全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (10) : 1533 - 1538
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 05 - 29; 修回日期 : 2008 - 09 - 12
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30370995)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jianli@ scau1edu1cn)
一种改良的扩增 cDNA 5′末端的方法
夏　瑞 1, 3 , 陆旺金 2 , 李建国 13
(1 华南农业大学中国荔枝研究中心 , 广州 510642; 2 广东省果蔬保鲜重点实验室 , 广州 510642; 3 广东省农业科学院
果树研究所 , 广州 510640)
摘 　要 : 介绍一种改良的扩增基因 5′cDNA序列的方法 (改良 TdT加尾扩增法 )。以龙眼为材料 , 采用
TdT (末端脱氧核苷酸转移酶 ) 加尾、锚定 PCR、巢式 PCR、降落 PCR等多种策略。通过与常规方法 (用
TaKaRa试剂盒 ) 对比试验 , 发现该方法原理简单 , 操作性强 ; 扩增特异性高 , 结果真实可靠 ; 同时还具有
快速低廉的特点 , 适合在一般实验室中推广使用。
关键词 : TdT; RACE; 降落 PCR; D l2Exp1
中图分类号 : Q 94312　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1021533206
A M od if ied M ethod of Am plify ing the 5′2end cD NA Sequence
X IA Rui1, 3 , LU W ang2jin2 , and L I J ian2guo13
(1 China L itchi Research Cen ter, Sou th China A gricultural U niversity, Guangzhou 510642, China; 2 Guangdong Provincial Key
Labora tory of Post2harvest Science of Fruits and V egetables, Guangzhou 510642, Ch ina; 3 Institu te of Fru it R esearch, Guangdong
A cadem y of A gricultural Sciences, Guangzhou 510640, Ch ina)
Abstract: In order to obtain the full2length sequence of genesmore efficiently, a modified method of am2
p lifying the 5′cDNA sequence, named as modified TDT tailing amp lified method, was designed. Many strate2
gies were used in thismethod including TdT tailing, anchored PCR, nested PCR, touchdown PCR. Compared
with a regular method using a kit (5′2Full RACE Core Set, TaKaRa) , the modified method had many advan2
tages, such as simp le p rincip le, easy operability, high amp lified specificity, and reliable results. Moreover, it
costs less money and time. Therefore, it is worth popularizing in ordinary laboratories.
Key words: TdT; RACE; touchdown PCR; D l2Exp1
分离和克隆基因是研究基因结构、功能以及表达的基础。利用生物信息学技术推测的编码基因 ,
或通过酵母双杂交 ( yeast two2hybrid)、抑制性消减杂交 ( SSH)、基因芯片 ( genchip ) 技术和噬菌体
表面展示 (phagedisp lay) 等分子生物学技术筛选得到的序列一般都是部分序列 , 要想进一步研究这
些新基因的生物学功能和医学意义 , 必须首先获得基因的全长序列 (韩海勃和曹建平 , 2005)。虽然
