程 (H a r p盯 等 2 0 0 0)
等 , 但是两种激素间 c r os s 一 at lk 的分子机制还不清
楚 。 我们发现无论环境中是否存在 10 林L/ L 的乙
烯 , 10 一 4 m ol /L 外源 N A A 都能明显促进 3 d 苗龄
转基因拟南芥中 L E ~ A C S 6 启动子的活性 (图 3) , 这
一研究结果表明生长素处理很可能是通过独立于乙
烯的途径 , 在转录水平促进某些 A C C 合成酶基因
的 表达 , 进 而 调 控 乙 烯 的 生 成 。 我 们利 用
P L A e E w
e b S i g n a l s c a n P r o g r a m (H ig o 等 2 9 9 9 ,
erP
s itr d ge 19 91 ) 进行启动子序列分析 , 分别在 A T G
上游 一 1 1 6 5 、 一 1 1 6 3 、 一 6 8 6 等 处发现了
N T B B F I A R R O L B
、
A U X R E P S I A A 4
、
G G T C C C A T G M S A U R 等生长素反应元件 ( a u x i n
er s p o n s i v e e l e m e n ts )的同源序列 , 推测这些可能的
顺式作用元件可能在生长素对 L E一 A C S 6 基因的表
达过程中发挥 了重要 的调控作用 。
伤害反应 (w o u n d r e s p o n s e )是植物对抗生物胁
迫 如 : 昆虫噬咬 、 病 原菌入侵等和非生 物胁迫
如 : 风 、 雨 、 机械损害等 , 所发展起来的防御
机制 。 许多植物生长 调节物质 如茉莉酸 、 水杨
酸 、 乙烯等都参与调控这一过程 , 对于各个不同
调控途径之间 “ cr o s s 一扭 lk ” 的研究有助于深入了
解植物响应 环境刺激的分 子机制 ( c h e o n g 等
2 0 0 2 )
。
伤害(w ou n id n g) 会诱导乙烯生成并进而影响植
物的伤害反应 早有报告 ( o ’ D o n n e l l 等 2 9 9 6 ) 。
c he on g等 (2 0 2 )利用基因芯片技术检测了拟南芥基
因组 8 2 0 0 个基因在转录水平对伤害的反应 , 发现
其中 8% 的基因的 m RN A 水平因伤害刺激而改变 ,
而且其中有很大部分是编码调节蛋白 。 c heo gn 等
认为可能有两种机制调控乙烯信号传导途径与伤害
植物生理与分子生物学学报 30 卷
反应之间的相互作用 : ( 1) 伤害诱导特殊 A C C 合成
酶基因表达 , 促进乙烯合成 ; ( 2) 伤害快速诱导许
多乙烯反应转录因子 (e t h y l e n e er s p o n s e tr a n s e h p t i o n
f a e t o r s )如 E R E B p (e t h y l e n e 一 r e s p o n s i v e e l e m e n t
b i n d i n g p r o t e i n s )表达 , 这些 E R E B p 可以直接参与
乙烯反应基因 ( e t h y l e n e 一 r e s p o n s i v e g e n e s )的活化
( C h e o n g 等 2 0 0 2 ) 。 T a t s u k i 和 M o r i ( 19 9 9 )曾经报
告 : 触碰 (t o uc h) 和伤害能诱导番茄叶片和果实中
L E
一
A C S 6 及 L E 一 A C S I A 的快速瞬时表达 。 我们在
LE
一
A C :S : G U S 转基因拟南芥 (图 4) 和转基因番茄中
都观察到 了伤害诱导 G u s 表达的现象 (待发表 ) ,
这一结果部分支持了 C h e o n g 等 (2 0 0 2) 的观点 , 但
是关于伤害在转录水平诱导 A C C 合成酶基因表达
的分子机制还不清楚 。
出乎意料的是 , C h e o n g 等 (2 0 0 2 )在研究中还
发现 目前己知的各种受生长素信号调控的下游生长
素反应基因 (a u x i n 一er sp o n s i v e g e n e s )大部分受伤害反
应 的负调控 。 这样 , 我们所观察到的 N A A 促进
伤害诱导的 L E 一A C S 6 基因的表达就成为一个很有
趣的现象 。 因为 L E 一A C S 6 是一个受乙烯负调控的
基因 , 不可能通过上述的 E R E B P 机制在转录水平
上调 , 从我们的观察结果 (图 4) 推测 : 伤害诱导
