全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (4) : 783～788
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 09 - 26; 修回日期 : 2006 - 01 - 163 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: L ixl1957@eyou1com)
大花蕙兰授粉后子房 cDNA差异表达片段序列分析
陈小强　李秀兰 3 　王春国　张　勇　宋文芹　陈瑞阳
(南开大学生命科学学院 , 天津 300071)
摘 　要 : 应用 mRNA差异显示 (DDRT2PCR) 方法比较分析了大花蕙兰 (Cym bidium hybridium ) 授粉
后 2 d与未授粉子房的基因表达差异。结果分离到了 7个在授粉后子房中特异表达的 cDNA片段 , 分别命名
为 CDD2313, CDD2272, CDD2265, CDD2243, CDD2193, CDD2218, CDD2470。在 GenBank中进行同源性比
较发现前 4个没有同源序列与之匹配 ; 后 3个片段推导的氨基酸序列分别与 ABC型 transporter, GTPase和
40S核糖体蛋白质 S3 (RPS3) 有高度同源性。反向 Northern杂交进一步证实它们存在 , 并在授粉子房中高
度表达。其中 , 最为有意义的是 CDD2470, 其推定的氨基酸与参与细胞生长分化的植物源多功能蛋白 RPS3
高度同源性 , 进而推测其与 RPS3有相似的功能 , 可能与兰花子房发育有关 , 这为解释花发育分子机制提
供了新资料。
关键词 : 大花蕙兰 ; mRNA差异显示 ; 花发育 ; 40S核糖体蛋白质 S3
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0420783206
Sequence Ana lysis of the cD NA Fragm en ts D ifferen tia lly Expressed in the
O var ies of C ym bidium hybrid ium after Pollina tion
Chen Xiaoqiang, L i Xiulan3 , W ang Chunguo, Zhang Yong, Song W enqin, and Chen Ruiyang
(College of L ife Sciences, N ankai U niversity, T ian jin 300071, China)
Abstract: In this study, we identified and characterized seven cDNA fragments differentially exp ressed in
the pollinated and non2pollinated ovaries of Cym bid ium hybrid ium using mRNA differential disp lay RT2PCR
(DDRT2PCR). Deduced am ino2acid sequences of four of the seven cDNA fragments (CDD2313, CDD2272,
CDD2265, CDD2243) showed no significant homology with ESTs and genes in the Genbank databases. How2
ever, the remaining three ( CDD2193, CDD2218, CDD2470) showed significant homologies with sequences
encoding components of an ABC2type transporter, GTPase and 40S ribosomal S3 p roteins (RPS3) , respective2
ly. Their differential exp ression patterns were confirmed by reverse Northern blot analysis. CDD2470, which
encoded a new factor of RPS3 participating in cell growth and p roliferation, appeared to be p resent and highly
exp ressed in the pollinated ovaries. Based on these results, we deduced that this 40S ribosomal S3 like p rotein
was most likely involved in the ovary development of orchids, and the study gave us novel insights into the mo2
lecular mechanism of the ovary and floral development of orchids.
