全 文 ：园 艺 学 报 2009, 36 (7) : 1071 - 1076
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 11 - 03; 修回日期 : 2009 - 05 - 25
基金项目 : 国家转基因植物研究与产业化开发专项项目 (JY042B202)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: liuyz_g@ yahoo1com1cn)
日本石楠工厂化快繁体系的建立及再生苗遗传稳定
性的分子鉴定
李毅丹 1 , 谭 化 1 , 单晓辉 2 , 李凤霞 3 , 刘艳芝 13
(1 吉林省农业科学院生物技术研究中心 , 长春 130033; 2 吉林大学农学部植物科学学院 , 长春 130062; 3 东北师范大
学生命科学学院 , 长春 130024)
摘 要 : 以日本石楠 [ Photin ia glabra ( Thunb. ) Maxim. ] 为材料 , 建立了一套高效的适合工厂化生产
的腋芽再生组织培养体系。该体系包括芽诱导培养基 (MS + 112 mg·L - 1BAP + 012 mg·L - 1 NAA ) , 继代
培养基 (W PM + 0175 mg·L - 1 BAP + 0115 mg·L - 1 NAA ) 和生根培养基 (1 /2MS + 215 mg·L - 1 IAA + 013
mg·L - 1 IBA)。在培养出的超过 10万株的组培再生苗中 , 随机选出 36株和 24株进行 AFLP和 MSAP检测
遗传和 DNA甲基化的变化。在检出的 615条 AFLP条带和 392条 MSAP条带中 , 并未发现任何变异 , 表明
建立的腋芽再生培养体系稳定可靠 , 适合于日本石楠的工厂化生产。
关键词 : 日本石楠 ; 腋芽再生 ; 遗传 /表观遗传稳定性
中图分类号 : S 687 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2009) 0721071206
Eff ic ien t M icropropaga tion of Japanese photin ia [ Photin ia glabra ( Thunb. )
M ax im. ] Reta in ing Genetic and Ep igenetic Stab ility
L I Yi2dan1 , TAN Hua1 , SHAN Xiao2hui2 , L I Feng2xia3 , and L IU Yan2zhi13
(1B iotechnology Research Cen ter, J ilin A cadem y of A gricultural Sciences, Changchun 130033, Ch ina; 2 College of P lan t Science,
J ilin U niversity, Changchun 130062, Ch ina; 3 School of L ife Science, N ortheast N orm al U niversity, Changchun 130024,
China)
Abstract: W e established a tissue culture system for efficient m icrop ropagation of Japanese photinia
[ Photin ia g labra ( Thunb. ) Maxim. ] by enhanced branching of axillary buds taken from branches of a single
donor tree. The culture system consists of choosing the suitable exp lant coup led with sequential use of three
media, namely, the bud2induction medium (MS medium supp lemented with 112 mg·L - 1 BAP, 012 mg·
L - 1 NAA) , subculture medium (W PM medium added with 0175 mg·L - 1 BAP, 0115 mg·L - 1 NAA ) and
root2induction medium ( half2strength MS medium fortified with 215 mg·L - 1 IAA and 013 mg ·L - 1 IBA). In
addition, by using AFLP and MSAP markerswe investigated the genetic and DNA methylation pattern stability
of samp les of 36 and 24 morphologically normal p lants respectively, which were random ly taken from a popu2
lation of more than 100 000 m icrop ropagated p lants established in the field. W e found that of the 615 and 392
rep roducible bands scored respectively for AFLP and MSAP, no evidence for occurrence of genetic or ep ige2
netic instability. This, together with phenotyp ic uniform ity of the m icrop ropagated population, suggests that
m icrop ropagation through enhanced axillary bud branching ensured genetic and ep igenetic fidelity of the donor
p lant in Japanese Photinia. Therefore, the p rotocol reported here can be readily emp loyed for large2scale com2
mercial p ropagation of this ornamental p lant species.
