全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (3) : 625～628
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 05 - 19; 修回日期 : 2005 - 07 - 14
基金项目 : 国家科技攻关项目 (2001BA502B09204) ; 河北省科技攻关项目 ( 04220111D ) ; 河北农业大学科技将帅计划项目 ; 河
北农业大学科学发展基金项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: kjliu@mail1hebau1edu1cn)
枣离体叶片高效再生植株的研究
周瑞金　刘孟军 3
(河北农业大学中国枣研究中心 , 河北保定 071001)
摘 　要 : 以 ‘黄骅冬枣 ’组培苗叶片为试材 , 研究了叶片幼嫩程度、叶片来源、组培苗状态以及植物
生长调节剂等对离体叶片诱导不定芽再生的影响 , 并获得了完整的再生植株。结果表明 , 以未生根组培苗
中上部叶片再生效果较好 ; TDZ诱导叶片再生不定芽的效果显著优于 BA; 离体叶片在 MS + TDZ 110 mg·
L - 1 + IBA 011 mg·L - 1培养基中诱导培养 28 d后 , 转入 MS + IBA 011 mg·L - 1 + GA3 0105 mg·L - 1培养基
中二次培养 , 叶片再生效果最好 , 再生率可达 92145%。将叶片再生植株转入 MS + BA 110 mg·L - 1 + KT
015 mg·L - 1 + IBA 011 mg·L - 1培养基中继代增殖培养 , 增殖系数达 3164。以 1 /2MS + IAA 110 mg·L - 1培
养基诱导生根 , 生根率 8711%。生根苗大田移栽成活率达到 57%。
关键词 : 枣 ; 叶片培养 ; 植株再生
中图分类号 : S 66511　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0320625204
Establishm en t of H igh2eff ic ien t in V itro L eaf Regenera tion System in Ch inese
Jujube
Zhou Ruijin and L iu Mengjun3
(Research Center of Chinese Jujube, A gricu ltura l U niversity of Hebei, B aoding, Hebei 071001, Ch ina)
Abstract: Factors affecting in vitro leaf regeneration including age of leaf, source of leaf, condition of
tube2p lantlet and hormones in culture medium were studied in Z iziphus ju juba‘Huanghua Dongzao’. A high2
efficient system of in vitro leaf regeneration was established. The upper and m iddle leaves from rootless tube2
p lantlet were easier to regenerate than those from rooted tube2p lantlet. The efficiency of TDZ was significantly
higher than BA in the induction of adventitious bud from leaf. Leaves should be first induced on MS medium
supp lemented with TDZ (110 mg·L - 1 ) and IBA (011 mg·L - 1 ) for 28 days, and than transferred to medi2
um MS + IBA 011 mg·L - 1 + GA3 0105 mg·L - 1. In thisway, the regeneration rate reached 92145%. MS +
BA 110 mg·L - 1 + KT 015 mg·L - 1 + IBA 011 mg·L - 1 was suitable for subculture of shoots, with the mul2
tip lication coefficient of 3164. The regenerated p lantlets rooted well in 1 /2MS medium p lus IAA (110 mg·
L - 1 ) , w ith rooting percentage of 8711%. The survival rate of rooted p lantlets in the field was 57%.
Key words: Chinese jujube; Leaf culture; Plantlet regeneration
1　目的、材料与方法
枣树组织培养研究起步较晚且主要集中于茎尖和茎段培养 , 目的多是建立快繁体系。利用离体叶
片建立枣的再生体系 , 国外迄今尚未见研究报道 , 国内也仅在少数几个品种〔1～6〕中有过报道 , 但均存
在不定芽再生困难、再生率低的问题 , 再生率多数只有 40%左右 , 用于遗传转化有很大局限性。本