Key words: Cym bid ium hybrid ium ; D ifferential disp lay RT2PCR (DDRT2PCR ) ; Floral development;
40S ribosomal S3 p rotein (RPS3)
花发育是高等显花植物特有的发育过程之一 , Meyerowitz及其同事提出的花器官发育 ABC 模
型〔1〕, 使人们得以了解花发育的内在奥秘。近几年来 , 分子生物学理论和技术的发展为人们从分子
水平上认识花发育的本质提供了可能 , 目前这一领域已成为植物发育分子生物学研究的热点。1990
年从拟南芥 (A rabidopsis tha liana) 和金鱼草 (A n tirrh ium m ajus) 中第 1次分离花发育基因以来 , 一系
列花发育相关基因尤其花器官决定基因被相继分离鉴定〔2～4〕。而子房作为成熟花器官的重要组成部
分 , 对其发育相关基因的分离鉴定以及表达变化的研究将对花发育机制的阐明有着深远的理论与实践
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意义。
大花蕙兰 (Cym bid ium hybrid ium ) 属兰科 (O rchidaceae) 兰属。大多数被子植物子房发育成熟后 ,
卵细胞才能受精 , 但兰科植物子房的发育是授粉后才启动的 , 此特殊性成为子房发育研究的热点〔5, 6〕。
虽然目前已发现和分离了一批控制兰花子房发育的特异基因〔7, 8〕, 但是 , 对于兰花子房发育分子机制的
认识还相对不足。因此 , 分离更多新的与兰花子房发育有关的基因 , 并研究其在兰花子房发育过程中的
作用是非常必要的。本文采用 DDRT2PCR法成功地从大花蕙兰中分离到 7个在授粉后的子房中特异表达
的 cDNA差异片段 , 这为进一步从分子水平上阐明兰花花发育机制提供了新的可能。
1　材料与方法
111　材料
由市场购买大花蕙兰 (Cym bid ium hybrid ium ) 粉红花品种 ‘Great Flower Marie Laurencin’, 在开
花 15～20 d后进行人工授粉 , 授粉 2 d后 , 当蕊柱颜色明显变深后同时取下授粉和未授粉的子房 , 迅
速冻于液氮中备用。
112　方法
11211　总 RNA的制备及 cDNA 第一链的合成 　参照 TR IZO l λ (BB I公司产品 ) 说明 , 同时提取授
粉 2 d和未授粉的子房的总 RNA, 用不含 RNase的 DNase I ( Takara公司产品 ) 处理总 RNA, 除去总
RNA中可能含有的 DNA污染。紫外分光光度计 (NanoD rop公司产品 ) 测定 RNA的浓度和纯度 , 甲
醛变性琼脂糖凝胶 (1% ) 电泳观察其质量。总 RNA存于 - 80℃待用。
分别将 10个授粉 2 d和未授粉子房提取的 RNA等量混合 , 建立两个 RNA池 , 用于后续试验来降
低假阳性。反转录所用的锚定引物为 M11、M12、M13 (表 1) , 分别从授粉和未授粉子房总 RNA池
中取 2μg RNA, 采用 M 2MLV Reverse Transcrip tase ( Promega公司产品 ) 进行反转录 , 操作按说明书
进行。同时设计一阴性对照组即不加逆转录酶 , 其余组分不变。
11212　DDRT2PCR分析 　分别用 3种
与反转录相同的 3pi端锚定引物 (M11,
M12, M13) 和 26种 5pi端 10 bp随机引
物 (DD1, DD2⋯⋯D26) 组成 78对引
物 , 同时对授粉和未授粉的大花蕙兰子
房的 cDNA进行扩增。锚定引物和随机
引物均由上海生工生物工程公司合成
(表 1)。
25μL PCR反应体系中 , 含有 1 ×
PCR 缓冲液 , 200 μmol·L - 1 dNTPs,
015μmol·L - 1随机引物和锚定引物 , 1
μL cDNA第一链反应混合物 , 1 U Taq
DNA聚合酶 (所用到的 dNTP、1 0 ×
表 1　DD RT分析所用引物
Table 1　Pr im ers used in DD RT ana lysis
引物
Primer
序列 Sequence
(5pi 23pi ) 引物Primer 序列 Sequence(5pi 23pi ) 引物Primer 序列 Sequence(5pi 23pi )
DD21 TACAACGAGG DD211 TACCTAAGCG 3 DD221 GATCTAACCG
DD22 TGGATTGGTC DD212 CTGCTTGATG DD222 GATCGCATTG3 DD23 CTTTCTACCC DD213 GTTTTCGCAG DD223 GATCTGACTG
DD24 TTTTGGCTCC DD214 GATCAAGTCC DD224 GATCATGGTC
DD25 GGAACCAATC DD215 GATCCAGTAC DD225 GATCATAGCG
DD26 AAACTCCGTC DD216 GATCACGTAC DD226 GATCTAAGGC
DD27 TCGATACAGG 3 DD217 TCGGTCATAG 3 M211 AAGCTTTTTTTTTTC
DD28 TGGTAAAGGG DD218 GATCTCAGAC 3 M212 AAGCTTTTTTTTTTA
DD29 GATCTGACAC 3 DD219 GATCATAGCC 3 M213 AAGCTTTTTTTTTTG3 DD210 GGTACATTGG DD220 GATCAATCGC
　　注 : 3 为最终得到的 7个差异片段所用的引物。
Note: 3 Primers for seven differentially exp ressed fragments.