Key words: Photin ia g labra ( Thunb. ) Maxim. ; axillary bud; genetic / ep igenetic stability
园 艺 学 报 36卷
日本石楠 [ Photin ia g labra ( Thunb. ) Maxim. ] 为蔷薇科观赏植物 , 近年来被引入我国作为彩色
景观树种广泛种植。日本石楠较之国内已有的杂交种石楠 ( Photin ia fraseri‘Red Robin’) 遗传背景更
为清晰 , 表型稳定 , 是更为理想的经济树种。关于杂交种石楠的组培快繁研究 , 近年来已有报道
(李慧 , 2004; 王红梅 等 , 2004; 王晓冬 等 , 2005; 李际红 等 , 2006) , 这些研究主要关注的是石楠
组培过程中的一些技术难点 , 如生根困难等 , 对日本石楠这种非杂交种的组织培养 , 特别是建立一套
适合工厂化生产的日本石楠快繁体系的相关研究还未见报道。
本研究的目的是建立一套可应用于大规模工厂化生产的、高效稳定的日本石楠组培快繁体系 ; 并
应用 AFLP ( amp lified fragment length polymorphism, 扩增片段长度多态性 ) (Vos et al. , 1995) 和
MSAP (methylation2sensitive amp lified polymorphism, 甲基化敏感扩增多态性 ) (Xiong et al. , 1999)
分子标记技术 , 鉴定再生植株的遗传与表观遗传稳定性。
1 材料与方法
111 外植体及其培养条件
试验于 2002—2004年进行。选取由日本引入的日本石楠当年生半木质化枝段 , 去除叶片 , 以
115～215 cm至少具有一个以上腋芽的茎段为外植体 , 自来水冲洗 30 m in, 在无菌条件下先用 70%酒
精表面消毒 20 s, 再用 011% HgCl2溶液处理 10 m in, 无菌水冲洗 6～8次 , 接种于添加不同植物生长
调节剂的培养基上进行光照培养。培养基 pH 518, 培养温度 ( 24 ±1) ℃, 光照 14 h·d - 1 , 光照强
度 42μmol·m - 2 ·s- 1。
112 培养基的选取
外植体首先接种于不同的芽诱导培养基 (表 1) ; 外植体腋芽伸长 2 cm左右 (约 25 d) 转移至不
同的继代培养基 (表 2) , 继代培养后 , 继代苗接种到不同生根培养基 (表 3) 诱导生根。
113 生根苗的移栽
生根苗移栽前在温室炼苗 3～5 d, 小心洗去根部培养基 , 移栽至装有珍珠岩 ∶草炭土为 1∶2的苗
盘中。温室温度 (25 ±2) ℃, 相对湿度 80% , 遮光。成活幼苗两个月后移出温室种植。
114 D NA的提取及 AFL P /M SAP分析
以母株为对照材料 , 在超过 100 000株组培再生苗中 , 挑选 35株进行遗传稳定性的检测。采集
时 , 首先对植株的形态学特征进行鉴定 , 主要观察株形、叶形、分支状态等特征。然后用改良的
CTAB法 ( Kidwell & O sborn, 1992) 提取幼嫩叶片的基因组 DNA, 并通过电泳检测 DNA质量和定量。
AFLP分析按照 Vos等 (1995) 的标准程序进行 , 选择一对预扩增引物和 15对选择性扩增引物
进行试验 ; MSAP分析则按照 Xiong等 (1999) 的标准程序进行 , 选择了一对预扩增引物和 10对选
择性扩增引物。AFLP和 MSAP选择性扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 凝胶浓度为 8% , 55 W 恒
定功率 , 55 ℃恒温 , 电泳 315 h, 最后银染显色。上述组培及分子鉴定均重复 3次。
数据统计分析使用 SPSS1115软件完成。
2 结果与讨论
211 日本石楠高效离体快繁体系的建立
在芽诱导培养基筛选过程中发现 , MS + 112 mg·L - 1 BAP + 012 mg·L - 1 NAA的效果最为理想
(表 1; 图 1, C)。在该培养基上 , 外植体经培养一周左右 , 诱导出大量新的腋芽 (图 1, D )。在该
培养基培养 4周后进行继代 , 继代系数可达 3122 ±0113。同时观察到 , 外植体在无植物生长调节剂
的 MS中即可产生再生芽 , 但在某些添加植物生长调节剂的培养基中再生芽的产生反而受到了抑制 ;
另外单纯的添加 BAP并不能实现增加丛生芽的目的 , 需辅以适合浓度的 NAA (表 1)。
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7期 李毅丹等 : 日本石楠工厂化快繁体系的建立及再生苗遗传稳定性的分子鉴定
图 1 日本石楠高效再生体系
A. 母株。B、C. 接种的外植体产生新的顶芽及经过 2周芽诱导培养产生多个侧芽。D. 图 C中再生芽在
新培养基中培养 3周。E. 生根培养 4周。F～H. 移栽后在温室生长。 I. 再生苗在室外生长。