很多用于扩增基因全长的方法已经建立 , 如反向 PCR、连接介导 PCR等技术 , 但是 , 这些方法耗时
长、费用高 , 且常出现 PCR扩增效率低、特异性差等问题。因而利用这些方法不容易得到完整的全
长基因 , 尤其是基因的 5′末端 (唐慧 等 , 2001)。而 Frohman在 1985年首次报道的 cDNA末端快速
扩增技术 ( rap id amp lification of cDNA ends, RACE) 解决了这些问题。 cDNA末端快速扩增 (RACE)
技术基于 PCR技术 , 以已知的部分 cDNA序列来获得完整 cDNA序列 (钟涛和吴瑞英 , 2002) , 是一
种从低丰度转录本中快速扩增 cDNA 3′和 5′末端序列的简单而有效的方法。
本文将详细报道一种改良的扩增 cDNA 5′末端的方法 , 简称为改良 TdT加尾扩增法。本方法中采
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用 TdT (末端脱氧核苷酸转移酶 ) 加尾、锚定 PCR、巢式 PCR、降落 PCR (Don et al. , 1991; 王天
云 等 , 2003; W u et al. , 2005) 等策略 , 从锚定引物与巢式引物的设计到 PCR扩增体系和方法的优
化都非常新颖。经试验证明 , 该方法是一种实用且高效的扩增 cDNA 5′末端序列的方法。
1　材料与方法
111　材料
材料为 ‘石硖 ’龙眼 (D im ocarpus longan Lour. ‘Shijia’) 花后 6周的果实。
大肠杆菌为 DH5α, 质粒为 pMD182T vector, 均为宝生物工程 (大连 ) 有限公司产品。
5′2Full RACE Core Set试剂盒、 Taq DNA聚合酶、回收试剂盒、反转录酶、 cDNA合成试剂盒、
末端脱氧核苷酸转移酶 ( TdT)、反应缓冲液和其他分子生物学试剂均购自广州瑞真生物有限公司。
引物由上海英骏生物技术有限公司 (广州 ) 合成。
112　方法
11211　改良 TdT加尾扩增法 　
图 1　改良 TdT加尾扩增法原理图
F ig. 1　The pr inc iple of the m od if ied TdT ta iling am plif ied m ethod
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　10期 夏 　瑞等 : 一种改良的扩增 cDNA 5′末端的方法 　
引物设计 : 根据 D l2Exp1 ( Expansin Gene1 of D im ocarpus longan) 已知基因片段 (谢会 , 2005) , 利
用生物软件 Primer Prem ier 510设计 3个引物、1个反转录引物 (RTP: Reverse Transcrip t Primer) 和两个
特异的下游引物 (ASP: Anti2Sense Primer)。其序列分别为 : Exp12RTP: 5′2CACGCTCACCTTCAC23′;
Exp121st2ASP: 5′2GCGATAACTGACTGGGACAA23′; Exp122nd2ASP: 5′2AGTGAGTGCGAGGAGGGTTG23′。
据实验原理 (图 1) , 还需 5′锚定引物 ( 5′2AP: 5′2Adap tor Primer) 和 5′巢式引物 (5′2NP: 5′2
Nested Primer) 各 1个。其序列分别为 : 5′2AP: AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGGGGGGG
和 5′2NP: AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT。
cDNA第一链的合成与纯化 : 以龙眼果皮总 RNA [ RNA提取参考陆旺金和蒋跃明 ( 2003) 的方
法 ] 为模板 , 用反转录引物 Exp12RTP合成 cDNA第一链。具体参照 PrimeScrip tTM Reverse Transcrip tase
的使用说明书。用 TaKaRa DNA片段纯化试剂盒 ( TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver210) 进行
cDNA回收纯化。
加尾 [ poly ( dC) n ]反应 : 纯化后的 25μL cDNA与 5 ×TdT Buffer (10μL )、011% BSA (5μL )、
10 mmol·L - 1 dCTP (215μL)、TdT (15 U) 和 ddH2 O ( up to 50μL) 冰上混合均匀 , 置于恒温槽中
37 ℃反应 60 m in。然后按照 TdT使用说明书 , 采用乙醇沉淀法纯化加尾后的 cDNA , 真空抽干后溶于
