全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (6) : 1317～1320
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 04 - 30; 修回日期 : 2006 - 08 - 21
基金项目 : 教育部科技基础资源数据平台建设项目 (505016) ; 甘肃省科技厅事业费项目 (QS0512C31206)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: lizhean@ lzu1edu1cn)
酿酒葡萄 ‘神索 ’体胚发生及再生体系遗传稳定
性分析
杨晓明 1, 2 　安黎哲 23 　王雅梅 3 　李　胜 3
(1 甘肃省农业科学院粮食作物研究所 , 甘肃兰州 730070; 2 兰州大学生命科学学院 , 甘肃兰州 730030; 3 甘肃农业大
学生命科学学院 , 甘肃兰州 730070)
摘 　要 : 以酿酒葡萄 ‘神索 ’未成熟合子胚为外植体 , 通过植物生长调节剂、光照、温度等因素的控
制 , 研究了葡萄体胚的产生、保存及植株再生。结果表明 , 以 NN为基本培养基 , 诱导胚性愈伤组织的适
宜植物生长调节剂水平是 110 mg·L - 1 2042D; 诱导体胚的生长调节剂水平是 110 mg·L - 1 NAA + 015 mg·
L - 1 BA, 体胚诱导率为 3715% ; 5℃微光条件 , 适宜体胚的保存 ; 体胚成熟及植株再生的植物生长调节剂
水平是 0105 mg·L - 1 NAA + 015 mg·L - 1 BA, 成苗率为 4211%。利用流式细胞仪并结合染色体计数对体胚
及再生植株细胞核 DNA含量及染色体鉴定表明 , 体胚细胞染色体存在一定的变异 , 而体胚再生植株倍性稳
定 , 细胞核 DNA含量及染色体数与供体母株一致。
关键词 : 葡萄 ; 未成熟的合子胚 ; 体胚 ; 植株再生 ; 倍性
中图分类号 : S 66311　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0621317204
Soma tic Em bryogenesis and Ana lysis of the Genetic Stab ility of Regenera tion
System in Grapev ine‘S in saut’
Yang Xiaom ing1, 2 , An L izhe23 , W ang Yamei3 , and L i Sheng3
(1 Crop Institute, Academ y of Gansu Agriculture Science, Lanzhou, Gansu 730070, China; 2 School of L ife Science, Lanzhou U niver2
sity, Lanzhou, Gansu 730030, China; 3 School of L ife Science, Gansu A gricultural U niversity, Lanzhou, Gansu 730070, China)
Abstract: Somatic embryogenesis and subsequent maintenance and p lant regeneration from immature zy2
gotic embryos of grapevine (V itis vin ifera L.‘Sinsaut’) were studied by manipulating p lant growth regulator lev2
els, light intensities and temperature. The results showed that the op timum p lant growth regulator combinations
were 110 mg·L - 1 2042D for embryogenic callus induction and 110 mg·L - 1 NAA + 015 mg·L - 1 BA for em2
bryos p roduction and maintenance in weak light at 5℃ and 0103 mg·L - 1 NAA + 015 mg·L - 1 BA for somatic
embryos conversion and p lant regeneration based on NN medium. The frequency of somatic embryogenesis was
3715% , and the rate of p lantlet regeneration from somatic embryos was 4211%. The analysis of DNA content
determ ined by flow cytometry and chromosome counting of somatic embryos and regenerated p lant clearly indica2
ted that little chromosome changeswere induced during the somatic embryogenesis, but the nuclear DNA content
and p loidy levels of the regenerated p lants were stable and homogeneous to that of the donor p lants.
