全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (11) : 1681 - 1684
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 06 - 15; 修回日期 : 2009 - 09 - 07
基金项目 : 江苏省自然科学基金项目 ( SBK20082174)3 E2mail: snzhang@ njau1edu1cn
秋水仙素离体诱导同源四倍体青花菜
张蜀宁 3 , 张丽丽 , 唐　君 , 孔艳娥 , 侯喜林
(南京农业大学园艺学院 , 作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 南京 210095)
摘 　要 : 以青花菜品种 ‘海兹 ’高频再生试管苗为外植体 , 利用秋水仙素离体诱导四倍体。结果表
明 : 用含秋水仙素 200 mg·L - 1的 MS + 011 mg·L - 1NAA + 610 mg·L - 1 62BA液体培养基处理 2 cm长的
再生苗 48 h, 每个外植体平均可产芽 211个 , 再生植株变异率为 83133% , 四倍体诱导率达 79117%。与二
倍体相比 , 四倍体植株叶片、花冠、气孔等均表现巨大性 ; 流式细胞仪倍性鉴定显示 , 对照 DNA相对含量
为 200, 四倍体再生植株为 400。四倍体根尖染色体 2n = 4x = 36。
关键词 : 青花菜 ; 离体培养 ; 秋水仙素 ; 四倍体
中图分类号 : S 635　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1121681204
In V itro Induction of Autotetraplo id Broccoli w ith Colch ic ine
ZHANG Shu2ning3 , ZHANG L i2li, TANG Jun, KONG Yan2e, and HOU Xi2lin
(College Horticulture S ta te Key Laboratory of C rop Genetics and Germ plasm Enhancem ent, N an jing A gricu lture U niversity, N anjing
210095, Ch ina)
Abstract: In this study, the tube p lantlets of broccoli were cultured on Murashige and Skoog fluid medi2
um supp lemented 62BA and NAA in combinationswith different concentrations of colchicine and treatment time
to induce tetrap loid. The results showed that the treatment with 200 mg·L - 1 colchicines in MS + 011 mg·
L - 1 NAA + 610 mg·L - 1 62BA for 48 hours yielded doubled chromosomes at highest rates, the number of
shoots per exp lant was 211, the variation efficiency was 83133% , and the variational rate of tetrap loid was
79117 %. Compared with the dip loid, the tetrap loid p lants possessed gigantism in leaves, floral, stomata of
p lantlets. The flow cytometry was used to identify the p loidy of induced p lants. The result suggested that the
relative DNA content of control was 200 and the number of chromosome was 2n = 2x = 18, and tetrap loid rela2
tive DNA content was 400 and the number of chromosome was 2n = 4x = 36. The identification of the chromo2
some analysis indicated the regeneration p lantlets were tetrap loid.