L E
一
A C S 6 基因在转基因拟南芥叶片快速表达 , 很
可能是通过一条独立于乙烯之外的生长素介导的信
号传 导途径进行的 。 而在 内源情况下 , 响应伤害
刺激经生长素诱导的某些特定 A C C 合成酶基因的
表达 , 并不导致生长素反应 , 而是促进 乙烯生成
以增强植物抵抗逆境的防御机制 。 这有可能成为
解释一些 A C C 合成酶基因 , 尤其是那些受乙烯负
调控的 A C C 合成酶基因表达调控的新机制 。 我们
注意到 c h e o n g 等 (2 0 0 2) 利用基因芯片技术所发现
的伤害诱导表达的拟南芥 A C C 合成酶基因为 A t -
A C S 6 基因 , 它恰好与 L E 一 A C S 6 类似 , 也是一种
响应多种刺激因子的 A C C 合成酶基因 , 其表达受
生长素上调 ( A r t e e a 和 A r t e e a 19 9 9 ) 。
参 考 文 献
A b e le s S
,
T h e o l o g i s A ( 199 6 )
.
E a r ly g e n e s a n d a u x i n a e t io n
.
P la n t P hy s i o l
,
1 11 : 9一 17
A rt e e a JM
,
A rt e c a R N ( 19 99 )
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A m u lt i
一
re s Po ns i v e g e ne e cn o icl n g
1
一 a m in o c y c l o P ll 〕Pa n e 一 l 一e a rb o x y la t e s y n ht a s e (A C S 6 ) i n
m atu re A
r a b id op s is l e a v e s
.
P la
n t M o I B i o l
,
39 : 20 9一 2 19
B a r r y C S
,
L lo P T o u s M l
,
rG i
e r s o n D (20 00 )
.
T h e re g u liat on o f
l
一 a m i n o e y e l o P r o P a n e小 e a r b o x y li e a e i d s y n th a s e g e n e
e x P re s s io n d u ir n g ht e atr n s iit o n ofr m
s y s t em
一
1 t o s y s te m
,
2 e t h y l e n e s y n t h e s i s i n t o m at o
.
P la n r P勺5 10 1, 1 23 (3 ):
9 79一 9 8 6
C h e o n g Y H
,
C h a n g H S
,
G u P t a R
,
W
a n g X
,
Z h u T
,
L u a n S
(20() 2 )
.
rT an
s e ir tP i o n al P r o if li n g re v e a ls n o v e l i n te ar e it o n s
b e tw e e n w o u n d in g
,
P a t h o g e n
,
iab
o it c s tre s s
,
an d h o rm on al
re s P o n s e s i n A ar b ij op
s
i
s
.
P al n t hP 夕5 10 1
,
12 9 : 66 1一 6 77
C l o u g h S J
,
B e n t A F ( 1 99 8 )
.
lF o r a l d i P
: a s im P li if e d m e ht o d fo r
A g or b a
e re r i u m
一
m e d i at e d tr a n s fo mr at i
o n o f A ar b i d OP s i s
ht a li a n a
.
P la n r J, 16 : 7 3 5一 74 3
H a n s e n H
,
G or s sm an K (2X() 0 )
.
A u x in
一
i n d u e e d e t h y le n e itr g g e rs
a b s e i s i e a e id b i o s y n ht e s i s a n d g r o w ht in h i b i t i o n
.