20μL的无菌水中。
PCR扩增 : 采用巢式 PCR策略 , 需经两轮 PCR扩增。第一轮以加尾后的 cDNA为模板 , 以 5′2AP
和 Exp121 st2ASP为上下游引物。采用降落 PCR程序 : 94 ℃预变性 3 m in; 94 ℃ 30 s, 66～46 ℃ 30 s,
72 ℃ 1 m in (从 66 ℃到 46 ℃每次降 2 ℃, 其中 46 ℃前 , 每个温度两个循环 , 最后 46 ℃ 15个循
环 ) , 共 35个循环 ; 72 ℃ 8 m in, 最后 4 ℃保存。第二轮以第一轮 PCR扩增所得的 PCR产物为模板
(可适当稀释 , 一般为 10～100倍 ) , 以 5′2NP和 Exp122nd2ASP为上下游引物。PCR程序为 : 94 ℃预
变性 3 m in; 94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 m in, 35个循环 ; 72 ℃ 8 m in, 最后 4 ℃保存。PCR仪为
MJ RESEARCH PTC2200微循环器。
PCR产物的检测、克隆与测序 : 1%的琼脂糖电泳检测 PCR结果 ; 利用 TaKaRa的 Agarose Gel
DNA Purification Kit Ver 210试剂盒回收电泳得到的片段 , 回收片段与 pMD 182T Vector载体连接 , 转
化大肠杆菌 DH5α, 克隆过程参照 TaKaRa pMD182T Vector试剂盒说明书。经质粒提取、酶切鉴定后 ,
获得阳性克隆 , 并由上海英骏生物技术有限公司 (广州 ) 测序。测序后得到的片段序列登录 NCB I进
行 B last验证和检索 , GenBank进行同源性比对。
11212　TaKaRa法 　
TaKaRa法中共需 5个特异引物 , 反转录引物 5′端需磷酸化。其序列如下 :
Exp12PRT: 5′2 ( P) ACTGGGACAATACC23′; Exp12S1: 5′2GTCACGGCAACCAACTTCTG23′; Exp12
A1: 5′2GTGTTCACTCCATACCCTTG23′; Exp12S2: 5′2AACTTCGCTCAACCTTCAGA23′; Exp12A2: 5′2
CAAGCACCACCCATTGTTCC23′。
用 Exp12PRT反转录后进行 PCR扩增。采用巢式 PCR过程 , 第一轮 PCR扩增以 Exp12S1和 Exp12
A1为引物 , PCR程序为 : 94 ℃预变性 3 m in; 94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 m in, 35个循环 ; 72 ℃
8 m in, 最后 4℃保存。以第一轮 PCR液 (适当稀释 ) 为模板 , Exp12S2和 Exp12A2为引物进第二轮
PCR扩增 , 扩增程序为 : 94 ℃预变性 3 m in; 94 ℃ 30 s, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 m in, 35个循环 ; 72 ℃
8 m in, 最后 4 ℃保存。后续的片段检测和克隆测序过程同 TdT加尾扩增法。
2　结果与分析
211　PCR扩增检测结果
改良 TdT加尾扩增法中以加了多聚 dC尾巴的 cDNA为模板 , 经过两轮 PCR扩增得到 D l2Exp1基
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因的 5′端序列。用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 , 在目标位置 ( 500 bp左右 ) 出现了单一的条带 (图
2, A)。
同样 , 用 TaKaRa法进行 PCR扩增和琼脂糖电泳检测 , 在 350 bp位置出现了特异条带 (图 2, B)。
图 2　改良 TdT加尾扩增法 ( A) 和 TaKaRa法 ( B) PCR产物琼脂糖电泳图
1. 第一轮 PCR产物 ; 2. 第二轮 PCR产物 ; M. Marker, 箭头所指条带即为目的条带。
F ig. 2　The PCR productspis agarose gel electrophoresis of the m od if ied TdT ta iling am plif ied ( A) and TaKaRa ( B) m ethods
M. DNA marker; 1 and 2 are the PCR p roducts of the first and second PCR cycles respectively. The arrows are the aimed bands.
