全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（12）：2401–2410 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–08–09；修回日期：2011–10–24
基金项目：国家自然科学基金项目（31071669）；四川省财政基因工程专项（2011JYGC05-018）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：honghuilin@vip.sina.com）
葡萄卷叶伴随 3 型病毒和葡萄 A 病毒的多重检
测及其系统进化分析
王建辉 1,2,3，刘建军 4，陈克玲 2，李洪雯 2，席德慧 1，林宏辉 1,*
（1 生物资源和生态环境教育部重点实验室，四川大学生命科学学院，成都 610064；2 四川省农业科学院园艺研究所，
成都 610066；3 农业部西南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，成都 610066；4 四川省农业科学院，成都
610066）
摘 要：葡萄卷叶伴随 3 型病毒（Grapevine leafroll associated virus-3，GLRaV-3）和葡萄 A 病毒
（Grapevine virus A，GVA）常常复合侵染部分主栽欧美杂交葡萄品种。以半定量 RT-PCR 与 qRT-PCR 方
法研究了‘希姆劳特’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Himrod’）中不同组织内病毒的相对积累量，
结果表明叶脉和韧皮部内的病毒相对积累量显著高于其他组织。以成熟枝条韧皮部组织的 cDNA 为模板，
优化了 RT-PCR 多重扩增体系，可以同时扩增待测样本中两种病毒的目标基因。从一株复合感染 GLRaV-3
与 GVA 的‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Fujiminori’）中，分别克隆了 GLRaV-3 外壳蛋
白（coat protein，CP）基因全长序列和 GVA 部分基因组区域序列，后者包括 CP 基因的部分序列与病毒
RNA 沉默抑制子（viral suppressor of RNA silencing，VSR）基因全长序列。病毒核酸同源性分析与系统进
化研究表明，不同 GLRaV-3 分离物的 CP 高度保守；而‘藤稔’葡萄的 GVA 分离物包含多种变异株，具
有准种病毒的特点。
关键词：葡萄；葡萄卷叶伴随 3 型病毒；葡萄 A 病毒；病毒外壳蛋白基因；病毒 RNA 沉默抑制子基
因；RT-PCR 多重检测；病毒变异株
中图分类号：S 663.1；S 436 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）12-2401-10

Optimizing Multiple Detection and Phylogenetic Studies on Grapevine
leafroll associated virus-3 and Grapevine virus A
WANG Jian-hui1,2,3，LIU Jian-jun4，CHEN Ke-ling2，LI Hong-wen2，XI De-hui1，and LIN Hong-hui1,*
（1Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment，Ministry of Education，College of Life Science，Sichuan
University，Chengdu 610064，China；2Horticulture Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，
China；3Key laboratory of Horticultural Crops Biology and Germplasm Enhancement in Southwest Regions，Ministry of
Agriculture，Chengdu 610066，China；4Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China）
Abstract：Co-infection of Grapevine leafroll associated virus-3（GLRaV-3）and Grapevine virus A
（GVA）was a common phenomenon on some cultivars of Vitis vinifera L. × Vitis labrusca L. in Sichuan
Province. Semi-quantitative RT-PCR and qRT-PCR were used to investigate the relative accumulations of
the aforementioned two viruses in different tissues of infected grape trees（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.

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‘Himrod’）. The results suggested the relative accumulations of viruses in petiole and phloem were
higher than that of others tissues. The multiple RT-PCR was developed to amplify the target genes of
GLRaV-3 and GVA in phloem tissues of mature shoots（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Fujiminori’）
simultaneously. The full length of coat protein gene（CP）of GLRaV-3 and partial genome region of GVA
（including partial sequence of CP and full length of viral suppressor of RNA silencing gene，VSR）were
cloned from V. vinifera L. × V. labrusca L.‘Fujiminori’separately. The nucleotide homology analysis and
phylogenetic studies on different isolates of each virus were possibly revealed that CP from different
GLRaV-3 isolates was highly conserved，whereas GVA Sichuan isolate contained very divergent variants
and thus it could be quasispecies.
Key words：grape；Grapevine leafroll associated virus-3；Grapevine virus A；coat protein；virus
silencing suppressor；multiple RT-PCR；variant