P la
n t
P勺 5 10 1, 124 : 14 37 一 14 8
H a rP e r RM
,
S ot w e
一
E v a n s E L
,
L u e s s e D R
,
M u ot H
,
T a et m a t s u
K
,
W
a t a h i k i M K
,
Y a m a m o to K
,
L i s e u m E (2 0 00 )
.
T h e
刀尸4H l o e u s e n e o d e s ht e a u x i n
r e s P o n s e af e t o r A R F 7
, a
e o n d i t i o n a l r e g u l a t o r o f d i fe
r e n t i a l g r o w t h i n a e r i a l
A ar b i J口l , 515 t i s s u e
.
P la n t eC l l
,
12 : 75 7一 7 70
H i g o K
,
U g a w a Y
,
Iw a m o to M
,
K o re n a g a T (19 99 )
.
P l a n t
e is
-
a e t i n g r e g u l a t o r y D N A e le m e n t s (P L A C E ) d a t a b a s e
.
Nu
e le ic A c ids R
e s , 27 ( l ) : 29 7
一
30 0
J e fe
r s o n R A ( 198 7 )
.
A s s a y i n g e h im e ir e g e n e s i n Pl a n t s : th e
G U S g e n e fu s i o n s y s te m
.
p la n t M o l B i
o
l R印 , 5 : 3 87 一4 0 5
J e fe
r s o n R A
,
W il s o n KJ ( 199 1)
.
T he G U S g
e n e fu s i o n s y s t e m
.
P la n t M
o
l B i
o l M d
n u a乙B 14 : l 一 3 3
K e n d e H ( 19 9 3 )
.
tE hy le n e b i o s y n ht e s i s
.
A n n u R e v P al n t P人〕 510 1
P la n t M
o
l B i
o
l
,
44 : 2 83一 30 7
L i n e o l n J E
,
C a m P b e ll A D
,
o e t ike r J
,
R o t t m a n n W H
,
o e l le r
PW
,
Sh e n N F
,
T h e o l o g i s A ( 19 9 3 )
.
L E
一
A C S 4
, a fr u i t
r
i P e n i n g a n d w o u n d
一
i n d u e e d l
一 a m i n o e y e lo P r o Pa n e
一
l
-
e a r b o x y la t e s y n t h a s e g e n e o f t o m a t o (yL
e
op e
r s i c o n
e s e u le n t u m )
.
E x P r e s s i o n i n sE
e
h e
r
i
c
h ia
e o li
, s
utr
e t u r a l
e h a r a e t e
r i z a t i o n
,
e x P r e s s i o n e h a r a e t e r i s t i e s
, a n d
Ph y lo g e n e t i e an
a ly s i s
.
J B i
o
l C h
e
m
,
2 68 (2 6 ) : 19 42 2
-
19 4 30
M eM u cr h i e EJ
,
M e G l a s s o n W B
,
E ak s IL (1 9 7 2 )
.
T r e a tn
l e n t o f
f r u i t w i t h P r o P y l e n e g i v e s i n f o r m a t i o n a b o u t t h e
b i o g e n e s is o f e t h y l e n e
.
Na
t u r e , 2 37 : 2 35一 23 6
N a k a t s u k a A
,
M u r a e h i S
,
O k u n i s h i H
,
S h io m i S
,
N a k a n o R
,
K u b o Y
,
I n a b a A ( 19 9 8 )
.
D i fe
r e n t i a l e x Pr e s s i o n a n d
in t e r n a l fe e db a e k r e g u l a t i o n o f l
一 a m in o e y e l o P r o P a n e
一
l
-
e a r b o x y l a t e s y n t h
a s e , l
一 a m i n o e y e l o P r o P a n e
一
l
-
c a r b
o x y l a te o x i d a s e
,
a n d e ht y le n e re e e Pt o r g e n e s in t o m a t o
fr u it d u r i n g d e v e l o P m e n t a n d r i Pe n i n g
.