F ig. 1 Eff ic ien t m icropropaga tion of Japanese photin ia
A. The donor mother p lant. B, C. Examp les of a p rimary and a secondary exp lant p roducing an ap ical bud and several axillary buds cultured
for 2 weeks in the bud2induction medium. D. Shoots dissected from figure C elongated after being cultured on the elongation medium for
3 weeks. E. Root development on subcultured shoots from figure D after being cultured on the root2induction medium for 4 weeks.
F - H. Acclimatized p lantlets growing in pots containing sand and loamy soil (1∶2) . I. Plants established in the field.
表 1 不同植物生长调节剂配比条件下腋芽诱导率
Table 1 Effects of d ifferen t concen tra tion s of two plan t growth regula tors added to M S ba sa l
m ed ium on eff ic iency of ax illary bud induction in Japanese photin ia ( Photin ia g labra )
植物生长调节剂 / (mg·L - 1 ) Plant growth regulators
BAP NAA
腋芽数量
Number of axillary buds
0 0 1143 ±0121B
110 015 无 None
112 015 无 None
115 015 无 None
210 015 1111 ±0115B
310 015 2134 ±0134C
110 014 无 None
112 014 无 None
115 014 0169 ±0137A
210 014 1128 ±0144B
115 012 2199 ±0126D
112 012 3122 ±0113D
注 : 基本培养基 MS, 3%蔗糖 ; 每组数值为 60株外植体经 3次重复的数据 , 后注相同字母表示在 P≤ 0101水平上差异不显著。
Note: MS basal medium, 3% sucrose; Each value is the mean ±standard error of 60 exp lants three rep licates, and values followed by the
same letter are not significantly different ( P≤0101) .
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从控制成本的角度考虑 , 在诱导培养产生大量新的腋芽后 , 就要转移到更简单廉价的继代培养基
中。如表 2所示 , 继代培养基 W PM + 0175 mg·L - 1 BAP + 0115 mg·L - 1 NAA较为理想 , 继代系数可
维持在 3以上 , 其它培养基继代系数低或者常出现弱苗、落叶等不良状态。
经过两周的生根培养 , 大多生根培养基诱导生根率达到 80%左右 , 特别是 1 /2MS + 215 mg·
L - 1 IAA + 013 mg·L - 1 IBA, 诱导生根率可达到 90%以上 (表 3) , 而后续的移栽成活率也达到 95%
以上 (图 1, F～H)。
利用这套理想的快繁体系 , 已经生产出日本石楠超过 100 000株 , 这些植株的形态、分枝状态和
叶片形状等没有发现变化 , 初步证明该体系的稳定性。
本试验并未遇见生根困难等技术难题 , 这也许与品种的差异有很大关系。另外 , 选取半木质化的
新枝作为外植体材料 , 选择最适的激素配比 , 确定培养基也是这套体系建立的关键。
表 2 日本石楠不同植物生长调节剂配比
条件下腋芽继代再生状况
Table 2 Effects of d ifferen t concen tra tion of plan t growth
regula tors added on ax illa ty bud m ultiplica tion dur ing
subculture of Japanese photin ia ( Photin ia glabra )
BAP /
(mg·L - 1 )
NAA /
(mg·L - 1 )
再生芽数量
Number of
axillaty shoots
再生芽直径 /mm
D iameter of
