全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(8)：1117—1124
Acta Hortieuhurae Sinica
山楂 (Crataegus pinnatifda Bge．)遗传多样性 的
RAPD和 ISSR标记分析
代红艳 ．一，郭修武 ，张 叶 ，李媛媛 ，李 贺 ，周传生 ，张志宏
( 沈阳农业大学果树生物技术与遗传改良创新团队，沈阳 110161； 沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110161)
摘 要：利用RAPD和 ISSR标记对 35份山楂 (Crataegus pinnatifda Bge．)资源进行了 DNA多态性分
析。12个 RAPD引物共扩增出 110条清晰的谱带 ，其中89条显示多态性，平均每个引物扩增出7．4条多态
性谱带。13个 ISSR引物共扩增出 110条清晰的谱带，其中94条显示多态性 ，平均每个引物扩增出7．2条
多态性谱带。基于RAPD和ISSR标记，利用UPGMA分别构建了35份山楂资源的聚类树状图。距离系数分
别为0～0．62(RAPD)和0～0．64(ISSR)，表明山楂具有较高的遗传多样性。
关键词：山楂；RAPD；ISSR；遗传多样性
中图分类号：S 661．5 文献标识码：A 文章编号 ：0513-353X (20o8)08—1117-08
Genetic Diversity of Crataegus pinnatifuta Bge．as Evaluated by RAPD and
ISSR M arkers
DAI Hong—yan‘一
，
GUO Xiu—wu 一，ZHANG Ye ，LI Yuan—yuan 一，LI He‘一
，
ZHOU Chuan—sheng ，and
ZHANG Zhi．hong ，
( Team ofBiotechnology and Genetic Improvement ofFruit Trees，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China；
Colege ofHorticulture，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China)
Abstract：The DNA polymorphism of thirty—five hawthorn accessions(Crataegus pinnat da Bge．)were
analyzed using randomly amplifed polymorphie DNA (RAPD)and inter—simple sequence repeat(ISSR)
markers in the present study．Twelve RAPD primers generated a total of 1 1 0 clear and reproducible bands，of
which 89 were polymorphic，with an average of 7．4 polymorphic fragments per primer．Thirteen ISSR primers
generated a total of 1 10 clear and reproducible bands，of which 94 were polymorphic，with an average of 7．2
polymorphic fragments per primer．The dendrogram based on RAPD and ISSR data were constructed separately
by using UPGMA analysis．The distance coeficient of the analyzed materials ranged from 0 to 0．62 and 0 to
0．64 for RAPD and ISSR markers，respectively．The results indicated that the C．pinnatifda species had high
level of genetic diversity．
Key words：Crataegus pinnat da Bge．；RAPD；ISSR；genetic diversity
山楂属 (Crataegus spp．)植物广泛分布于亚洲、欧洲、中北美洲及南美洲的北部。全世界的山
楂属植物约200个种 (Phipps et a1．，2003)，起源于中国的山楂属植物有 18个种和6个变种 (赵焕谆
和丰宝田，1996)，其中山楂 (C．pinnatifda Bge。)是最主要的栽培种。山楂有众多变异类型，仅从
大果山楂变种 (C．pinnatifda Bge．var．major N．E．Br．)中选育出的栽培品种就有数百个 (赵焕谆和
丰宝田，1996)。
虽然中国山楂资源研究工作开展较早，但至今仍然主要是通过常规方法对山楂资源进行评价鉴
收稿日期：2008—02—03；修回日期：2008—06一l1
基金项目：沈阳农业大学青年教师科研基金项目
通讯作者 Author for corespondence(E—mail：zhangz@syau．edu．ca)
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园 艺 学 报 35卷