葡萄可被多种 RNA 病毒感染产生卷叶病、皱木复合病等。感染卷叶病的植株中最常见的病原
分离物是葡萄卷叶伴随 3 型病毒（Grapevine leafroll associated virus-3，GLRaV-3）。而皱木复合病包
含 Kober 茎沟病等不同症状，主要病原物为葡萄 A 病毒（Grapevine virus A，GVA）。GLRaV-3 全长
17 919 bp，由 13 个开放阅读框（open reading frame，ORF）组成，是一个单一、未分化的病毒种群
（Turturo et al.，2005）。GVA 全基因组大约 7 300 bp，编码蛋白包括复制酶、19 kD 未知功能蛋白、
移动蛋白、外壳蛋白（coat protein，CP）和病毒 RNA 沉默抑制子（viral suppressor of RNA silencing，
VSR）。而 GVA 种群包含 3 个系统进化组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组）以及待证明的Ⅳ组（Murolo et al.，
2007）。
快速灵敏的检测方法对于葡萄病毒（或变异株）的检测和研究、无毒苗木的生产具有重要意义。
例如 PCR-RFLP（扩增产物限制性酶切片段长度多态性）技术用于 GVA 种群多样性研究（Murolo et
al.，2007）。利用寡核苷酸保守引物对，RT-PCR 特异检测 GVA 种群内的普通变异株与温和变异株
（Goszczynski & Jooste，2003）。Goszczynski（2007）使用 SSCP（单链构象多态性）技术发现葡萄
衰退病与 GVA 第Ⅱ组变异株感染有关。由于没有健全的无病毒种苗繁育与监管体系，并且缺乏科
学的日常栽培管理技术，常常发现植株复合感染 GLRaV-3 和 GVA（刘晓 等，2006）。这可能与病
毒传播介体粉蚧（Heliococcus bohemicus）有关。据报道粉蚧可以同时传播 GVA 与 GLRaV-3（Zorloni
et al.，2006）。目前还未见 GLRaV-3 与 GVA 多重检测方法的报道。
建立一套针对这两种病毒的多重 RT-PCR 检测方法，为无病毒苗木繁育体系提供一种快速、可
靠的检测技术，并对混合感染的 GLRaV-3 与 GVA 开展了遗传变异和系统进化研究，可为葡萄病毒
病防控提供技术支持和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
以四川省葡萄主栽品种之一‘希姆劳特’为材料（四川省农业科学院园艺研究所资源圃保存），
开展不同组织内病毒相对积累量与多重 RT-PCR 病毒检测研究。以资源圃内的欧美杂交品种为待测
样本，包括‘藤稔’1 株（样本编号 1）、‘红富士’2 株（样本编号 2，3）、‘无核王子’5 株（样本
编号 4 ~ 8）、‘南抗 1 号’1 株（样本编号 9）。1 ~ 9 号样本与健康植株用于验证多重 RT-PCR 检测方
法的准确性。
12期 王建辉等：葡萄卷叶伴随3型病毒和葡萄A病毒的多重检测及其系统进化分析 2403

1.2 DAS-ELISA 检测
参考 Clark 和 Adams（1997）的方法，采用 DAS-ELISA（Agritest，意大利）分别检测上述所有
样本的带毒情况。
1.3 qRT-PCR 与半定量 RT-PCR 研究不同组织内葡萄病毒相对积累量
从 GenBank 数据库中获得 GLRaV-3 分离物全长基因组序列（登录号：NC004667）和 GVA 全
长基因组序列（DQ855088，X75433），利用软件（Primer premier，美国）设计目的基因的上、下游
引物对（表 1）。
采用改进硅胶颗粒吸收法（Foissac et al.，2000），于 2009 年 5 月分别提取‘希姆劳特’葡萄不
同组织（叶脉、韧皮部、幼果与果梗）的总 RNA。取 500 ng 总 RNA 和 500 ng 的 6 碱基随机引物，
反转录合成 cDNA（TaKaRa，大连）。
参照文献（王建辉 等，2008）RT-PCR 分别扩增 4 种组织内的目标基因：18S RNA、GAPDH、
GLRaV-3 的 CP，GVA 普通变异株的 CP 和 GVA 温和变异株 CP。参照文献（Beuve et al.，2007），
qRT-PCR 扩增 4 种组织内 GVA 温和变异株 CP。CFX 96 荧光 PCR 仪（BIO-RAD，美国）（采用 CFX
manager 软件，并以葡萄 18S RNA 与 GAPDH 为双内参基因），以△△Ct 法定量研究 4 种组织内 GVA
温和变异株 CP 相对表达量。半定量 RT-PCR 分别研究幼果与成熟叶脉组织内 GVA 普通变异株 CP、
GLRaV-3 CP 与 18S RNA 相对表达量。

