全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (3) : 423 - 426
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 11 - 18; 修回日期 : 2008 - 01 - 24
基金项目 : 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xlchencaas@1261com)
李离体茎尖的超低温保存
赵艳华 1 , 吴雅琴 1 , 程和禾 1 , 李春敏 1 , 陈晓玲 23 , 卢新雄 2
(1 河北省农林科学院昌黎果树研究所 , 河北昌黎 066600; 2 中国农业科学院作物科学研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 以简单玻璃化法为基本方法 , 研究了影响李离体茎尖超低温保存的因子 ———继代培养时间、
低温驯化时间、PVS3处理时间以及化冻后茎尖存活检测。建立了较为简单的李离体茎尖超低温保存技术程
序 : 即选择继代培养 120 d的试管材料 , 经过 5 ℃低温驯化 21 d, 017 mol·L - 1蔗糖预培养 1 d, PVS3处理
100 m in, 浸入液氮。化冻后茎尖存活率可达 60%以上。
关键词 : 李 ; 离体茎尖 ; 超低温保存
中图分类号 : S 66213　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0320423204
Cryopreserva tion of Shoot T ips from P runus
ZHAO Yan2hua1 , WU Ya2qin1 , CHENG He2he1 , L I Chun2m in1 , CHEN Xiao2ling23 , and LU Xin2xiong2
(1 Changli Institu te of Pom ology, Hebei A cadem y of A gricu ltura l and Forestry Sciences, Chang li, Hebei 066600, China;
2 Institu te of C rop Sciences, Chinese A cadem y of A gricultura l Sciences, B eijing 100081, China)
Abstract: The current paper studied factors that effect the cryop reservation of Prunus sa licina L indl in
vitro shoot tip s. By using simp le vitrification technique, factors like, culture time, PVS3 treatment time and
cold hardening were all tested, the rap id exam ination method of shoot tip s survival was studied, and a samp le
p rocedure was established at last. W hen shoot tip s were excised from healthy in vitro p lants of P runus culti2
vars, that have been subcultured for 120 d and followed by 5 ℃ cold hardening for 21 d, and p recultured with
017 mol·L - 1 sucrose for 2 d, treated with PVS3 for 100 m in before direct p lunging into liquid nitrogen, the
survival after cryop reservation was higher than 6010%.
Key words: P runus; shoot tip s; cryop reservation
李 ( P runus sa licina L indl) 育种工作中 , 有大量的无性系或杂种作为遗传资源需要被安全保存。
B rison等 (1995, 1997) 先后报道了利用两步降温法结合玻璃化法保存两个杂交李砧木获得成功。本
试验的目的在于建立较为简单 , 且适宜范围广泛的李离体茎尖超低温保存技术程序 , 以实现李种质资
源超低温保存技术的实用化。
1　材料与方法
111　试材
供试的 6个李品种 (大实早生、来客、澳李 14、尤萨李、红宝石、罗马尼亚李 ) 均来源于河北
省农林科学院昌黎果树研究所资源圃 , 分别于 2002年和 2003年春取多年生母株的芽进行离体培养 ,
建立试管无性系。继代培养基为 MS +BA 110 mg·L - 1 +NAA 011 mg·L - 1 +蔗糖 30 g·L - 1 + 琼脂 5
g·L - 1 , pH 516, 培养温度 (25 ±2) ℃, 光照强度 2 000 lx。
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112　简单玻璃化法基本程序
将继代培养一定时间的试管材料置于 5 ℃光照培养箱低温驯化一定时间后 , 在无菌条件下切取其
茎尖放在含 017 mol·L - 1蔗糖的固体 MS培养基上预培养 1 d, 然后移入装有 115 mL PVS3 (50%甘油
+ 50%蔗糖 ) 的冷冻管中处理一定时间后 , 投入液氮。茎尖在液氮中保持 24 h以上 , 取出冷冻管放
入水浴锅 , 25 ℃条件下化冻 1 m in后直接培养 (赵艳华 等 , 1999)。
在其他因素不变的前提下 , 以大石早生品种为试材进行如下单因子试验 : (1) 继代培养时间 ;
(2) 低温驯化时间 ; (3) 玻璃化保护液处理时间。每处理 20个茎尖 , 3次重复。存活率为化冻后形
成新植株的茎尖数占茎尖总数的百分比。
113　茎尖含水量测定
称 50个新鲜茎尖的质量 , 之后放在 80 ℃烘箱干燥 4 h, 再称其干质量 , 计算含水量。
114　茎尖存活快速检测
经超低温保存的茎尖化冻后在浓度为 110 mg·L - 1的 FDA染液中染色 30 m in以上 , 在 - 15 ℃温
度下冷冻 10 m in, 切片 , 在荧光显微镜下观察并照相。
2　结果与分析
211　继代培养时间对李离体茎尖超低温保存效果的影响
选不同继代培养时间的试材 , 低温驯化 21 d, 017 mol·L - 1蔗糖预培养 1 d, PVS3处理 80 m in后
进行超低温保存。结果表明 : 未经超低温保存的 4个处理茎尖存活率均为 100% ; 继代培养 30、60、
90和 120 d的材料经超低温保存后 , 茎尖存活率依次升高。培养 120 d的试材显著高于 30、60和 90 d
的。经含水量测定发现 , 随培养时间的延长 , 试管苗茎尖含水量逐渐降低 , 当培养 120 d时含水量达