定。RAPD和 ISSR标记都是基于 PCR技术的分子标记，具有操作简单、费用低廉、多态性强、DNA
用量少等优点 (Fowler et a1．，1998；Qian et a1．，2001；Mationi et a1．，2002；Kuras et a1．，2004)，已
被广泛应用于植物遗传图谱构建、亲缘关系分析和品种鉴定、遗传多样性分析等研究中 (Tikunov et
a1．，2003；Souframanien&Gopalakrishna，2004；Meloni et a1．，2006；王志刚 等，2007)。
本研究在探索建立并优化山楂 RAPD和 ISSR分析体系的基础上，利用RAPD和 ISSR标记对国家
果树种质沈阳山楂圃保存的35份山楂资源进行分析，为山楂核心种质的确定提供依据。
1 材料与方法
1．1 植物材料
以国家果树种质沈阳山楂圃种植保存的35份山楂 (C．pinnatifda Bge．)资源为试材，包括新宾
软籽、开原软籽、垂枝山里红、大山里红、粉山里红等 5个野生类型和30个在 《中国果树志 ·山楂
卷》 (赵焕谆和丰宝田，1996)中有记载的不同类型的大果山楂 (C．pinnatifda Bge．vat．major
N．E．Br．)栽培品种。同时以辽宁山楂 (C．sanguinea Pal1．)作为外群。
1．2 总 DNA的提取
采用改进的CTAB法从山楂幼叶中提取总 DNA，具体操作参见肖敏等 (2005)的报道，提取缓
冲液中CTAB的浓度由2％提高至3％。
1．3 RAPD和 ISSR扩增
RAPD反应体积为 20 tzL，内含 1×PCR反应缓冲液 (Promega)，2．0 mmol·L～MgC12，0．2
mmol·L～dNTP，0．3 tzmol·L’。随机引物，0．5 U DNA聚合酶 (Tiangen)，50 ng总 DNA。扩增
程序为94℃ 30 S；94℃ 30 S，40℃ 2 min，72℃ 3 min，45个循环；72℃ 7 min。
ISSR反应体积为 20 L，内含 1×PCR反应缓冲液 (Promega)，3．0 mmol·L～ MgCI ，0．2
mmol·L～dNTP，0．3／a,mol·L ISSR引物，0．5 U Taq DNA聚合酶 (Tiangen)，50 ng总 DNA。扩增
程序为 94 c 3 min；94 c 30 S，退火温度 (通过温度梯度 PCR筛选出的适宜温度)1 min，72 c 2
min，38个循环；72℃ 7 min。
1．4 扩增产物检测和数据统计分析
用含EB(0．5 tzg·mL )的 1．5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。在紫外透射仪 (UVP 3UV。
Transiluminator)上观察电泳结果，用数码相机记录凝胶图像。
RAPD和ISSR的扩增产物以0、1统计。对清晰的带 (包括强带和清晰可辨的弱带)，在相同迁
移位置上有带记录为 1，无带记录为0，形成二元数据，统计各引物的多态性位点，建立由 “0、1”
组成的原始数据库。
采用 DPS(Data Processing System)软件 (7．05版)，按照 Nei&Li系数 (S =2N ／(N + )
计算各个供试材料之间的相异系数，然后基于tI~DN权配对算术平均法 (unweighted pair group method
using arithmetic average，UPGMA)构建聚类树状图。
2 结果与分析
2．1 山楂遗传多样性的RAPD分析
2．1．1 RAPD多态性在山楂上的表现
通过研究循环次数、反应体系中 Mg¨ 浓度、DNA模板质量、Taq DNA聚合酶的来源和浓度等因
素对山楂属植物 RAPD效果的影响，建立并优化了山楂属植物 RAPD分析体系。部分引物的扩增结果
见图 1
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8期 代红 艳等 馇 (C ra￡。egW pin naf班如 B ge ． ) 遗传多样性 的 R A P D 和 IS S R 标记 分堑 !!!．!
R A P D
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
～l5
垃 8
1S S R
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
图 1 部分 引物 的 山楂 R A P D 和 IS S R 扩增
M ． 1130 bp ladder； 1 ～ 12 ： 不 同的 山楂资源
F ig． 1 R A P D and IS S R am plification products obtained from haw thorn
M ： 100 bo D N A ladder； 1 一 12 ： I)iferen thaw thorn accessions．
根据谱带的多少 、 多态性 、 清晰性 ， 从 14 6 个 R A P D 引物 中筛选 出 12 个适 宜 于 山楂遗传分析 的
引物 (表 1 )。
12 个 R A P D 引物在 35 份 山楂野生 资源 和栽培 品种上 共扩增 出 1 10 条 250 ～ 2 100 bp 的清晰谱带 ，
其 中 89 条显 示 多态 性 。 平 均 每个引 物扩增 出 7 ． 4 条 多态性谱带 ， 多 态性谱带 的平 均 比例 为 79 ． 4 ％
(表 1 )。
表 1 R A P D 引物 在 35 份 山楂资源 上 的扩 增结 果