axillaty shoots
0150 0150 1132 ±0111 1182 ±0109AB
0175 0150 1138 ±012 1182 ±0114AB
1100 0150 1156 ±0116 1176 ±0126B
3100 0150 4158 ±0154 1122 ±0132C
0150 0130 1146 ±0192 1184 ±0119A
0175 0130 1189 ±0121 1189 ±0109A
1100 0130 2106 ±0151 1179 ±0117B
0175 0115 3132 ±0122 1179 ±0125B
0150 0115 3101 ±0146 1180 ±0122AB
0175 0105 4156 ±0112 1134 ±0111C
0150 0105 3188 ±0111 1125 ±0120C
注 : 基本培养基为 W PM, 3%蔗糖 ; 直径以芽基部上 1 cm处
为准 ; 每组数值为 60株继代苗经 3次重复的数据 , 后注相同字母
表示在 P≤0101水平上差异不显著。
Note: W PM basal medium, 3% sucrose; D iameter was measured
at the height of 1cm from the shoot base; Each value is the mean ±
standard error of 60 exp lants three rep licates, and values followed by
the same letter are not significantly different ( P≤0101) .
表 3 不同植物生长调节剂配比条件下再生苗的生根率
Table 3 Effects of d ifferen t concen tra tion of plan t growth
regula tors added on rooting percen tage of
Japanese photin ia ( Photin ia g labra )
BAP /
(mg·L - 1 )
NAA /
(mg·L - 1 )
生根率 /%
Rooting percentage
215 012 8313
215 013 9412
215 014 8715
215 015 8811
310 012 8414
310 013 8316
310 014 8813
310 015 8314
310 016 8019
310 017 7915
310 018 7612
315 012 7917
315 013 7811
315 014 7716
315 015 7711
注 : 基本培养基为 1 /2MS, 2%蔗糖 ; 每组数值为 1 000株生
根继代苗经 3次重复的统计结果。
Note: 1 /2MS basal medium, 2% sucrose; Each value is the mean
of 1 000 p lantlets three rep licates.
212 再生苗遗传稳定性的检测
选择继代次数超过 10次、来源于不同的培养时间、在不同的苗床上进行生根移栽的 35株苗 , 检
测其变异情况。
15对 AFLP选择性引物获得了 615条扩增条带 , 每对引物扩增条带为 17～58条 (平均为 41条 ) ;
10对 MSAP选择性引物获得 392条扩增条带 , 每对引物扩增条带为 22～52条 (平均为 3912条 )。没
有发现序列变异和 DNA甲基化变异的发生 (图 2, 图 3)。
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这一结果与在松树、栗树中的研究结果 ( Goto et al. , 1998; Carvalho et al. , 2004) 较为一致 , 但
与在香花槐、菠萝、棕榈等相关研究结果 ( Soneji et al. , 2002; B indiya & Khawar, 2003; Shu et al. ,
2003; Guo et al. , 2006) 不同。分析其原因 , 日本石楠与松、栗树等均属木质部结构较为致密的树
种 , 并且在组织培养过程中选择半木质化的幼嫩石楠枝条作为外植体材料 , 而且在继代过程中继代苗
的茎杆基本保持着半木质化状态 , 这可能在很大程度上减轻了外源植物生长调节剂对腋芽分化的影
响 , 大大降低了体细胞无性系变异产生的几率。虽然在香花槐研究中也是选择半木质化枝条作为外植
体 , 但培养过程中继代苗茎杆逐渐细化 , 木质化消失 , 体细胞无性系产生变异 ( Guo et al. , 2006)。
因此推测 , 通过腋芽再生方式进行木本植物离体快繁 , 能否保持自然生长状态 , 保证适当的木质化程
度 , 选择合适的取材时机 , 调整培养基配比 , 调控培养条件 , 避免木质化严重退化 , 是降低体细胞无
性系变异产生的一个关键因素。
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