表 1 不同目的基因的扩增引物对
Table 1 The pairs of primers used to amplify the targeting genes
目标基因
Target gene
引物编号
Primer pair
引物序列（5′–3′）
Sequence
扩增片段/bp
Amplicon
GLRaV-3（CP） R3-1 TCCATGGCATTTGAACTGAAA 942
R3-2 CTA CTTCTTTTGCAATAGTTG
GVA6591F GAGGTAGATATAGTAGGACCTA 271 GVA 普通株系（CP）*
GVA universary variants CP GVA6862R TCGAACATAACCTGTGGCTC
GVA6591F GAGGTAGATATAGTAGGACCTA 315 GVA 温和株系（CP）*
GVA mild varianants CP GVA6906R CCTCCTGCAGAGTTAAGGTC
GVA-ORF4-1F GGCTACGACCGAAC(T/A)T(A)ATGTAC 839 GVA（部分 CP + 全长 VSR）
GVA（Part of CP + full length of VSR） GVA-ORF5-1R GTA(G)TGACAACCTAGCTT(C)GC
18S RNA（qRT-PCR） Vivi-18Sf AAGCCCGATCCAGCAATA 176
Vivi-18Sr GCCCTTTACGCCCAGTCA
18S RNA（RT-PCR） 18S-H325 AAACGGCTACCACATCCAAG 673
18S-C997 GCGGAGTCCTAAAAGCAACA
GAPDH（qRT-PCR） GAPDH-1 TGTTCACGGTCAGTGGAAGCATCAT 97
GAPDH-3 ATTCCTAATACCAAAGACGGTGACT
*. Goszczynski & Jooste（2003）
1.4 多重 RT-PCR 检测 GLRaV-3 与 GVA
以‘希姆劳特’两种组织（韧皮部与叶脉）来源的 cDNA 为扩增模板，比较不同镁离子浓度（1.5、
2.0 mmol · L-1）与不同复性温度（54、58 和 60 ℃）对 GLRaV-3 和 GVA 普通变异株 CP 多重扩增的
影响。在以韧皮部 cDNA 为模板（2.0 μL cDNA）的 PCR 体系中，研究不同复性温度（52 和 58 ℃）
和不同引物对浓度（3R-1、3R-2、GVA6591F 和 GVA6862R 的第 1 种混合引物对浓度分别为 0.2、
0.2、0.1 和 0.1 μmol · L-1；第 2 种混合引物对浓度为 0.4、0.4、0.1 和 0.1 μmol · L-1；第 3 种混合引
物对浓度为 0.4、0.4、0.2 和 0.2 μmol · L-1）对多重扩增结果的影响。