Key words: B rassica oleracea L. var. ita lica Planch. ; in vitro culture; colchicines; tetrap loid
不同植物材料对秋水仙素的敏感性存在差异 , 秋水仙素离体诱导多倍体的处理浓度从 0103% ～
0150% , 处理时间从 6 h～7 d都有报道 (谭德冠 等 , 2005)。Hansen等 ( 1995) 在甜菜子房培养和
染色体加倍研究中 , 主张用高浓度 (014～610% ) 和短时间 (0～5 h) 处理。作者在构建二倍体青
花菜 ‘海兹 ’高频离体再生体系 (张丽丽 等 , 2008a) 的基础上 , 试图通过组织培养与秋水仙素相
结合的方法诱导试管苗茎尖 , 以期获得青花菜同源四倍体 , 为进行多倍体育种提供依据。
1　材料与方法
青花菜 (B rassica oleracea L1var1 ita lica Planch1) ‘海兹 ’ (04J220) 来自镇江市蔬菜研究所。试验
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
于 2006年 4月至 2008年 6月在南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室进行。
切取带柄子叶和试管苗再生芽 (长约 2 cm ) 放入 MS + 011 mg·L - 1 NAA + 610 mg·L - 1 62BA
液体培养基中 , 每瓶 7～8个外植体 , 在散射光下以 150 r·m in - 1摇速振荡预培养 2 d。在无菌条件下
将秋水仙素无菌母液添加到上述液体培养基 (终浓度分别为 50、100和 200 mg·L - 1 ) , 将经过预培
养的外植体转入其中 , 每处理 15个外植体 , 置于摇床上处理 12、24、48和 72 h (条件同预培养 ) ;
用无菌水清洗 2次 , 切割后接入芽诱导培养基 (MS + 0105 mg·L - 1 NAA + 310 mg·L - 1 62BA + 018%
琼脂 + 3%蔗糖 )。每个芽单独培养 , 作为一个株系进行编号。以不加秋水仙素处理作为对照。
在离体诱变再生苗长至 3～4片叶时进行形态学鉴定 , 测定气孔大小和密度。染色体数鉴定参照
张丽丽等 (2008a) 的方法。流式细胞仪 DNA含量测定参照张振超等 (2007) 的方法 , 取组培苗 4
cm
2嫩叶 , 以二倍体作为对照 , 每测定 10个样品即测定 1次对照样品。
将不定芽丛切成单芽 , 接种在生根培养基 ( 1 /2MS + 011 mg·L - 1 NAA + 017%琼脂 + 3%蔗糖 )
上 , 形成根系后炼苗 48～72 h, 移入蛭石、泥炭土和珍珠岩 (1 ∶2 ∶1) 混合基质中遮荫培育两周 ,
当植株长到 4～5片叶时移栽到大田。
2　结果与分析
211　不同外植体不定芽再生的差异
在含秋水仙素的液体培养基中带柄子叶能迅速膨大产生愈伤组织 , 但随后逐步褐化 , 不能分化形
成再生植株 ; 试管苗再生芽 (图版 , A、B ) 培养 10 d左右 , 出现不同程度褐化 , 存活率在 60% ～
100%之间 , 变异率为 3185% ～92131%。而对照 100%存活 , 褐化不明显 (图版 , C)。
图版说明 : A. 诱导不定芽 ; B. 不定芽接种在培养基上 ; C. 二倍体对照的不定芽 ; D. 诱导获得四倍体 ; E. 四倍体诱导生根 ; F.
二倍体、四倍体试管苗比较 ; G. 四倍体驯化移栽 ; H. 四倍体结球 ; I. 二倍体、离体再生植株和四倍体的化器官比较 ; J、K. 二倍
体、四倍体气孔 , ×600; L. 四倍体根尖染色体 (2n = 4x = 36) , ×1 200。
Explana tion of pla tes: A. Induced p lantlets; B. Plantlets treated by liquid colchicines and cultured on the media; C. CK; D. Induced tetra2
p loid; E. Tetrap loid shoot induced into roots; F. Comparison of the seedling between dip loid and tetrap loid; G. Domestication and transp lantation
of tetrap loid; H. Flower head formation in tetrap loid; I. Comparison of the flowers between dip loid and tetrap loid. J, K. Comparison of the stomata
between dip loid and tetrap loid, ×600; L. Chromosome from the needle of tetrap loid root, (2n = 4x = 36) ×1 200.