PCR缓冲液、ddH2O、Taq DNA聚合酶均为 Takara公司生产 )。反应条件为 : 94℃变性 5 m in, 94℃
30 s, 42℃ 2 m in, 72℃ 1 m in, 40个循环 , 72℃延伸 10 m in。反应结束 , 取 2μL PCR产物进行 6%
非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分析 , 银染法显色。
取同一种 RNA样品 3份在相同条件下平行进行反转录、PCR及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 通
过重复性检测试验来避免假阳性。
11213　差异条带回收、扩增、克隆和鉴定 　将在 3次重复试验中都稳定出现的差异带从 PAGE胶上
切下 , 捣碎 , 溶于 30μL灭菌水中 , 37℃温浴过夜。次日取上清做模板再扩增 , 用量设为 1、2和 4
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　4期 陈小强等 : 大花蕙兰授粉后子房 cDNA差异表达片段序列分析 　
μL。发现用 2μL扩增结果比较理想。扩增体系仍为 25μL, 成分和扩增条件同前 , 扩增产物用 115%
琼脂糖电泳检测。单一条带采用 Q IAquick Gel Extraction Kit (Q IAGEN公司产品 ) 按其说明进行回收
纯化。纯化后的差异条带与 pUCm2T easy载体 (BB I公司产品 ) 连接 , 将其转化入 Escherich ia coli
DH5α感受态细胞中 , 蓝白斑筛选 , 每个 cDNA片段铺 1个平板 , 每个平板挑 10个白斑 (即克隆 ) ,
PCR扩增验证。
11214　反向 Northern杂交鉴定 　反向 Northern杂交按照 VÊgeli2Lange等〔9〕和 李子银等 〔10〕的方法进
行 , 略有修改。取 1μL PCR产物点样于尼龙膜上 ( Pall公司产品 ) , 分别以未授粉和授粉后子房
cDNA为探针与其杂交。探针的标记参照 Roche公司的 D IG Labeling Kit进行。具体杂交、洗膜和显色
过程均按照 Roche公司的 D IG H igh Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ进行。
11215　测序及序列分析 　将符合要求的仅与授粉子房 cDNA探针有杂交信号的阳性克隆送上海生工
生物工程公司测序。测序结果登录美国国家生物技术信息中心 NCB I网站 (www1ncbi1nlm1nih1gov) ,
用 BLAST进行相似性分析比较。多序列比对用 ClustalW (版本 118) 软件完成。
2　结果与分析
211　授粉后子房 cD NA差异片段的鉴定
随机选用 26个差显随机引物与 3个锚定引物
(表 1) 共计 78对不同引物组合对 RNA样品反转
录产物进行 PCR分析 , 扩增产物在非变性聚丙烯
酰胺凝胶上进行电泳 , 银染后 , 可以显现出较清
晰的条带 (图 1)。从两种 cDNA 池中共扩增出
1 024条带 , 单对引物扩增 10～40条带 , 平均为
20条带。带的大小为 50～1 500 bp, 取 100～800
bp的差异片段进一步分析 , 其中 60条带在授粉
后子房中有特异表达。回收此 60个差异 cDNA片
段进行重复扩增 , 排除明显的假阳性条带 , 结果
只有 28条带能呈现单一重复性扩增 , 对此 28个
稳定出现的差异片段进行克隆转化 , 每个差异
cDNA片段随机挑取 10个克隆 , 经 PCR验证和琼
脂糖检测 , 10个克隆的 cDNA 片段大小均相同 ,
为单一条带。
212　cD NA克隆的反向 Northern杂交分析
为了进一步鉴定这 28个差异片段是否确实在
授粉子房中表达 , 每个差异片段挑选出琼脂糖凝
胶电泳鉴定均为单一条带的上述阳性克隆的 1个 ,
进行反向 Northern杂交分析。结果表明 (图 2) ,
在以未授粉子房 cDNA为探针的 C膜上总共出现
17个杂交信号 , 而在授粉子房 cDNA为探针的 P
膜上出现 18个 ; 在 28个差异片段中有 7个表明
有明显的差异 , 与授粉后子房 cDNA探针有杂交
信号而与未授粉子房探针无杂交信号 , 表明这些
图 1　大花蕙兰授粉和未授粉子房 m RNA差异显示
C和 P分别代表未授粉子房和授粉子房总 RNA反转录后扩增产物 ,
扩增所用引物组合标明在其顶部 ; 箭头指向的是在授粉子房中
特异表达的差异带 ; M代表 100 bp分子量标准。
F ig. 1　Represen ta tive DD RT2PCR results of m RNA from
the con trol and pollina ted ovar ies in C. hybrid ium
Total RNA from the control (C) and pollinated ( P) samp les was
reversetranscribed and amp lified with the p rimer combination as
indicated on top of figure; A rrows indicate the position of cDNA
bands that were recovered from the gels and further analyzed;
M: Molecular weight marker (100 bp ladder) .