Key words: V itis vin ifera; Immature zygotic embryo; Somatic embryo; Plant regeneration; Ploidy level
1　目的、材料与方法
葡萄 (V itis vin ifera L. ) 体细胞胚的研究已有大量报道 , 但大多体胚发生频率及植株再生率不高 ,
也未见葡萄体胚再生体系遗传稳定性研究的报道。作者对我国西北种植的主要酿酒葡萄品种 ‘神索 ’
通过体胚建立植株再生体系 , 并对体胚发生的条件、保持及再生体系遗传稳定性进行研究 , 旨在为进
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一步的基因转化奠定基础。
采集花后 50 d (幼胚发育至心形期 ) 的果实 , 流水冲洗 , 011% HgCl2 震荡消毒 5 m in, 无菌水
冲洗 3次。取出幼胚 , 以不伤珠孔胚端切除胚珠啄部 , 接种于 NN (附加 015、110、210 mg·L - 1
2042D)诱导培养基上 , 置于 25℃、黑暗、微光 (500 lx) 条件下诱导愈伤组织。挑选质地紧密、颗粒
状、乳白色略带淡黄色的愈伤组织 , 转接到体胚诱导培养基 (NN + 110 mg·L - 1 2042D + 015 mg·L - 1
BA; 110 mg·L - 1 NAA + 110 mg·L - 1 BA, 110 mg·L - 1 NAA + 015 mg·L - 1 BA ) 上 , 在 ( 25 ±
2) ℃、黑暗、微光 (500 lx)、持续光照 (2 000 lx) 下诱导体胚的产生。挑选紧密一致的体胚 , 每隔
30 d左右继代培养 ; 部分体胚在相同的培养基上塑料薄膜封口置于 5℃微光条件下保存 , 每 3～5个
月继代 1次。对继代培养 3代以上的体胚转接到体胚再生成苗培养基 (NN + 0103 mg·L - 1 NAA + 015
mg·L - 1 BA) 上 , 置于 2 000 lx持续光照条件下诱导植株再生。再生植株采用节培法在增殖培养基
(1 /2 MS) 上扩繁。以上培养基均附加蔗糖 30 g·L - 1 , 琼脂 5 g·L - 1 , 调节 pH至 518, 121℃高压灭
菌 20 m in。
采用 Coulter Ep ils XL (美国 Coulter公司 ) 流式细胞仪测定体胚和再生植株叶片单个细胞核 DNA
含量 , 以大田植株幼嫩叶片 DNA含量作对照 , 每份材料测定 2 ×104 个细胞。分别取 200 mg体胚组
织和幼嫩叶片在 20 mL的 PBS缓冲液 (pH 714) 中用解剖刀片切碎 , 获得的溶浆通过 30μm尼龙网
膜过滤除去细胞碎片 , 1 000 g离心 5 m in, 弃掉上清液。在所得沉淀中加入 2 mL PBS缓冲液 , 并加
入 015 mL 1%的碘化丙啶 ( P I) 避光染色 25 m in。将样品上样于激发光为 448 nm波长的 Coulter Ep ils
XL分析仪 , 测定单个细胞核 DNA含量 , 用 LysisⅡ软件自动分析结果。染色体数目鉴定采用压片法。
2　结果与分析
211　胚性愈伤组织的诱导及细胞学观察
研究结果 (表 1) 表明 , 以 NN为基本培养
基 , 附加不同浓度的 2042D均可诱导出愈伤组织 ,
但愈伤组织的形态特征和分化潜力差异较大。其
中只有在 NN基本培养基附加 110 mg·L - 1 2042
D, 微光条件培养中获得乳白色或淡黄色 , 质地
紧密 , 生长较快 , 颗粒状 , 表面有再生颗粒状体
胚 , 幼小体胚晶莹透明的愈伤组织 (图版 , 1 ) ,
其在随后的继代培养中增殖速度较快 , 体胚诱导
率高 (达 80 % ) 。通过电镜观察到 , 此类愈伤组
表 1　不同处理下愈伤组织、体胚和再生植株诱导率
Table 1　The frequency of ca llus induction, soma tic
em bryogenesis and plan tlet regenera tion ( % )
处理 Treatments(mg·L - 1 )
2042D NAA BA 愈伤组织Callus 体胚 Somaticembryo 再生植株Plantlet
015 4215 - -
110 8010 - -
210 6714 - -
110 015 - 1518 -
110 110 - 2712 -
110 015 - 3715 -
0103 015 - - 4211
织细胞规则 , 核大 , 质膜紧贴细胞壁 , 胚体内细胞间存在胞间连丝 , 富含淀粉粒 (图版 , 9) , 与非
胚性愈伤组织细胞结构 (图版 , 10) 有显著差异。
212　体胚的发生和保存
体胚诱导试验结果表明 , NN + 110 mg·L - 1 NAA + 015 mg·L - 1 BA , 微光 (500 lx) 条件下培养
有利于体胚的发生 (图版 , 2) , 体胚诱导率 3715% (表 1) , 体胚呈乳白色颗粒状 , 质量好 , 再生率
高 ; 黑暗条件下 , 体胚增殖速度缓慢 , 胚性愈伤组织向非胚性愈伤组织转化 ; 持续光照 ( 2 000 lx)
条件培养 , 愈伤组织表面大量体胚开始变绿 , 不利于体胚的发生 , 这说明持续光照降低体胚质量并改
变其发生方式。通过石蜡切片对体胚组织发育阶段的观察了解到 , 体胚发育和合子胚发育过程相似 ,
经历了典型的多细胞原胚、球形胚、梨形胚、心形胚、子叶胚 5个阶段。体胚保存试验结果表明 , 体
胚在相同的培养基上用塑料薄膜封住瓶口置于 5℃微光条件下保存 , 3～5个月继代 1次 , 可有效保持
