全 文 ：园 艺 学 报
, 一
今 之 了 ‘ 衬尸 , ‘
葡萄器官离体再生和遗传转化体系的建立
金万梅 , ,
‘ , 董 静 , 闰爱玲 , 王 忆 ’, 陈梅香 , 韩振海 ,
’
中国农业大学园艺植物研究所 , 北京 北京市农林科学院林业果树研究所 , 北京
摘 要 以 ‘ 森田尼无核 ’ 葡萄为试材 , 研究 ’生 长调节物质
、
外植体类型 、 抑菌索等对离体不定芽
再生和转化效率的影响 相对于 和 , 细胞分裂索 无论单独使用还是与生长素配合使用均可使葡
萄不定芽再生频率达到最高 在
、 。 · 一 ’ ,
, · 一 ’或 十
‘ , ·
一 ’ · 一 ’培养基土均可以较好地诱导再生不定芽 叶盘
、
茎段和叶柄都可以诱导再生不定
芽 , 在同一种培养上再生频率差异不大 采用根癌农杆菌介导的叶盘法转化时 , 卡那霉素抗性筛选浓度为
· 一 ’ 抑菌抗生素使用头袍霉素适宜浓度为
· 一 ’ , 而使用梭节青霉素时以
· 一 ’最
佳 获得转化芽 个 , 部分株系用 和 杂交证实外源基因已整合在葡萄基因组 中。
关键词 葡萄 器官发生途径 不定芽 组织培养
中图分类号 文献标识码 文章编号
一 一 刁
介’
一 ‘ , ‘ , , 一 , , ’ , 一 , , 一 ’‘
’俪 砚 ‘ ‘, , ,‘ ,
, ,
, , 卿
,
侧
, 记犷 , , 斤 、‘。 ,‘ , 奋,‘ , 以
卫
, ,
‘ 、
一 , ,
一 · 一 ,
,
· 一 · 一 一 · 一 ,
一飞 ,
占‘ ,
一 · 一 、 , 邵 ,
· 一 · 一 一
盯
·
国内外关于葡萄 的遗传转化多采用体细胞胚胎发生途径 , 但诱导时间长 , 过程较为
复杂 , 而器官发生途径过程简单 , 诱导时间相对较短 , 但存在基因型的差异 。 等 以
沙地葡萄为材料
, 利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法 , 获得了表达 和 基因的转基因植株 。
收稿 日期 一 一 修回 日期 一 一
基金项 目 北京门评牛技新星计划项 日 仪 北京 优秀人才培养专项经 费资助项 日
通讯作者 , 」 , ‘
· 一 、 。, · ‘ ,
园 艺 学 报 卷
等 取圆叶葡萄的叶片和时
一
柄作为外植体 , 将 基因导入基因组中 , 获得了转化组
织 。 等 和 ,二 、 等 分别 以 ‘ 无 核 白 ’ 和 ‘ 萨娜 ’
为材料
,
利用根癌农杆菌介导法
,
分别获得了表达番茄环斑病毒 的外壳蛋白
基因和 而仍 及 基因的转基因植株 我国关于葡萄的遗传转化报道不多 。 周鹏等
将人胰岛素样生 长因子 佑
一 基因导人了葡萄中。 孙仲序等 以鲁贝葡萄的花丝为外植体 , 诱
导体细胞胚胎 , 获得了转甜菜碱醛脱氢酶基因的葡萄 本试验通过器官发生途径对葡萄进行系统研
究 , 旨在建立葡萄再生遗传转化体系
, 为葡萄转基因研究以及为通过分子育种手段进行葡萄种质创新
提供技术平台
材料与方法
材料
取 ‘ 森田尼无核 ’ 葡萄当年生幼嫩新梢
, 经小茎尖培养 , 建立试管苗无性繁殖系 。 取继代培养
培养基为 十
· 一 ’ 的无菌苗 , 剪成 一 的叶盘及 左右的叶柄和
无腋芽茎段作为外植体 。
不定芽再生影响因素的研究
细胞分裂素 将葡萄叶盘
、
茎段 和叶柄接种在 分别附加 , , , ,
· 一 ’的
、
或 的培养基上 〕
细胞分裂素与生长素组合 将葡萄叶盘
、
茎段和叶柄分别接种在 附加