试验针对上述问题 , 通过研究影响叶片离体再生的主要因素 , 建立了枣叶片的高效再生体系 , 为叶盘
法基因转化打下了基础。
园 　　艺 　　学 　　报 33卷
试验材料为优良鲜食枣品种 ‘黄骅冬枣 ’ (简称冬枣 ) 继代培养 16代左右的组培苗叶片。继代
培养基为 MS +BA 115 mg·L - 1 (单位下同 ) + IBA 012, 45 d继代 1次。取组培苗中上部 (幼嫩程
度试验除外 ) 叶片 , 垂直于叶中脉横切 3～5刀 , 叶背面接触培养基接种于再生培养基上。诱导叶片
再生的培养基为 MS + TDZ 210 + IBA 015 (植物生长调节剂试验除外 )。叶片首先在再生培养基中暗
培养两周 , 然后转至光下培养。28 d后转入分化培养基 (MS + IBA 011 + GA3 0105) 中进行二次培
养。7～10 d后统计再生情况。不定芽再生率 ( % ) = (不定芽再生叶片数 /接种叶片数 ) ×100; 平
均出芽数 =再生不定芽数 /接种叶片总数。将分化出的芽丛分割转移到伸长培养基继代培养 , 30 d继
代 1次。前述试验所用培养基均附加蔗糖 30 g·L - 1、琼脂 310 g·L - 1 (北京双旋微生物培养基制品
厂生产 ) , pH 518, 培养温度 (25 ±2) ℃, 光照强度 1 000 lx, 光周期 14 h·d - 1。剪取生长健壮的茎
段接入生根培养基 (1 /2MS + IAA 110 +蔗糖 20 g·L - 1 +琼脂 310 g·L - 1 , pH 518) , 培养条件同前。
生根苗炼苗后移植于过渡基质 (蛭石 ∶腐殖土 ∶田园土 = 2∶1∶2) 中。试验数据用邓肯氏新复极差法进
行差异显著性测验。所有数据分析均采用 SPSS810软件。
2　结果与分析
211　不定芽的诱导和分化
21111　叶片幼嫩程度对再生的影响 　由表 1可以看出 , 组培苗不同部位的叶片 , 由于成熟度不同 ,
再生植株的能力存在显著差异。顶部第 1片嫩叶极易褐化 , 极少能够甚至不能形成愈伤组织 , 中部刚
刚停长的叶片再生能力最强 , 上部次之 , 下部叶片再生能力最弱。
表 1　叶片幼嫩程度对再生的影响
Table 1　Effect of leaf age on bud regenera tion of leaf
叶位
Leaf position
叶片外形特征
Character of leaf
接种数
Number of
leaf inoculated
再生率
Regeneration
rate ( % )
平均每叶块出芽数
Adventitious buds per
leaf disc
顶部 1　Top No. 1 未展开 ,黄绿 Folded, yellow2green 70 0 0 b
上部 2～4　Upper No. 2 - 4 刚伸展开 ,绿色 Unfolded, green 77 64194 1163 ±0127 a
中部 5～7　M iddle No. 5 - 7 刚停长 ,暗绿 Just stop growing, deep2green 64 71188 2141 ±0109 a
下部 8～10　Lower No. 8 - 10 停长 ,暗绿 Stop growing, deep2green 43 41105 1178 ±0149 a
21112　不同来源叶片对再生的影响 　田间植株新生叶片可 100%分化愈伤组织 , 但愈伤组织呈松散
的水浸状 , 绿色 , 透明 , 失水后为白色酥松状 , 无再生不定芽的能力 ; 田间植株成熟叶片和老叶片也
能形成愈伤组织 , 但出愈率低 , 分别为 6816%和 111% , 亦无分化不定芽的能力。组培苗除顶部未展
开的嫩叶外 , 其它部位叶片均可 100%分化愈伤组织 , 而且愈伤组织质量高 , 致密 , 深绿色 , 并可分
化再生不定芽 , 再生率均高于 40%。说明冬枣田间叶片不适于用作叶片诱导再生的试材。分析田间
植株叶片再生率低的原因 , 一方面可能是其成熟度高于组培苗叶片 , 脱分化困难 ; 另一方面 , 田间叶
片接种前必须经过灭菌 , 可能会降低分化能力。
21113　组培苗生根与否对叶片再生的影响 　组培苗在同一种继代培养基中培养时 , 有个别苗出现生
根现象。分别取生根和未生根组培苗的中上部叶片进行诱导 , 结果出愈率均为 100%。但是 , 来自生
根组培苗的叶片生成愈伤组织较早 , 前期愈伤组织量较大 , 浅绿色 , 致密 , 后期愈伤组织质量下降 ,
呈松散的颗粒状 , 无光泽 , 再生率低 , 仅为 3115% , 平均每叶块出芽数 1128个 ; 而来自未生根组培
苗的叶片分化愈伤组织相对较晚 , 前期量少、颜色较浅、致密 , 后期愈伤组织颜色深绿、有光泽、致
密 , 再生不定芽较容易 , 再生率为 5414% , 平均出芽数 2135个 /叶块。有根试管苗叶片再生不定芽
困难 , 可能是因为试管苗生根后 , 植株开始走向衰老 , 体内激素或营养物质发生变化 , 从而影响叶片
再生效果 , 具体原因还有待于进一步研究。
21114　植物生长调节剂对叶片再生的影响 　细胞分裂素类物质 BA和 TDZ对诱导叶片再生不定芽的
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　3期 周瑞金等 : 枣离体叶片高效再生植株的研究 　
效果有显著差异 , TDZ优于 BA。BA与生长素类物质 IBA结合使用 , 利于叶片分化不定根 , 随着 IBA
浓度的增大 , 不定根再生能力增强。TDZ与 IBA结合使用时 , 以 TDZ 110 + IBA 011 (图版 , 1 ) 和