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2009 年 12 月分别提取 9 个待测样本与 1 个健康植株的韧皮部总 RNA 并反转录成 cDNA。以 18S
RNA 为内参基因，9 个待测样本和 1 个健康对照植株验证优化后的多重 RT-PCR 扩增体系的准确性、
特异性。
1.5 GLRaV-3 外壳蛋白基因与 GVA 部分基因组区域的克隆
2009 年 12 月提取‘藤稔’（1 号样本）韧皮部总 RNA，使用特异引物对（R3-1 与 R3-2、
GVA-ORF4-1F 与 GVA-ORF5-1R，表 1），利用 RT-PCR 分别扩增 GLRaV-3 CP 全长序列与 GVA 部
分基因组序列（包含部分 CP 和 VSR 全长序列）。
参照 Sambrook 等（1989）的方法，回收扩增产物并连接 pMD18（TaKaRa，大连），转化 E. coli
DH5α 感受态。随机选择阳性克隆并测序。
1.6 GLRaV-3 与 GVA 的系统进化研究
从 GenBank 数据库中获得 5 个已知 GLRaV-3 分离株的全长 CP：Pet-1（DQ680141）、Pet-2
（DQ680142）、Pet-3（DQ680152）、Pet-4（AY753208）、GP18（EU259806）。同时也从数据库中获
得 3 个 GVA 变异组代表分离株（Goszczynski et al.，2005）的相应基因组区域序列，包括Ⅰ组：GTG11-1
分离株（DQ855084）、Ⅱ组：P163-M5 分离株（DQ855082）与Ⅲ组：P163-1 分离株（DQ855088）。
利用 CLUSTALX 1.8.1 软件开展核酸序列的多重比对。
采用邻接法（Neighbor-Joining）并设定 1 000 重复值的 bootstrap 评估遗传距离分枝的可信度，
利用 MEGA 3.1 软件分别构建系统进化树。采用 Kimura 2-parameter 法，MEGA 3.1 软件计算不同克
隆核酸序列之间的平均核酸距离（变异株之间的遗传变异性）。利用 DNAStar 软件分析了不同克隆
之间的核酸与氨基酸序列的同源性比对。
使用 DNA 纯化回收试剂盒（天根，北京），分别回收上述 GVA 的 6 个克隆的 PCR 产物。参照
限制性内切酶 AluⅠ推荐反应体系（TaKaRa，大连），分别对 6 个 GVA 克隆（质粒）的 PCR 产物进
行酶切。质粒 PCR-RFLP 酶切产物（10 μL），进行 6% PAGE 电泳，EB 染色后在凝胶成像仪观察质
粒 PCR-RFLP 的酶切多态性图谱。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR 半定量与 qRT-PCR 定量分析不同组织病毒的相对含量
‘希姆劳特’葡萄叶脉、韧皮部、幼果与果梗都可以产生 18S RNA，GAPDH 相似浓度的扩增
产物，但是 GLRaV-3 与 GVA 温和变异株 CP 扩增产物浓度在 4 种组织中存在明显差别（图 1）。
以葡萄 18S RNA 与 GAPDH 为内参基因，qRT-PCR 研究了不同组织内 GVA 温和变异株 CP 相对
积累量。
结果表明 18S RNA、GAPDH 与 GVA 温和变异株 CP 的 Ct 值分别与模板拷贝数的对数成线性关
系，R2 = 0.999、0.995、0.995（其中 GVA 温和变异株 CP 的 Ct 值与其模板拷贝连续稀释 10-2 ~ 10-8
倍的对数成线性关系，如图 2，a）。
扩增标准曲线表明目的基因的 qRT-PCR 扩增效率可满足△△Ct 法定量分析。qRT-PCR 结果表
明：叶脉、韧皮部中 GVA 温和变异株 CP 相对表达量高于幼果和果梗（图 2，b）。



12期 王建辉等：葡萄卷叶伴随3型病毒和葡萄A病毒的多重检测及其系统进化分析 2405



图 1 不同目的基因的 RT-PCR 扩增
1. 叶脉；2. 韧皮部；3. 幼果；4. 果梗。
Fig. 1 Comparison studies on targeting products by RT-PCR among different tissues
1. Mature petiole；2. Phloem；3. Young fruit；4. Pedicel.



图 2 qRT-PCR 分析 4 种组织内 GVA 温和变异株的 CP 相对表达量
a：CFX manager 软件生成 GVA 温和变异株 CP 的扩增标准曲线；
b：△△Ct 方法计算 GVA 温和变异株 CP
在 4 种组织内的相对表达量。
Fig. 2 Comparison studies on relative expression of CP of GVA mild variants by
qRT-PCR among different tissues
a：Standard curve generated by CFX manager；b：The relative expression of CP
of GVA mild variants in different four tissues by △△Ct.


半定量 RT-PCR 分析幼果和叶脉两种组织内 GVA 普通变异株 CP 与 18S RNA 相对表达量（图 3）。
幼果内的 GLRaV-3 的 CP 模板量也显著低于叶脉。半定量 RT-PCR 结果也表明不同组织中两种病毒
积累量也存在显著差异。因此以韧皮部（与叶脉）cDNA 为模板，开展多重 RT-PCR 体系的优化研
究。


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图 3 半定量 RT-PCR 分析叶脉和幼果中 GVA 普通变异株（a）和 GLRaV-3（b）的相对积累量
a：M：DL2000 分子量标准，1 ~ 6：15、18、21、24、27、30 个 PCR 循环；
b：M：DL2000 分子量标准，1 ~ 6：10、16、20、24、27、30 个 PCR 循环。
Fig. 3 Comparison studies on the relative accumulations of GVA（a）and GLRaV-3（b）in different tissues by semi-quantitative RT-PCR
a：M indicated the DL2000 marker，1–6：15，18，21，24，27，30 PCR cycles；
b：M indicated the DL2000 marker，1–6：10，16，20，24，27，30 PCR cycles.