· 一 ’ 、
或 和
· 一 ‘ , 一 、 、 或 的培养基中 除 以外
,
其它生长调节物质均在灭
菌前加人 。 经 因 微孔滤膜过滤灭菌 , 在培养基灭 菌后待其温度降至 ℃时加人 。
卡那霉素 将外植体叶盘接种在分别含 , , , , ,
· 一 卡那霉素的
’ 一 ’
· 一 ’培养基上 , 统计黄化率和再生频率 。 卡那霉素在培养基灭菌后待其温
度降至 ℃时加人
抑菌素对根癌农杆菌生长的影响
根癌农杆菌菌株为 , 一 携带有 启动子
、 基因和 肥 且标记基因 农杆
菌过夜培养后在附加终浓度为 林
· 一 ’乙酞丁香酮的 液体培养基 中继续振荡培养 , 至
, 为 一 将葡萄叶盘浸人菌液中 后取出 , 用无菌滤纸吸去多余的菌液 , 在 十
· 一 ’ · 一 ’培养基上共培养 后转至含有不同浓度头饱霉素 或梭节青
霉素 的 。
· 一 ’十 · 一 ’培养基中继续培养 。 抑菌素在培养基灭
菌后待其温度降至 ℃时加人 以上培养基用
· 一 ’ 或 调至 , 一 ℃高
压灭菌 。 所有处理每瓶接种外植体 巧 个左右 , 每处理 瓶 , 重复 次 暗培养 后置于
光周期下 , 温度 士 ℃ 后统计外植体总数和不定芽数 , 计算再生频率 再生不定芽
数 外植体总数 。 数据用 软件进行分析 。
转化葡萄的分子检测
以 法提取 转 化 葡萄的 总 。 扩增 的引物 分 别为 , 忆
一 ‘ , ‘一 竹
一 ’。 扩增体系为 林 模板 , 林 缓冲
液 , 林
· 一 ’ , ‘ , 酶 ,
· 一 ’的 和 咫 分别为 林 , 去离子水补足
林 。 扩增程序为 ℃预变性 ℃ , ℃ , ℃ 、 , 个循环 ℃ 。
杂交 用 酶切基因组 , 上样
、
转膜 , 人紫外交联仪 一 在能量为
下对其正反面交联固定 。 杂交按
·
说明进行 。 探针采用 方法标
记 , 在 林 的反应体系中用 一 代替 , 模板为含目的基因的大肠杆菌质粒 。
期 金万梅等 葡萄器官离体再生和遗传转化体系的建立
葡萄再生植株的生根与移栽
再生的不定芽长到 一 时从基部单个切下接种在 十
· 一 ’ 十 活性炭
· 一 ’培养基上 , 待不定根长至 。 左右时在温室中炼苗 一 , 移栽至营养土 土 蛙石 草
木炭 二 中。
结果与分析
葡萄愈伤组织和不定芽诱导的过程
叶盘在接种 后开始有愈伤组织产生 , 而叶柄和茎段则在 后才有 。 愈伤组织有两种类型 ,
一种呈紧凑的绿色或黄绿色
, 可以诱导产生不定芽 另一种为黄绿色或红 白色
、
白色 , 均呈疏松状 ,
继续培养时逐渐褐化 , 无不定芽发生 图版 , 。 叶盘
、 茎段和叶柄均可通过器官发生途径诱导产
生不定芽 图版 , 。 产生不定芽有两种类型 直接再生 外植体接种两周后 , 切 口处稍有膨大且
有绿色芽点出现 , 随后有不定芽再生 和通过诱导愈伤组织再生 首先诱导产生黄绿色紧凑型愈伤
组织 , 继续培养后在愈伤组织上出现绿色芽点
,
长成不定芽 。
细胞分裂素对葡萄不定芽再生的影响
本试验所使用的 种细胞分裂素中 , 诱导不定芽的再生频率明显高于 和 , 其中附加
的培养基难以诱导再生不定芽 表 。 低浓度的细胞分裂素不利于再生不定芽 。 培养基中附
加 或
· 一 ’时 , 不定芽再生频率均较高 , 达到 一 , 且不同外植体类型的
处理间无显著性差异 。 附加 一 或
· 一 ’时 , 叶盘
、
茎段和叶柄也都可以诱导产生不定
芽 , 但再生频率较低 , 仅为 一 。 即使附加高浓度的 , 也不能诱导不定芽 。 本试验结