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　11期 张蜀宁等 : 秋水仙素离体诱导同源四倍体青花菜 　
212　秋水仙素浓度和处理时间对不定芽再生及加倍的影响
由表 1可见 , 试管苗用含 200 mg·L - 1秋水仙素处理 48 h最佳 , 每个外植体平均可产芽 211个 ,
四倍体加倍率可达 79117%。其次是 200 mg·L - 1和 24 h的组合 , 每个外植体平均可产芽 212个 , 四
倍体加倍率为 6215%。
表 1　秋水仙素诱导同源四倍体青花菜效果
Table 1　Effect of colch ic ines trea tm en t on induction of autotetraplo id broccoli
秋水仙素质量浓度 /
(mg·L - 1 )
Colchicines concentration
处理时间 / h
Treated time
处理外植体个数
Number of
treated exp lants
存活数 /个
Number of
alive
不定芽数
Number of
shoots
变异株数
Number of
variation
四倍体株数
Number of
tetrap loid
四倍体
诱导率 /%
Rate of tetrap loid
50 12 15 15 52 　2 　0 0100 kK
24 15 15 35 　5 　2 517 1 jJ
48 15 15 42 10 　5 11190 hH
72 15 15 49 18 10 20141 gG
100 12 15 15 50 　5 　3 6100 jJ
24 15 15 48 22 　5 10142 iI
48 15 13 30 19 14 46167 eE
72 15 10 29 20 16 55117 dD
200 12 15 15 43 21 13 30123 fF
24 15 15 33 27 20 62150 cC
48 15 11 24 20 19 79117 aA
72 15 　8 13 12 　9 69123 bB
总计 Total 180 162 448 179 114 25145
　　注 : 不同大、小写字母表示在 0101和 0105水平上差异显著。
Note: The data with different letters indicate significant difference at 0101 or 0105 level.
213　再生植株的倍性鉴定
再生变异植株比亲本植株健壮 , 生长缓慢 , 茎粗 , 叶片肥厚 , 叶片近圆形、皱缩扭曲 , 叶色深
绿 , 锯齿明显 (图版 , D、F、G) ; 变异植株叶片气孔较二倍体明显增大 , 气孔密度减小 , 保卫细胞
内叶绿素增多 (图版 , J、K) , 气孔形状多近圆形。变异株根尖细胞染色体数为 2n = 4x = 36 (图版 ,
L) , 而其二倍体染色体数为 2n = 2x = 18, 故变异植株为四倍体。
流式细胞仪鉴定结果见图 1, 二倍体 DNA相对含量在 200附近 , 变异株 DNA相对含量在 400附
近 , 表明再生植株是四倍体。还有部分植株是非整倍体 , 其 DNA相对含量不确定。
图 1　青花菜组培苗叶片的 D NA相对含量曲线
F ig. 1　Curves of D NA rela tive con ten t of leaves of tissue culture broccoli
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214　四倍体再生植株的生根和移栽
诱导生根 2～3周后 , 植株基部长出大量白色粗壮的根 , 生根率达 100% (图版 , E) ; 移栽到大
田 (图版 , G) , 获得再生植株 , 成活率可达 90% , 次年 4月结花球 (图版 , H)。
3　讨论
本试验中用含 200 mg·L - 1秋水仙素的液体培养基诱导培养 48 h获得再生苗 24株 , 变异植株 20
株 , 鉴定为四倍体植株 19株 , 其四倍体的诱导率达 79117% , 远远高于以往报道。张建军等 (1997)
利用含有秋水仙素的固体培养基诱导白菜再生苗获得了较高变异频率的四倍体 ; 郭启高等 ( 2000)
将秋水仙素灭菌加入姜的分化培养基中处理 5或 10 d后再转入不含药液的新鲜培养基中 , 获得了四
倍体姜的植株。但是本试验通过混培法固体培养未获得突变株 , 并发现经含有秋水仙素的培养基处理
一段时间后 , 外植体很难形成团状紧实的愈伤组织 , 难以形成不定芽 , 这与陈柏君等 ( 2000) 的研
究结果一致。原因可能是秋水仙素浓度较大 , 或处理时间较长 , 有待于进一步的研究。
本试验获得的四倍体青花菜植株经初步田间试验发现 , 植株均表现出四倍体的巨大性 , 植株生长
健壮 , 发育早 , 花茎粗短 , 花球紧实 , 但在花球商品成熟期球面花蕾部分变粗造成球面不平整。由于
四倍体生长快发育早 , 可以在花蕾变粗前提前采收。又因为四倍体具有巨大性 , 提前采收并不影响产
量且品质佳。对于新获得的四倍体青花菜材料存在的问题 , 可通过选育加以克服。
References
Chen Bai2jun, Gao Shan2lin, B ian Yun2yun. 2000. The inducing of autotetrap loid of scutellaria baicalensis georgi by tissue culture. Journal of
Plant Resources and Earironment, 9 (1) : 9 - 11. ( in Chinese)
陈柏君 , 高山林 , 卞云云. 2000. 黄芩组织培养同源四倍体的诱导. 植物资源与环境学报 , 9 (1) : 9 - 11.