T able 1 A m plifications w ith R A P D prim ers in the 35 accessions ofc．pin natifda
引物
P rim er
序列 总谱带数
S eauence N um ber ofscored bands
多态性谱带数
N um ber ofnol、
多态性／％
P olym orphis
M 5
A 56
M 7
A 20
A 28
^ 53
A 70
A 76
A 88
A 9 l
A 95
A 96
总计 T 0tal
平 均 A vera~e
G G T G A T G T C C
T C G G C C T G C T
G G G T T G C C cT
A G C A C T G T C A
G G G A T C G T G T
G A T A G C C G A C
T G C A G C A C C G
C C A C A G C A G T
G A G C C C T C C A
G T G C C T A A C C
T G C C C G T C G T
C ’rC T C C G C C A
7
1
7
2
9
5
6
6
7
9
O
O
9 ． 2
63 ． 6
85 ． 7
81 ． 8
57 ． 1
9 1 ． 7
77 ． 8
80． 0
83 ． 3
00
85 ． 7
55 ． 6
90． 0
79 ． 4
^ ，
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1120 园 艺 学 报
不同的引物在35份山楂资源中扩增出的多态性谱带数和多态性谱带的比例均不相同，其中引物
A88扩增出的总谱带数和多态性谱带的比例均为最高，总谱带数达 16，多态性 100％ (表 1)。
不同的山楂资源具有的谱带数差异较大，但多态性谱带的比例差异不大 (表 2)。
表2 供试山楂资源名称及 RAPD和 ISSR谱带的多态性
Table 2 Name of the C p 舢吲 妇 accessions and polymorphism of RAPD and ISSR bands
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8期 代红艳等：山楂 (Crataegus pinnatifda Bge．)遗传多样性的RAPD和 ISSR标记分析
2．1．2 山楂种质资源遗传 多样性的 RAPD分析
35份山楂资源的Nei&Li相异系数介于0～0．63之间。大果山楂 (C．pinnatifda Bge．var．major
N_E．Br．)栽培品种之间的相异系数相对较小，其中辽红、甜水和隆化粉肉等 3个品种在 110条
RAPD多态性谱带上完全一致，它们之间的相异系数为0。而大果山楂与山楂野生资源的相异系数较大。
基于35份山楂资源之间相异系数的矩阵，利用 UPGMA进行了聚类分析。从聚类结果 (图 2)
可以看出，35份山楂资源的距离系数在0～0．62之间。以距离系数0．35为标准，供试的35份山楂资
源可分为两大类：第一类包括新宾软籽、开原软籽、垂枝山里红、大山里红和粉山里红等5个野生资
源；第二类包括供试的3O个大果山楂栽培品种。以距离系数 0．22为标准，3O个栽培品种又可以分
为6个亚类，第一亚类包括秋金星、大金星、秋红、秋丰等4个品种；第二亚类包括 22个品种，分
别是：徐州大货、马刚红、溪红、涧沟 2号、通辽红、集安紫肉、滦红、古红、叶赫山楂、土谷 1
号、黄宝峪 1号、豫北红、菏泽大山楂 、磨盘、聂家峪 1号、聂家峪2号、辽红、甜水、西丰红、隆
化粉肉、益都敞口、吉林大旺；在第三亚类至第六亚类中，每个亚类只包含 1个品种，依次是：山东
红面山楂、紫珍珠、雾灵红、子母红。以辽宁山楂 (C．sanguinea Pal1．)作为外群，验证 RAPD结果
可靠性，聚类图中辽宁山楂位于系统树末端，明显与山楂 (C．pinnatifda Bge．)各类型不同，亲缘
关系远。聚类结果表明，新宾软籽、开原软籽、垂枝山里红、大山里红和粉山里红这 5个野生类型与
栽培品种间的亲缘关系较远。
等
0
rJ
心
囊
羹
距离系数 Distance coeficient
图2 基于RAPD标记构建的山楂聚类树状图
材料代号同表 2。
Fig．2 UPGMA dendrograms of the species C pinnatifda using RAPD markers
Materials used are listed in Table 2．
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ll22 园 艺 学 报 35卷
2．2 山楂遗传多样性的ISSR分析
2．2．1 ISSR多态性在山楂上的表现
通过研究退火温度、循环次数、反应体系中 M 浓度、DNA模板质量、Taq酶的来源和浓度等
对山楂属植物 ISSR效果的影响，建立并优化了山楂属植物 RAPD分析体系 (代红艳 等，2007)，部
分引物的扩增结果见图1。
根据谱带的多少、多态性、清晰性，从 36个 ISSR引物中筛选出13个适宜于山楂 (C．pinnatifi—
da Bge．)遗传分析的引物 (表3)。
13个ISSR引物在35份山楂资源中共扩增出110条340～2 100 bp的清晰谱带，其中94条显示多
态性。平均每个引物扩增出7．2条多态性谱带，多态性谱带的平均比例为86．4％ (表3)。不同的引
物在山楂资源中扩增出的多态性谱带数和多态性谱带的比例均不相同，其中引物 UBC835扩增出的总