2.2 优化多重 RT-PCR 检测 GLRaV-3 和 GVA
分别取叶脉与韧皮部 cDNA 各 1.5 μL，只有叶脉 cDNA 同时扩增出两种病毒的 CP 目的片段（约
1 000 bp 和 300 bp，图 4，a）；调整镁离子浓度（1.5 和 2.0 mmol · L-1）和复性温度（54、58 和 60 ℃），
以韧皮部 cDNA 为模板都不能同时扩出两条预期大小的目的条带（图 4，a）。提高韧皮部 cDNA 浓
度（2.0 μL cDNA），并增加引物对浓度（3R-1、3R-2、GVA6591F 和 GVA6862R：0.4、0.4、0.2 和
0.2 μmol · L-1），复性温度为 58 ℃，获得两条预期大小的片段（约 1 000 bp 和 300 bp，图 4，b）；当
复性温度降低到 52 ℃，有非特异性片段出现（图 4，b）。
采用优化后多重扩增体系[25 μL：2.0 μL cDNA（以韧皮部 cDNA 为模板），2.5 μL 10 × Buffer，
1.5 μL Mg2+（25 mmol · L-1），1.0 μL dNTP（2.5 mmol · L-1），引物浓度（3R-1、3R-2、GVA6591F 和
GVA6862R：0.4、0.4、0.2 和 0.2 μmol · L-1），0.5 μL TaqDNA 聚合酶（5 U · μL-1）和 14.5 μL 去离子
灭菌水。PCR：94 ℃预变性 5 min；35 个循环：94 ℃变性 30 s，58 ℃复性 45 s，72 ℃延伸 50 s；
72 ℃延伸7 min]，对9个待测样本（ELISA检测GLRaV-3与GVA为阳性结果）和1个健康对照（ELISA
检测 GLRaV-3 与 GVA 为阴性结果）进行了多重 RT-PCR 检测。健康对照植株没有产生扩增条带，
1 ~ 9 号样本同时扩增出 GLRaV-3 全长 CP（大约 1 000 bp）和 GVA 普通株系部分 CP（大约 300 bp）
的两条预期大小的条带（图 5，a），表明 1 ~ 9 号样本复合感染了 GLRaV-3 与 GVA，多重 RT-PCR
检测结果与 DAS-ELISA 结果一致。以 9 个待测样本与 1 个健康对照的韧皮部 cDNA 为模板，2.0 μL
cDNA 和 0.2 μmol · L-1 上、下游引物浓度，分别单独扩增出 GLRaV-3、GVA 普通变异株与葡萄的 18S
RNA 目的基因片段（图 5，b）。除健康对照样本外，9 个待测样本分别得到预期大小的病毒目的片
段（1 000 bp 或者 300 bp 条带，图 5，a），验证了多重 RT-PCR 检测两种葡萄病毒的准确性。
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图 4 优化 RT-PCR 多重扩增体系
L. 成熟叶脉；P. 韧皮部；M1. 1.5 mmol · L-1 镁离子浓度；M2. 2.0 mmol · L-1 镁离子浓度；P3、P4、P5 分别代表 3 种引物对浓度
（3R-1、3R-2、GVA6591F 和 GVA6862R：0.2、0.2、0.1 和 0.1 μmol · L-1；0.4、0.4、0.1 和 0.1 μmol · L-1；
0.4、0.4、0.2 和 0.2 μmol · L-1）。M：DL2000 分子量标准。
Fig. 4 Optimizing the multiplex RT-PCR to detect two important viruses
L. Mature petiole；P. Phloem；M1. 1.5 mmol · L-1 Mg2+；M2. 2.0 mmol · L-1 Mg2+；P3，P4，P5：The concentrations of primer pairs（3R-1，3R-2，
GVA6591F and GVA6862R：0.2，0.2，0.1 and 0.1 μmol · L-1；0.4，0.4，0.1 and 0.1 μmol · L-1；0.4，0.4，0.2 and 0.2 μmol · L-1）.
M：DL2000 marker.


图 5 RT-PCR 多重扩增方法检测不同样本
a：RT-PCR 多重检测 9 个样本与 1 个健康对照（CK）；b：9 个样本与 1 个健康对照（CK）分别单独扩增 GLRaV-3 的 CP，
GVA 普通变异株 CP 与 18S RNA。M：DL2000 分子量标准。
Fig. 5 The multiplex RT-PCR verification
a：Multiple RT-PCR techniques were validated by nine samples and negative control（CK），The CP of GVA all variants and CP of GLRaV-3 from ten
tested samples were amplified by RT-PCR respectively. b：The CP of GLRaV-3，CP of GVA
all variants and 18S RNA from ten tested samples were amplified by RT-PCR respectively.
M：DL2000 maker. CK. Negative control.