P l a
n t P h夕5 10 1 ,
11 8 : 12 95 一 130 5
O
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D
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,
C a l v e r t C
,
A t z o r n R
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HM O
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B o w l e s D J ( 199 6 )
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S
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,
27 4
: 19 14 -
3 期 樊 荣等 : L E 一 C 6A S启动子在 L E 一 AC 6 S: : U G S转基因拟南芥中的特异性 3 57
1 9 1 7
o el l er PW
,
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,
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S e i e n e e
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Y a n g S F ( 199 7 )
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n ti a l
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(yL e op
e sr ie o n e s c u le n t u m )
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O l s o n D C
,
o e t ike
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Y an g S F ( 19 95 )
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A n a ly s i s o f L E
一
A CS 了,
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一a m i n o e y c l o P r o P an
e 一 l
一c a r b o x y l ic ac id s y n ht a s e g e n e
e x Pre s s e d d u ir n g fl o o d i n g in t h e or o t s o f t
o m at o P lan t s
.
J
B i o l C h e m
,
2 70 : 14 0 56 一 140 6 1
P r e s t r id g e D S (19 9 1 )
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S i g n al s e a n : a e o m Pu te r Pr o g r am ht a t
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P e te r G F
,
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K e lle r J A
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Sh e n N F
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,
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1
-
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e n e o d e d b y a m u l t ig e n e fa m i l y w h o s e t r a n s c r iP t io n 15
in d u
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.
J M
o
l B i
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S h i u O Y
,
O e t ik e r JH
,
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Y a n g S F ( 19 9 8 )
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T h e P
r o m o te r
o f L E
一
A C S 7
, a n e a r l y f l o o d i n g
一
i n d u e e d l
一 a m i n o
-
c y e lo P r o P a n e小 e a ht o x y l at e s y n t h a s e g e n e o f t h e to m a to ,
15 t a g g e d b y a 5
0
1了 tr an s Po s o n . P or e aN r l A c a d cs i U SA ,
95 : 1 03 34 一 10 33 9
T a t s u kl M
,
M o ir H (199 9 )
.
R ap i d an d tr a n s ie n t e x Pre s s io n o f l
-
a m i n o e y c l o Pr o Pa n e小 e a r b o x y l a t e s y n th a s e i s o g e n e s b y
t o u e h a n d w o u n d s t im u li i n t o m a to
.
P l a n l C e ll P妙 5 10 1,
40 : 70 9一 7 15
Y a n g S F
,
H o f ln a n N E ( 19 84 )
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E t h y le n e b i o s y n t h e s i s a n d it s
r e g u l a t i o n i n h i g h e r P la n t s
.
A n
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R e
v
P l a n t P hy s io l
,
3 5 : 1 55一 18 9
Y an g SF ( 1 9 87 )
.
hT
e r o le o f e ht y l e n e a n d e ht y le n e s y n t h e s i s in
fur it ir P
e n in g
.
I n : hT
o m s o n WW
,
N o ht n a g e l E A
,
H u f a k e r
R C ( e d s )
.
P l a n t S e n e s e e n e e : I t s B i o e h e m i s t r y a n d
hP y s i o lo g y
.