谱带数和多态性谱带均为最高，总谱带数达 14，多态性谱带数为 13。不同的山楂资源具有的谱带数
差异较大，但多态性谱带的比例差异不大 (表2)。
表3 ISSR引物在 35份山楂资源上的扩增结果
Table 3 Amplifcations with ISSR primers in the 35 accessions of C．pinnatifda
引物
Pfimet
序列
bequence
温度／℃ 优化的退火温度／℃ 总谱带数 多态性谱带数 多态性／％
O 厦
．
ptimum anneali“g Number of Number 0f 比
1。mp。rat“re temperature sc0red bands p0lymorphic bands P0Jymorph。。m
UBC810
UBC811
UBC824
UBC834
UBC835
UBC840
UBC841
UBC853
UBC868
SAU02
st-06
st-o7
st-o8
总计Total
平均 Average
l1
3
12
10
8
9
l10
l1
8
6
5
94
2．2．2 山楂种质资源遗传多样性的 ISSR分析
35份山楂资源的 Nei&Li相异系数介于0～0．62之间。大果山楂栽培品种之间的相异系数相对
较小，而野生资源与栽培品种的相异系数均较大，这与RAPD分析的结果一致。聂家峪 1号与辽红在
所有谱带上完全一致，它们之间的相异系数为0。
基于 ISSR分析结果，利用 UPGMA对35份山楂资源进行了聚类分析，结果 (图3)表明，35份
山楂资源的距离系数在0～0．64之间，以距离系数0．36为标准，供试的35份山楂野生资源和栽培品
种可分为3大类：第一类包括新宾软籽、开原软籽；第二类包括所有供试的 30个栽培品种和野生资
源大山里红；第三类包括垂枝山里红和粉山里红。以辽宁山楂 (C．sanguinea Pal1．)作为外群，验证
ISSR结果可靠性，从聚类结果 (图3)可以看出，辽宁山楂位于系统树末端，明显与山楂各类型不
同，亲缘关系较远。两个软籽山楂之间的亲缘关系很近；秋金星、大金星和秋红之间的亲缘关系较
近。
9 9 9 0 7 0 0 6 4
骼 ∞ ∞ ∞ 骼 如 ∞ ∞ ∞
8 7 5 5 3 8 4 ● 3
s{ 弱 弱 如 ∞
如 s{ s{ 铝
T C T C T G _ C G ．一 ．J ％ l一 _一 _一 亿 队
队 队亿 队 队 州吣
( ( ( ( ( ( ( ( ( (
H B B
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8期 代红艳等：山楂 (Crataegu~pinnatifda Bge．)遗传多样性的RAPD和 ISSR标记分析
名
0
rJ
心
婆
0．OO 0．13 0．26 0．38 0．5l 0 64
距离系数 Distance coeficient
图 3 基于 ISSR标 记构建的 山楂聚类树状 图
材料代号同表2。
Fig．3 UPGMA dendrograms ofthe speciesC pinnatifda usingISSRmarkers
Materials used are listed in Table 2．
3 讨论
3．1 山楂的遗传多样性
遗传多样性是珍贵的自然资源，是人类赖以生存的基础。一个物种的进化潜力和抵御逆境的能力
取决于遗传变异的大小。遗传多样性越丰富，对环境变化的适应能力越强，其自然分布范围越广。全
世界的山楂属植物包括 140～200个种，其中起源于中国的山楂属植物有 18个种和6个变种。山楂
(c．pinnatifda Bge．)是中国最重要的山楂属植物，包含3个变种，分别是：大果山楂 (c．pinnatif—
da Bge．var．major N．E．Br．)、无毛山楂 (c．pinnatifida Bge．var．psilosa Schneid．)和热河山楂 (c．
pinnatifda Bge．var．geholensis Schneid．)(赵焕谆和丰宝田，1996)。山楂有着丰富的变异类型，其中
大果山楂经过长期培育和选择，形成了丰富的品种资源。本研究利用 RAPD和 ISSR标记对国家果树
种质沈阳山楂圃保存的35份山楂资源进行遗传多样性的研究，用 12个 RAPD引物和 13个 ISSR引物
分别检测到89个和94个多态性位点，表明不同山楂种质资源之间的距离系数在0～0．64(ISSR)或
0～0．62(RAPD)之间，这说明山楂存在较高的遗传多样性。
3．2 RAPD标记与ISSR标记在山楂上的应用比较
不同的分子标记在同一种植物上得出的分类结果往往不同 (Elis et a1．，1998；Degani et a1．，
2001；Fem6ndez et a1．，2002；Kuras et a1．，2004；Queen et a1．，2004)。本研究结果表明，基于 RAPD
标记构建的山楂聚类树状图 (图2)与基于 ISSR标记构建的山楂聚类树状图 (图3)有一定的差异。
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在 RAPD分析结果中，山楂的几个野生资源首先聚为一类，然后与大果山楂栽培品种等再聚在一起；
而在 ISSR分析结果中，山楂的几个野生资源分散在系统树中。因此，与 ISSR标记相比，RAPD标记
可能更适合于山楂的遗传变异分析。
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