2.3 GLRaV-3 外壳蛋白基因全长序列克隆与系统进化分析
随机选择‘藤稔’GLRaV-3 分离物外壳蛋白基因的 3 个克隆，测序得全长序列 942 bp（分别命
名：SL10-G3-1、SL10-G3-2 与 SL10-G3-3）。使用 MEGA 软件计算 GVA 分离物的 3 个克隆与其他 5
个已知分离株 CP 之间平均核酸距离为 0.036233 ± 0.004074（同源性高达 98.08%）。MEGA 构建系
统进化树，SL10-G3-1、SL10-G3-2、SL10-G3-3 位于一个进化支内（数据略）。3 个克隆序列的遗传
变异性为 0.003195 ± 0.007487，同源性高达 99.3% ~ 99.7%，属于同一种 GLRaV-3 株系。GLRaV-3
的 SL10-G3-1 克隆 CP 登录 GenBank 数据库（登录号 DQ91148）。
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2.4 GVA 部分基因组区域的克隆与系统进化分析
随机选择‘藤稔’GVA 分离物部分基因组区域的 6 个克隆测序得 839 bp，除去引物序列，获得
部分 CP 序列（483 bp）与全长沉默抑制子基因序列（273 bp）和部分 3 末端 UTR 序列（43 bp）。 6
个克隆序列之间的遗传距离高达 0.154419 ± 0.010479（核酸同源性仅为 80.4% ~ 99.4%；氨基酸同源
性为 85.3% ~ 99.2%）。利用 MEGA 软件构建系统进化树（图 6）。GTG11-1、P163-M5 与 P163-1 分
别代表 GVA 种群的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ变异组。SL10-A-1、SL10-A-4、SL10-A-5 与 P163-M5 聚在一支，被
命名为第Ⅱ组；SL10- A-3、SL10- A-6 与 P163-1 聚在另一支，被命名为第Ⅲ组；SL10-A-2 没有与已
知变异组的代表分离物聚在一起（图 6）。Ⅱ组与Ⅲ组的组内变异株核酸同源性为 90.5% ~ 99.9%（氨
基酸同源性为 96.8% ~ 99.2%）；组间核酸同源性仅 80.3% ~ 83.6%（氨基酸同源性为 85.3% ~ 87.3%）。
SL10-A-2 与 P163-M5、GTG11-1、P163-1 分离物的核酸同源性分别为 83.7%、83.1%、88.6%（氨基
酸同源性分别为 88.5%、88.1%、89.7%），因此 SL10-A-2 可能属于 GVA 种群的一个新变异组。另
外，6 个克隆的 PCR-RFLP 结果与进化树聚类结构一致。


图 6 GVA 不同克隆的系统进化树
Fig. 6 Phylogenetic tree of different clones isolated from Chinese GVA

6 个克隆共产生 3 种酶切图谱。SL10-A-1、SL10-A-4、SL10-A-5 产生第 1 种酶切图谱；SL10-A-3、
SL10-A-6 产生第 2 种酶切图谱；SL10-A-2 产生第 3 种酶切图谱（图 7）。酶切多态性图谱也支持
SL10-A-2可能是一种新的变异组。GVA的 SL10-A-4、SL10-A-3、SL10-A-2克隆CP分别登录GenBank
数据库（HQ671645、HQ671646、HQ671647）。

图 7 质粒 PCR-RFLP 酶切图谱分析
Fig. 7 Restriction patterns of corresponding group of variants
3 讨论
由于葡萄是多年生且主要以营养繁殖方式进行栽培的果树，病毒的多年积累使得多种病毒复合
侵染的现象十分普遍，因此灵敏、高效的检测方法具有重要的生产实践意义。裴光前等（2010）对
12期 王建辉等：葡萄卷叶伴随3型病毒和葡萄A病毒的多重检测及其系统进化分析 2409