hT
e A m e ir e an S
o e i e ty o f P l a n t hP y s io lo g i s t s
,
156一 1 66
5 8 3
J o unr a l ofP 勿n tPh y s ioe lgy a n d M d e l c ua lr Bt o l ogy 2 04 0, 3 0 (3 ) : 3 5 1一3 58
P r o m o t e r S P e ic if e i yt o f L E一CS 石G e n e i n L E · A C S 6 : : G U S I丫a n s g e in c
A ar b id op s is P l a n t s
F AN R o n g
l , 认钱N iX ao 一R on g l , Z H AN G W e n江h 0 1 , w AN G Shu 一F an g l ,认叭凶 G 、 b n g l , Z H U L i an g -
Ji
l , 场人N G N in g 一N in g l ` , M in g 一C h e S H IH Z , eY e 一uY n g C H A R N G 3 , S h an g F a YA N G 4
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,
D eP
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o c h e m i s t仔 a n d M 口 l e e u la r B i o lo g苏 OC ll e g e of L ife sc i亡n e e s , Na n ka i nU i v e r s i yt, T ia nj i n 30 0 0 7 1
,
C h i n a ; Z D eP
a r tm e n t oj
B i o l o g ie a l S c ie n e e s
, 饰 i v e rs i ty of ol w a , Io w a 5 2 2 4 2 , U S A ; 3I n s t i t u t e of B i o a g r i c u l t u r a l S c i e n e e s , A e a d e m i a S i n i e a , T a iP e i 1 15 2 9 ,
T a iw a n ;
月几夕口 n n aL b o r a t o ry
,
U n i v e sr iyt of aC l扣 nr i a , C A 9 5 6 1 6 , U S A )
A b s t r a e t : T h e L E
一
A C S 6 g e n e e n e o d e s A C C
s y n ht a s e
,
ht e ke y e n z y m e o f e ht y le n e b i o s y n ht e
-
515 P a t h w a y
.
A e c u m u la t i o n o f L E
一
A C S 6 t r a n
-
s c ir P t s 15 e o n c o m i t a n t w i ht th e s y s t e m 1 e ht y l
-
e n e P r o d u e t io n i n t h e P r e
一 c l im a e t e r i e t o m a t o
fur i
t
,
an d b o ht aer d
o
wn er g
u l at e d b y e x o g e n o u s
e ht y le n e etr
a tm e n t
.
oT
e lu e id a et ht e P o s s i b le or l e
o f s y s t e m 1 e th y l e n e i n P l a n t d e v e lo Pm e n t a n d
in v e s it g at e ht e Por m o t e r it s s u e s P e e iif e i ty o f LE
-
A C肠 g e n e , s t ab le tr an s fo n n a t io n o f A ar b idol ) 5 15
w iht a L E
一
A C S 6 P or mo
ter
一
G U S fu s io n e o n sutr
e t
b y A g or b a e et r iu m m e ht o d h a s b e e n d o n e
.
H I S t o c h e m i C al loc a li z a ti o n o f G U S a C t i v
-
i t y a n d p
一
g l u e u r o n i d a s e e n z y m e a s s a y i n
t r a n s g e n ie L E
一
A C S 6 : :G U S P lan t s s h o w e d s otr
n g
e x P er s s i o n o f G U S in e o t y le d o n s a n d h y P o c o t
-
y l s o f 6 d s e e d l in g s
,
b u t n o G U S a e t iv i t y w a s
d e t e e t e d in r o ot s (F ig
.
ZA )
.
T h e G U S a e t iv i ty o f
6 d s e e d li n g w a s in e r e a s e d s i g n iif e a n t ly w h e n
ter a t e d w iht N A A 10
一
4m o比 (F i g . 3 ) . I n 4 0 d r o -
s e t t e le a f L E
一
A C S 6 P r o m o t e r dir v e n G U S g e n e
w a s P r e d o m i n a n t ly e x P er s s e d in m a t u r e le a v e s
.
L o w e r le v e l o f G U S e x Pr e s s io n w a s d e t e e et d in
y o u n g e r an d o ld e r l e a v e s (F i g
.
ZB )
.
W o u n di n g
w a s fo u n d t o in e r e a s e G U S g e n e e x Pr e s s i o n in
t r a n s g e n i e l e a v e s (F i g
.
4 )
.
A g a i n
,
e x o g e n o u s
N A A w a s fo u n d t o in e r e a s e ht e G U S a e it v i ty in
w o u n d e d le af it s s u e (F ig
.
4 )
.
S otr
n g s t a i n in g r e
-
a e t i o n w a s o b s e r v e d i n ht e t o P P a r t o f r ap i d ly
g r o w i n g s t e m s (F i g
.
Z C )
.
I n d ife
r e n t d e v e lo P
-
m e n t a l s t a g e s o f A ar b id op
s i s s e e d s
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