片段可能与授粉后子房发育有关 ; 有 5个仅与未授粉子房探针有杂交信号 , 有 9个与两种探针均出现
杂交信号 , 另 7个与两种探针均无杂交信号。与两种探针都能杂交的片段 , 杂交信号都很强 , 表明这
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些片段代表一些高丰度表达的 mRNA, 可能是由于高丰度表达的基因在未授粉子房中有序列相似的同
源基因 , 最终确定 7个只在授粉后子房中表达的阳性差异 cDNA片段 , 分别命名为 CDD2313, CDD2
272, CDD2265, CDD2243, CDD2193, CDD2218, CDD2470。
图 2　差异 cD NA片段反向 Northern杂交
箭头所示为授粉子房中特异表达 cDNA片段的杂交信号 ; Actin: 阳性对照β2actin; CK: 阴性对照 (灭菌水 ) ;
C: 以非授粉子房 cDNA为探针 ; P: 以授粉子房 cDNA为探针。
F ig. 2　Reverse Northern blot ana lyses of isola ted d ifferen tia lly expressed cD NA fragm en ts
Arrows indicate the position of cDNA bands that were confirmed to be differentially expressed in the pollinated ovaries; Actin: Positive control from
β2actin; CK: Negative control from sterile H2O; C: W ith the non2pollinated ovary cDNA p robe; P: W ith the pollinated ovary cDNA p robe.
表 2　差异 cD NA片段序列比对分析
Table 2　Sequence hom ology ana lysis of seven d ifferen tia lly d isplayed cD NA fragm en ts
差异片段
DD p roducts
序列号
Accession No.
引物对 Primer
combination
片段长度
Length ( bp) 同源性 Homology
一致性
Identity( % )
已知蛋白功能 Function of
known p roteins
CDD2470 DQ159867 DD217 /M11 462 水稻 RPS3 RPS32O ryza sativa 89 细胞增殖 Cell growth p roliferation
CDD2313 DQ159862 DD23 /M11 313 无 No 无 No 无 No
CDD2272 DQ159864 DD221 /M12 272 无 No 无 No 无 No
CDD2265 DQ159865 DD221 /M12 265 无 No 无 No 无 No
CDD2243 DQ159863 DD210 /M13 243 无 No 无 No 无 No
CDD2218 DQ159866 DD217 /M13 218 水稻 GTPase
GTPase2O ryza sativa 52 信号转导Signal transduction
CDD2193 DQ159868 DD219 /M13 193 西红柿 ABC转运子
ABC2transporter2tomato 62 代谢转运Transport of metabolites
图 3　大花蕙兰 CDD 2470氨基酸序列与已知拟南芥和水稻的 RPS3a氨基酸序列同源性比较
A 2R PS3a及 O 2RPS3a提交序列号分别是 Q42262、P49397。
F ig. 3　A lignm en t ana lysis of the deduced am ino ac id sequences of CDD 2470 w ith those of RPS3a gene from A rabidopsis
tha liana and O ryza sa tiva
Accession numbers of A 2R PS3a: Q42262; O 2RPS3a: P49397.