51%。此种材料用于超低温保存较好 , 存活率可达 75% (图 1)。如继续延长培养时间 , 存活率可能
会提高 , 但是培养瓶中培养基已近耗干 , 部分材料萎蔫 , 不便于茎尖剥取。
图 1　继代培养时间对李离体茎尖超低温保存效果的影响
F ig. 1　The effect of culture tim e on cryopreserva tion of P runus shoot
212　低温驯化时间对超低温保存效果的影响
低温驯化是超低温保存中不可缺少的一步。选用继代培养 120 d的材料 , 经 5 ℃驯化不同时间
后 , 017 mol·L - 1蔗糖预培养 1 d, 再用 PVS3处理 100 m in进行超低温保存。未经超低温保存的处理
间无明显区别 , 驯化 0、7、14和 21 d的材料经超低温保存后茎尖存活率依次增加 , 21～28 d, 存活
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　3期 赵艳华等 : 李离体茎尖的超低温保存 　
率无明显升高。故认为李离体茎尖超低温保存过程中低温驯化 21 d即可 (图 2)。
图 2　低温驯化时间对李离体茎尖超低温保存效果的影响
F ig. 2　The effect of cold harden ing tim e on cryopreserva tion of P runus shoot tips
213　PVS3处理时间对超低温保存效果的影响
根据上述试验 , 选取继代培养 120 d的试材低温驯化 21 d, 017 mol·L - 1蔗糖预培养 1 d, PVS3
分别处理 20、40、60、80、100、120和 140 m in后进行超低温保存。由图 3可知 : 未经超低温保存的
茎尖存活率变化较小 , 随 PVS3处理时间的延长存活率略有降低 ; 经超低温保存的茎尖随 PVS3处理
时间的延长存活率明显上升 , 100 m in达峰值 , 之后下降。因此认为 PVS3处理 100 m in对李离体茎尖
超低温保存较为适宜 , 时间过长会导致过度脱水。
图 3　PVS3处理时间对李离体茎尖超低温保存效果的影响
F ig. 3　The effect of PVS3 trea tm en t tim e on cryopreserva tion of P runus shoot tips
214　超低温保存程序的建立
综合以上影响因子 , 建立李离体茎尖超低温保存技术程序 : 取继代培养 120 d的试材 5 ℃低温驯
化 21 d , 取其茎尖→017 mol·L - 1蔗糖预培养 1 d→PVS3处理 100 m in →液氮保存 →25 ℃快速化冻→
植株再生。
利用所建技术程序保存了国内外 6个不同的基因型 , 均获得了较高的存活率 , ‘大实早生 ’
65% , ‘来客 ’60% , ‘澳李 14’73% , ‘尤萨李’52% , ‘红宝石 ’75% , ‘罗马尼亚李 ’59%。
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215　超低温保存后茎尖存活的快速检测
通常确定超低温保存茎尖是否存活都是化冻后再培养 , 绝大多数树种需要 7 d以上。本试验中利
用冷冻切片技术实现了茎尖的快速检测 , 仅需 1 h即可完成。经超低温保存的茎尖化冻后在浓度为
110 mg·L - 1的 FDA染液中染色 30 m in以上 , 在 - 15 ℃温度下冷冻 10 m in切片 , 在荧光显微镜下观
察。未经超低温保存的茎尖整个出现绿色荧光 (图版 , 1) , 表明其为活体 , 完全冻死的茎尖则没有
荧光 (图版 , 2)。超低温保存后存活的茎尖外部叶原基冻死无绿色荧光 , 而分生组织出现绿色荧光
(图版 , 3) , 说明其存活 , 经培养后可形成植株。
试验中发现有两个方面值得注意 : 一是染色时间少于 30 m in, 荧光太弱 , 超过 60 m in, 荧光也减
弱 , 因此染色时间应在 30～50 m in之间 ; 二是染色后的茎尖在 - 15 ℃温度下冷冻时间不要超过 10
m in, 否则茎尖被冻坏 , 难以确定材料是在超低温保存过程中冻坏还是在冷冻切片机中受冻。
3　小结
试验表明 : 李离体茎尖的超低温保存受低温驯化时间和玻璃化液处理时间的影响。当低温驯化
21 d, PVS3处理 100 m in时 , 可获得较高存活率。另外 , 超低温保存存活率与材料生理状态直接相
关 , 继代培养时间 120 d的材料 , 在培养室条件下经自然脱水后茎尖含水量降低 , 超低温保存后茎尖
存活率较高。
简单玻璃化法超低温保存略去了装载、卸载及化冻后高浓度蔗糖洗涤等过程 , 与 Marthe B rism的
方法相比 , 在保持较高存活率的前提下程序简单 , 容易操作 , 此程序的建立为保存健康的李遗传资源
提供了简单可行的途径 ; 荧光纤维技术的应用为检测茎尖存活提供了简便快捷的手段。
References
B rison M, de Boucaud M T, Dosba F. 1995. Cryop reservation of in vitro grown shoot tip s of two interspecific Prunus roorstooks. Plant Science,
105 (2) : 235 - 242.
B rison M, de Boucaud M T, PierronnetA, Dosba F. 1997. Effect of cryop reservation on the sanitary state of a cv. Prunus rootstock experimentally
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Zhao Yan2hua, W u Yong2jie, Zhou M ing2de. 1999. Cryop reservation of in vitro culture shoot tip s of Prunus m ahaleb. Acta Horticulturae Sinica,
26 (6) : 402 - 403. ( in Chinese)
赵艳华 , 吴永杰 , 周明德. 1999. 马哈利离体茎尖超低温保存的研究. 园艺学报 , 26 (6) : 402 - 403.
图版说明 : 1. 未超低温保存的茎尖 ; 2. 超低温保存后分生组织冻死的茎尖 ; 3. 超低温保存后分生组织存活的茎尖。
Explana tion of pla tes: 1. Shoot tip s of no cryop reservation; 2. Shoot tip swith death meristem s after cryop reservation; 3. Shoot tip swith survival
meristem s after cryop reservation.
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