体胚活力 , 保存的体胚转接到新鲜体胚诱导培养基上 , 30% ～65%的体胚能够继续生长 , 并在其周围
产生新的体胚组织。
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　6期 杨晓明等 : 酿酒葡萄 ‘神索 ’体胚发生及再生体系遗传稳定性分析 　
213　体胚成熟及植株再生
体胚转化和再生植株试验结果表明 , 体胚成熟的标志是叶绿素和子叶形成 (图版 , 3) , 而且只有
4211%的体胚陆续发育成熟产生幼苗 , 最早 15 d可见芽丛 (图版 , 4) 或幼苗 (图版 , 5 ) , 40 d幼
苗长至 6 cm左右 (图版 , 6)。过大过小的体胚都不能很好地转换。过大体胚可能已经超过了转化的
最佳时期 , 过小体胚由于体内无足够营养物质或体胚未达生理成熟而使其转化受到影响。个别体胚甚
至发育成畸形胚 (图版 , 3)。在诱导体胚成苗过程中还发现 , 即使转接发育进程基本一致的体胚 ,
在随后的培养过程中发育进度也不同步。有的发育成正常植株 , 有的仍停留在转接时的状态 , 有的表
面产生次生体胚或愈伤组织 (图版 , 6)。再生植株剪成 1～2个芽茎段 , 在 1 /2 MS培养上诱导可生
根 (图版 , 7)。
214　体胚、再生体系遗传稳定性分析
染色体鉴定结果表明 , 体胚分生组织存在一
定的染色体变异 , 除主要的二倍体细胞 (2n = 2x
= 38) 外 , 还有一些非正常细胞 , 约占细胞总数
的 17% ; 体胚再生植株根尖细胞染色体数 38 (图
版 , 8) , 与母株一致 , 未检测到其它倍性细胞。
采用 Lysis II软件对细胞流式仪自动测定的 DAN
含量分布情况分析表明 , 通过体胚形成的再生植
株 DNA含量 (图 1, A ) 与供体母株 (图 1, B )
一致 , 正常二倍体细胞 (2C) 占绝对优势 , 分别
占细胞总数的 7818%和 8315% ; 四倍体细胞
(4C) 与二倍体细胞 (2C) DNA含量的比值分别
为 11960和 11963, 约等与 2。虽然二者均存在
DNA含量加倍的细胞 ( 4C) , 分别占检测细胞总
数的 1219%和 1615% , 但这里染色体加倍细胞的
存在不能归咎于遗传变异 , 而与细胞分裂周期有
关 , 因为细胞处在分裂间期的 S期时 DNA进行复
制 , DNA含量加倍。
3　讨论
本研究认为葡萄未成熟的合子胚具有较高的
图 1　叶片 D NA含量分布曲线
A. 体胚再生植株 ; B. 大田供体母株。
F ig. 1　D NA con ten t d istr ibution of plan t leaf
A. Regenerated p lantlet; B. Donor p lant.
胚性感受态水平 , 低浓度 2042D诱导处理 , 并结合微光培养有利于诱导胚性愈伤组织。在诱导体
胚发生过程中 , NAA替代 2042D有利于体胚的转化和萌发。在体胚成熟及转化过程中 , 体胚发育
阶段很不同步。这在葡萄叶片〔1〕、花粉〔2〕、卷须〔3〕为外植体诱导的体胚转化过程中也普遍存在。
一般认为植物组织或细胞离体培养过程中 , 通过体胚发生再生植株能够稳定遗传外植体的基因型。
然而研究表明 , 通过体胚再生植株的遗传稳定性只是相对的〔4〕。L i等〔5〕对二倍体欧亚种
‘Grenach’葡萄的花药在 B5 培养基中培养 , 获得了三倍体葡萄 ; Stamp等〔6〕报道了多个品种的葡
萄叶片在 M S附加 62BA培养基中获得再生植株与亲本表现出了形态多样性。关于葡萄体胚再生体
系的遗传稳定性缺乏系统研究。本研究认为 , 体胚染色体存在一定的变异 , 而通过体胚再生植株
染色体及 DNA含量与母株一致。这说明在体胚成熟及转化过程中 , 正常二倍体细胞具有较强的竞
争优势 , 可再生植株。同时也说明体胚再生体系的遗传稳定性是有限的。当然 , 本研究仅从核
DNA含量和染色体变异来判断遗传稳定性是不够的 , 还需从表型、生理、生化等方面分析 , 并有
待进一步的大田验证。
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图版说明 : 1. 胚性愈伤组织 ; 2. 体细胞胚 ; 3. 体胚成熟和转化 ; 4. 体胚再生的丛芽 ; 5. 体胚再生形成小苗 ; 6. 体胚再生形成植
株 ; 7. 再生植株生根 ; 8. 再生植株根尖染色体 (2n = 2x = 38) ; 9. 胚性愈伤组织细胞 ; 10. 非胚性愈伤组织细胞。
Explana tion of pla tes: 1. Embryogenic callus; 2. Somatic embryos; 3. Somatic embryos development and conversion; 4. Bud cluster from
somatic embryos; 5. Shoot regenerated from somatic embryo; 6. Plantlet regenerated from somatic embryos; 7. Roots of regenerated p lantlet; 8.
Chromosomes with 2n = 2x = 38 of a p lantlet regenerated from somatic embryo; 9. Embryogenic cell; 10. Non2embryogenic cell.
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