Guo Q i2gao, Zhang Zhong2ling, Zhou Hong, L iang Guo2lu, Song M ing. 2000. In vitro induction of polyp loidy from colchicines2treated zingiber
officinale roscse. Journal of Southwest Agricultural University, 22 (5) : 400 - 402. ( in Chinese)
郭启高 , 张钟灵 , 周　虹 , 梁国鲁 , 宋　明. 2000. 秋水仙碱诱导生姜多倍体的研究. 西南农业大学学报 , 22 (5) : 400 - 402.
Hansen A L, Gertz A, Joersho M. 1995. Short2duration colchicine treatment for in vitro chromosome doubling during ovule culture of B eta vulgaris
L. Plant B reeding, 114 (6) : 515 - 519.
Tan De2guan, Zhuang Nan2sheng, Huang Hua2sun. 2005. A review of in vitro induction of polyp loid p lantswith colchicine. Subtrop ical Plant Sini2
ca, 34 (1) : 77 - 80. ( in Chinese)
谭德冠 , 庄南生 , 黄华孙. 2005. 组织培养与秋水仙碱诱导相结合培育植物多倍体的应用. 亚热带植物科学 , 34 (1) : 77 - 80.
Zhang J ian2jun, Yin L i2qing, Fan Kun2hua, Chen Quan2qing, Zhang Zhi2qi, Zhong W ei2jin. 1997. Induction of vegetable tetrap loid via tissue
culture. Acta Agr Tur Shanghai, 13 (4) : 21 - 27. ( in Chinese)
张建军 , 殷丽青 , 范昆华 , 陈全庆 , 张智奇 , 钟维瑾. 1997. 应用组织培养诱导白菜和莴苣四倍体. 上海农业学报 , 13 ( 4) :
21 - 27.
Zhang L i2li, Zhang Shu2ning, W u Zhen, TangW ei2hua, Yang Xue2dong. 2008a. The high frequency of shoot regeneration in B rassica oleracea
L. var. italica in vitro. Journal of Nanjing Agricultural University, 31 (2) : 41 - 44. ( in Chinese)
张丽丽 , 张蜀宁 , 吴　震 , 汤伟华 , 杨学东. 2008a. 青花菜高频离体再生体系的建立. 南京农业大学学报 , 31 (2) : 41 - 44.
Zhang L i2li, Zhang Shu2ning, Zhang Hong2mei, Hou Xi2lin. 2008b. Regeneration of autotetrap loid broccoli in vitro culture and identification of the
p loidy. Acta Horticulturae Sinica, 35 (10) : 1517 - 1520. ( in Chinese)
张丽丽 , 张蜀宁 , 张红梅 , 侯喜林. 2008b. 同源四倍体青花菜离体再生及其倍性鉴定. 园艺学报 , 35 (10) : 1517 - 1520.
Zhang Zhen2chao, Zhang Shu2ning, Zhang W ei. 2007. Induction of tetrap loid of non2heading. Chinese cabbage with late2bolting and identifica2
tion of chromosome configuration. Acta Botanica Boreali2Occidentalia Sinica, 27 (1) : 28 - 32. ( in Chinese)
张振超 , 张蜀宁 , 张　伟. 2007. 四倍体不结球白菜的诱导及染色体倍性鉴定. 西北植物学报 , 27 (1) : 28 - 32.
4861