果表明 对于再生不定芽的诱导活性大于 , 远大于 。
表 细胞分裂素对森田尼无核葡萄不定芽再生率的影响
代 眨 加
试验序号
一
细胞分裂素 ,
· 一 ’
一
一
一
一
叶盘
一 场
士
士
士
士 〔·
士
茎段
一
,
士
士
士
士
士
叶柄
士
士
土
土
土
注 基本培养基 同列不同字母表示 妥 显著性差异
一 一 瑞 一
· 一一一 一〔 一 之 之一 一一 〔冶 、一 伴 〔吧
细胞分裂素与生长素组合对葡萄不定芽再生的影响
从表 可以看出 , 种细胞分裂素与 , 一 组合均不能诱导产生不定芽 。 与 、 和
组合可以有效诱导不定芽的产生 , 其中 与 组合效果最好 一 与 和 组合可以
诱导产生不定芽 , 但再生频率无显著性差异 。 与 种生长素组合诱导葡萄不定芽效果最差 , 对叶
盘 、 茎段和叶柄均没有诱导出不定芽 。
卡那霉素对葡萄不定芽再生的影响
当培养基中不含卡那霉素时 , 外植体再生频率为 , 随着卡那霉素浓度的增加 , 外植体黄
化率逐渐升高 , 再生频率逐渐下降 ,
· 一 ‘时难以产生不定芽 , 黄化率为 , 而 , ,
,日 艺 学 报 卷
· 一 ’时黄化率达
,
均不能诱导产生不定芽 表 因此将
· 一 ’作为葡萄遗传转化的
筛选浓度
表 细胞分裂素与生长素组合对不定芽再生率的影响
爪
表 卡那霉素对葡萄不定芽再生的影响
夜 七
序号 , 袱 川盘 件 茎段 吸 叶们柳铸
, 一 , 、 , , , · 』 一 。 〔卜 。、 。川 。 ,‘ 。
‘ ’ , 一 〔 一 ,
闪 士 士 士
『
】
’
考人 】 土 之劲 士 之一 士
『 】 士 土 士
一 亏 , 一 。 《 一
一 弓 入 】 《
一 上 卜 土 卜 士 卜
一 入气 上 , 土 , 土 】
『 ’ , 一
’
闪 《 〔
日 ’ ’ 亏人
, ’ 人人 〔
注 同列不同
’ 艺母表小 , 显 著性差异
一 一丫一一 , · 、 一 一 、 、 一 。一 一 一 、一 。 、 、 一、
, 。 , 、 一 一牡 ,一
一 汗 共
月卜霉素
才一 · 一
一 一 一
外植体黄化率 铸
丫 〔一 一 卜
一 。、 、。 一, 一 一。·
再生频率 铸
一
士
土 ,
士
士 ,
价目八
勺‘,、︺
、
注 同列不同字叶表示 尸〔 显 著性差异
一 一 。· 一 护 、 一护 、 一 书 一 一 一 一
是一 了一 《笼洛 一一 一〔、一 , ￡一 蕊
抑菌素对根癌农杆菌生长的影响
试验中发现 , 根癌农杆菌浸染后的叶盘外植体在对照培养基上 后就有大量农杆菌繁殖
,
全勺
周后外植体褐化逐渐死亡 头饱霉素或梭节青霉素浓度为 和
· 一 ’时仅 一 周对农杆菌表
现出抑制作用 , 而分别为 和
· 一 ’以 仁时才能完全抑制 , 因此确定 和 ,雌
· 一 ’分
另为头饱酶素和竣节青霉素适宜浓度
」
利用根癌农杆菌介导的叶盘法转化葡萄
,
重复进行 次 , 每次对 个外植体进行侵染 , 获得
转化株系 图版 , 个 , 部分株系采用 鉴定
,
得到阳性株系 图 】
,
对 阳性株系进行
杂交 , 结果显示均有杂交信号 图 , 表明外源 目的基因已经整合在葡萄基因组上 。
,
入 主
图 葡萄转化植株的 鉴定结果
。 性对 强 阴性对照
, 一 二毛葡萄‘【
·
胜株系
葡萄阴性株系
〔、 万 之一 一 〔 〕 二飞 一
、。、 一 一 卜 , 一 飞 。一、
,