　　
213　差异 cD NA片段的序列分析
采用美国国家生物技术信息中心 NCB I的 blastn和 tblastx两种 BLAST程序进行序列同源性搜索与
相似性比对 , 结果表明 , 4个克隆与已知序列无同源性 , 其余 3个片段推导的氨基酸序列分别与已知
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的蛋白或蛋白酶高度同源 (表 2)。其中 , CDD2470全长 462 bp, tblastx序列比对结果表明它与拟南
芥核糖体蛋白 S3 ( GenBank序列号 Q42262) 和水稻核糖体蛋白 S3 ( GenBank序列号 P49397) 高度
同源 (图 3) , 相似性分别为 87%和 89%。
3　讨论
本研究利用 DDRT2PCR技术分离到 7个 cDNA片段 , 其中 4个 (CDD2313, CDD2272, CDD2265,
CDD2243) 未搜寻到同源序列 , 一种可能是这些获得的特异片段只是一些基因的 3pi末端 , 而基因的 5pi
和 3pi末端非翻译区同源性很小 ; 另一种可能就是这些片段代表了一些特异的新基因 , 它们可能在大
花惠兰花的发育中起重要作用 , 这些还有待于进一步研究。另外 3个 (CDD2193, CDD2218, CDD2
470) 与已知基因序列高度同源。CDD2218长 218 bp, 编码 1个小 GTP结合蛋白 ( GTPase)。植物中
广泛存在多种 GTP结合蛋白。目前 , 至少已有 150种不同的小 GTP蛋白 cDNA克隆在植物中被分离
鉴定 , 它们可能参与了植物细胞生长、分化、物质运输和抗病等信号途径 , 从而对组织和器官发育有
一定的作用。小 GTP蛋白是否调节植物器官发育 , 最近在一些植物上已有相关文献报道〔11〕, 本研究
得到的 cDNA片段 CDD2218编码的蛋白质可能在信号传导过程中起重要作用 , 这为揭示小 GTP蛋白
在花发育中作用的研究提供了线索。CDD2193B last检索结果表明它与 ABC型 transporter (ATP2binding
cassette transporter system ) 有较高同源性 , 这种转运系统在细菌和真核生物中普遍存在 , 由 ATP直接
供能 , 是一种可能在信号传导中起作用的阳离子转运系统。本研究中克隆到的 CDD2193在授粉后子
房中特异表达 , 说明它可能参与了子房发育的信号传导过程。对 CDD2193结构、功能的进一步研究
可能会找到它与 ABC型 transporters关系的新证据 , 从而为揭示花发育信号传导过程的机制提供新的
佐证。
CDD2470长 462 bp, 其推定的 72个氨基酸的同源性比对结果 (图 3) 证明它与 40S核糖体蛋白
S3 (RPS3) 有很高的一致性。RPS3是一种多功能蛋白 , 除核糖体蛋白的功能外 , 还具有多种 DNA
损伤修复酶 (如 DNA糖基化酶、脱氧核糖磷酸二酯酶等 ) 的活性 , 在 DNA损伤修复过程的多个环
节中起作用 , 参与细胞生长和分化〔12〕。在一些研究中也发现 , 核糖体蛋白 (RP) 基因的表达量并不
恒定 , 它在不同的遗传背景下表现为差异表达 , RP因子在细胞分化前后表达不恒定的事实提示 , RP
基因很有可能参与发育调控〔13〕。一些研究也表明拟南芥编码核糖体蛋白基因的突变会导致其形态发
生改变并且对其发育有延迟作用〔14, 15〕, 这意味着核糖体蛋白在植物发育中起重要作用。本研究得到
的 CDD2470特异在大花蕙兰授粉后子房中表达 , 它是否具有与其它 RPS3基因相同的功能 , 是否参与
子房的发育调控 , 还有待进一步研究。
由于本研究成功获得的 7个 cDNA差异片段在大花蕙兰授粉后子房中特异表达 , 因此推测它们极
有可能在子房发育过程中起重要作用 , 而且初步的结果也表明大花蕙兰授粉后子房的发育可能具有区
别于拟南芥等其它植物的独特的调控模式。加深对这一调控机制的认识 , 无疑会极大促进兰花花发育
分子机制的研究进展。下一步的工作则需通过 RACE等其它方法获得全长的 cDNA克隆 , 并利用基因
沉默等技术对其确切的功能进行研究。相关研究正在进行中。
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