TDZ 110 + IBA 015再生情况最好 , 二者差异不显著 , 从节约成本考虑 , 认为前者较好。
表 2　不同植物生长调节剂配比对再生的影响
Table 2　Effect of plan t growth regula tor com b ina tion on bud regenera tion of leaf
植物生长调节剂
Plant growth regulator(mg·L - 1 )
BA TDZ IBA
接种数
Number of leaf
inoculated
再生率
Regeneration
rate ( % )
平均出芽数
Adventitious buds
per leaf disc
不定根再生率
Percentage of adventitious
root formation ( % )
310 - - 48 12150 0117 ±0114 e 0
310 - 011 40 0 0 e 5100
310 - 110 42 0 0 e 50100
- 015 011 53 77136 2136 ±0137 c 0
- 015 015 61 85124 3111 ±0151 b 0
- 110 - 53 81113 2113 ±0118 c 0
- 110 011 53 92145 4164 ±0125 a 0
- 110 015 51 90120 4151 ±0138 a 0
- 110 110 62 72158 1190 ±0145 c 0
- 210 011 59 89183 1197 ±0137 c 0
- 310 011 51 88124 0198 ±0118 d 0
　　注 : MS为基本培养基。Note: MS as the basic medium.
212　不定芽的伸长
将以上试验中分化的不定芽继代于不同的伸长培养基中继续培养 , 结果见表 3。BA对试管苗伸
长作用不大 , 高浓度的 BA可诱导丛生。但 BA浓度为 310 mg·L - 1时 , 试管苗玻璃化现象严重 , 叶
片和茎深绿色 , 呈水浸状 , 透明 , 叶片卷曲。在不附加 BA的培养基中 , 试管苗基部褐化严重 , 伸长
受抑制 , 尤其在 KT 210 + IBA 015中 , 小老苗现象极为严重。所以 KT不宜单独使用 , 适当浓度的 KT
和 BA结合才能发挥较好的诱导作用。综合比较认为 , MS +BA 110 + KT 015 + IBA 011为不定芽的最
适伸长和增殖培养基 (图版 , 2)。
表 3　不同植物生长调节剂组合对冬枣芽增殖生长的影响
Table 3　Effect of d ifferen t plan t growth regula tor com b ina tion s on prolifera tion of plan tlet in ‘D ongzao’
植物生长调节剂 Plant growth regulator(mg·L - 1 )
BA KT IBA
接种数 Number
of bud inoculated
平均伸长
Elongation ( cm)
增殖系数
Multip lication coefficient
110 - - 141 0179 ±0125 c 2117 ±0116 e
110 - 011 120 1150 ±0141 b 2185 ±0130 d
110 - 015 138 2113 ±0117 ab 2150 ±0130 de
110 015 015 129 2100 ±0161 ab 2179 ±0125 d
- 015 011 150 0177 ±0141 c 2152 ±0125 de
110 015 011 150 2143 ±0139 a 3164 ±0115 c
210 - 015 150 1159 ±0154 b 3170 ±0108 c
- 210 015 120 0123 ±0109 c 1105 ±0113 f
310 - 015 159 1161 ±0133 b 4117 ±0136 b
310 015 015 108 1182 ±0125 ab 4189 ±0119 a
　　注 : MS为基本培养基。Note: MS as the basic medium.
213　生根及移栽成苗
切取生长健壮的茎段移至生根培养基 (1 /2MS + IAA 110 +蔗糖 20 g·L - 1 +琼脂 310 g·L - 1 , pH
518) , 生根率达 8711% , 平均每株不定根数达 4130条 , 平均根长为 1146 cm。当小苗有 3条以上正
常根 , 苗高达 3～5 cm时 , 即可进行移栽。移栽基质为蛭石 ∶腐殖土 ∶田园土 = 2∶1∶2, 保湿栽培。过
渡移栽 30 d后 , 将小苗移入大田 , 移栽成活率达 57% (图版 , 3)。
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
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图版说明 : 1. 再生不定植株 ; 2. 分化的不定植株继代增殖培养 ; 3. 移栽生根再生植株。
Explana tion of pla tes: 1. Regeneration shoots of leaf; 2. Elongated shoots in the elongation medium; 3. Regenerated p lants were transp lanted
into verm iculite.
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