, , 一 , 一 、 一。
· 〕 一
图 一 鉴定转基因葡萄
阳性对照 阴性对照
一 葡萄阳性株系
暇一
, 一 〔 · 一 一丫
一
丫护 〔
、, 一 护 咬” , ,、 一 川
葡萄再生植株生根与移栽
葡萄再生不定芽长到 一 。 日寸
右可以看到有不定根发出
, 生根苗 图版
,
, 个月后成活率达
〕
将单个不定芽从基部切下
,
接种在生根培养基上 , 周左
在温室中炼苗 一
,
棵移栽到营养钵中 图版
,
期 金万梅等 葡萄器官离体再生和遗传转化体系的建立
图版说明 愈伤组织的诱导 不定芽再生 叶盘转化芽抗性生长 转化芽生根 再生植株移栽 。
脚 脚 脚
罗
园 艺 学 报 卷
讨论
许多学者在研究葡萄再生时发现 , 外植体类型 、 生长调节物质 、 基因型等均不同程度影响不定芽
的诱导 。 权冬玲和常永义 报道 , ‘ 红地球 ’ 葡萄叶片诱导不定芽较好 , 茎段和叶柄可以诱导
产生不定芽 , 而根则不能。 李云等 研究 ‘ 红地球 ’ 叶片再生发现 , 诱导不定芽最佳培养基
为 一
· 一 ’ · 一 ’ 周鹏等 报道 ‘ 无核白 ’ 葡萄诱导不定
芽的最佳培养基为
· 一 ’ · 一 ’ · 一 ’。 王华等
在研究酿酒材料 ‘ 梅尔诺 ’ 时发现 , 在附加
, · 一 ’的 培养上 , 叶柄不定芽诱
导频率达到 。 陶建敏等 以 和 几种组合诱导不定芽的效果不如 和 组
合 。 本试验以 ‘ 森 田尼无核 ’ 为材料研究发现 , 在同一种培养基
· 一 ’ 十
· 一 ’上 , 叶片 、 叶柄和茎段 种外植体的再生均达到最佳 再生频率分别为 ,
和 无论单独使用还是与生长素配合使用对不定芽诱导活性最高 , 效果也最佳 高浓度
的 对不定芽的发生有利 , 一 虽然有利于愈伤组织的形成 , 但却对不定芽的再生不利 。
卡那霉素对葡萄不定芽再生起抑制作用 , 即使低浓度也强烈抑制不定芽的分化以及转化植株的生
根 , 在试验中采用延迟筛选有助于提高转化率 。 头饱霉素或梭节青霉素在葡萄遗传转化中起抑制根癌
农杆菌的作用 , 高浓度的头抱霉素或梭节青霉素对葡萄不定芽的再生不利 。 本试验中头抱霉素适宜浓
度为
· 一 ’ , 而使用梭节青霉素时以
· 一 ’为好 。 外源基因的表达鉴定工作正在进行中。
, , , 一 嗯 , 了。 阮
石 罗 , 一
, , 罗 , 诉 即 己
, 一
, , 一 ‘ ’ 脚 罗
·
丙
, 一
李 云 , 冯 慧 , 田砚亭 ‘ 红地球 ’ 叶盘 、 叶柄不定芽再生系统的建立 园艺学报 , 一
, , 脚 一 罗 脚 众 门砚了祀
诉 卿 , 以 一
一 , 一户
·
罗 阮
, 一
权冬玲 , 常永义 葡萄不同器官直接再生不定芽的研究 甘肃农业大学学报 , 一
, 司 ‘ ’ 脚 , 一
一 , 一 , 一 们 脚 脚 罗 ,
一
孙仲序 , 陈受宜 , 王建设 农杆菌介导 基因转化葡萄研究 果树学报 , 一
一 , 一 , , 一 , 一
, 站 。 诉
脚 , 一
陶建敏 , 庄智敏
,
章 镇 , 耿其芳 , 蔡斌华 美人指葡萄不定芽离体诱导再生植株的研究 果树学报 , 一
, , 一 , 一 叮 罗 邵 脚 ‘
’ 一 , 一
王 华 , 卢 江 , 马春花 , 张继澎 酿酒葡萄 ‘ 梅尔诺 ’ 再生系统建立的研究 西北植物学报 , 一
, 一 , 一 一
·
俪 功
, 一
周 鹏 , 郭安平 , 王跃进 , 黎小瑛 个葡萄品系外植体愈伤组织的诱导和植株再生 热带作物学报 , 一