多重 RT-PCR 中模板浓度、引物浓度和退火温度进行优化，开展了 4 种葡萄卷叶伴随病毒（GLRaVs）
的多重检测。牛建新等（2004）建立了 GLaV-3 和 GFLV 的 RT-PCR 多重检测方法。印迹巢式 PCR
可以同时检测来自于葡萄病毒属与凹陷病毒属的两种病毒（Dovas & Katis，2003）。目前还没有
GLRaV-3（卷叶病毒属代表种）与 GVA（葡萄病毒属代表种）的多重 RT-PCR 检测的报道。作者以
四川省主栽品种之一的‘希姆劳特’（青提）为研究对象，比较了其不同组织（叶脉、韧皮部、幼果
与果梗）内的病毒相对积累量，并以其韧皮部为材料开展 RT-PCR 多重检测优化研究。以待检样本
的韧皮部为 cDNA 模板，不受采样时间、地点和品种的影响。优化 RT-PCR 两步法同时检测两种重
要病毒（GLRaV-3 和 GVA）。18S RNA 为待检测的内参基因，可以完全排除在总 RNA 提取、cDNA
反转录和 PCR 扩增中的杂质与操作的干扰，保证最后扩增结果的准确性、特异性。多重 RT-PCR 检
测能够一次性实现两种病毒的检测，准确性高，耗时短，为病毒病的防控赢得时机，具有极大的应
用价值。
葡萄较长寿命的生长周期与其无性繁殖方式可能为某些病毒变异株的积累、变异株重组与进化
创造了理想的条件。由于植物病毒的 RNA 聚合酶缺乏严密的自我校正功能，在宿主体内形成一种
母序列和来自该序列的大量相关突变体所组成的病毒基因组，常形成以一个优势株为主并混合感染
相关突变株的病毒种群，称为准种病毒（quasispecies）。葡萄扇叶病毒（Grapevine fan leaf virus）种
群多样性研究结果表明它是准种病毒（Naraghi-Arani et al.，2001）。GVA 种群包含不同致病性的变
异株，之间具有显著的核酸变异性。本研究中，‘藤稔’分离物内 6 个 GVA 克隆序列遗传差异显著，
分别与已报道的强、弱致病变异株同源性较高（分别属于Ⅱ、Ⅲ变异组）。为了进一步排除 PCR 扩
增或者测序等操作对结果的影响，对 15 个 GVA 分离物的 139 个克隆进行了 PCR-RFLP 与 80 个克
隆进行测序分析（数据略），其结果表明 GVA 种群包含多种变异株并且常常混合侵染同一植株，具
有准种病毒的特点。

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“2012 年现代无土栽培国际研讨会”通知
在经济全球化背景下，人类的城市化进程已经不可逆转，预计到 2050 年，世界城市化率将高达 70%。在只占地
球面积不到 1%的城市中要提供一定自给率的农产品，必须要依靠现代科技，克服城市在土地、水资源、生物及非生
物污染、劳动力成本等方面的劣势，充分利用城市有限的空间实现最大化的生产，并在满足一定农产品需求的同时，
营造生态生活和谐的城市未来，现代无土栽培技术将会是都市现代农业特别是设施农业的关键技术之一。
2012 年现代无土栽培国际研讨会由国际园艺学会、中国园艺学会和上海市农科院主办，会议将于 2012 年 5 月
22—25 日在上海举办。本届大会围绕“现代无土栽培技术让生活更美好”，以都市农业为主要对象，但不局限于都
市农业。大会初步设定以下专题：
议题一：都市无土栽培技术的战略研究，包括都市无土栽培技术的历史、现状、发展趋势等，都市无土栽培技
术的经济、生态、社会功能等。
议题二：现代无土栽培方式研究，包括 NFT、DFT、Aeroponic planting 等无土栽培体系以及高新技术如信息技
术、LED 技术的应用等。
议题三：鱼菜共生体系的应用。充分利用城市水产养殖的水面以及富营养化的水质开展蔬菜生产，并将经栽培
后的水循环用于水产养殖。
议题四：植物工厂。包括使用工厂化生产的蔬菜和食用菌种类、体系以及关键技术和装备等。
议题五：基质及营养液。包括基质和营养液的配方、监测、循环使用及其对产量、品质以及环境的影响。
议题六：植物生理及非生物胁迫。
大会邀请国内外本领域专家担任学术委员会成员，其中大部分专家将出席本次大会并作主题报告。热忱欢迎国
内外同行专家学者参加本次会议，会议详情请查阅：http：//www. icesc-2012. com/index. html
联系人：许爽；电话：18918162193；E-mail：wtzp05@163.com。

上海市农业科学院