212　5′末端序列
改良 TdT加尾扩增法中得到了长度为 508 bp的片段 (图 3) , 其中未知的 5′端 cDNA序列长 273
bp (图中加框部分 ) ; TaKaRa方法中得到了长度为 345 bp的片段 (图 4) , 其中未知序列也为 273 bp
(图中加框部分 )。
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　10期 夏 　瑞等 : 一种改良的扩增 cDNA 5′末端的方法 　
213　两序列的比对分析结果
用 ClustalW ( http: / /www1ebi1ac1uk /Tools/ clustalw / index1htm l) 对比两种方法扩增得到的序列
结果 (两片段中未知的 5′cDNA序列 ) , 发现两个序列的长度和序列信息完全一样 (图 5)。这充分说
明经过改良的 TdT加尾扩增法设计合理 , 扩增结果真实可靠。
图 5　两未知序列比对结果
TdT为改良 TdT加尾扩增法。
F ig. 5　The a lignm en t result of the two unknown sequences
TdT stands for the modified TdT tailing amp lified method.
3　讨论
目前 , 5′2RACE技术应用已经十分普遍 , 包括基于 “模板跳转反转录 ”的 SMART RACE技术
( switching mechanism at 5′end of RNA transcrip t) (Chenick et al. , 1995) , 基于 5′脱帽和 RNA酶连接
技术的 RLM 2RACE技术 (RNA ligase mediated RACE) (L iu & Gorovsky, 1993) , 利用 RNA连接酶为
cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的 SILC RACE技术 ( single strand ligation to single2stranded cDNA )
( Edwards et al. , 1991) , 以及以内部环化的 cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化 RACE技术
( self2ligation RACE or circular RACE) (Maruyama et al. , 1995) 和通过末端脱氧核苷酸转移酶 ( TdT)
加尾后引入锚定引物的锚定 RACE技术 ( anchored RACE)。其中本试验中用到的 Takara法属于自连
接 (环化 ) RACE法 , 改良的 TdT加尾扩增法则属于锚定 RACE法。这些方法各有利弊 , SMART
RACE技术虽然操作简便 , 成功率高 , 但其价格昂贵 (一次试验成本将近千元 ) ; RLM 2RACE技术操
作复杂 , 且都是针对 mRNA 分子 , 由于 mRNA 分子被降解的风险极大而导致成功率不高 ; SL ICR
RACE中由于 RNA连接酶优先连接短片段 cDNA, 影响扩增效果 , 且 RNA连接酶连接效率低 (韩海
勃和曹建平 , 2005)。后两种方法虽然成功率比较低 , 但是由于其成本低 , 实验条件要求低 , 能满足
克隆一般基因 5′序列的要求 , 从而得到许多实验室的青睐。
本试验通过对 TdT加尾扩增法的优化改良 , 成功率和稳定性都得到较大的提高。改良的 TdT末
端加尾扩增法综合了多项 PCR扩增方法如锚定 PCR、巢式 PCR、降落 PCR等 , 原理简单易懂 , 操作
性强。对比其它常规 5′2RACE的方法 , 本方法有以下几点优势 :
1. 引物设计方案合理。首先 , 本法中用 1个 15 bp左右的特异反转录引物代替通用反转录引物
O lig ( dT) n, 既可以对模板 cDNA进行初步筛选 , 又可以使合成的 cDNA更靠近目的基因的 5′端 , 片
段较短。这样 , 只要使用一般的反转录酶 (如本试验中选用的 TaKaRa出品的 PrimeScrip tTM Reverse
Transcrip tase) 就可以达到实验要求 ; 但是 , 使用 O ligo ( dT) n, 则须反转录整个目的基因的全长 , 这
样 , 对于一些序列较长的基因 , 一般的反转录酶很难达到要求。其次 , 两个上游引物采取巢式策略取
代一般的 poly ( dG) n或 poly ( dC) n (唐慧 等 , 2001) , 可以更好控制第二轮 PCR的退火温度 , 保证
扩增的特异性。另外 , poly ( dG) n的 Tm值往往比较高 , 导致上下游引物间退火温度相差太大 , 往往
会降低扩增的效率 , 导致非特异条带的出现。相比 TaKaRa法 , 本法扩增 1个基因只需设计 3个特异
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引物 , 而且反转录引物不需要磷酸化 , 从而大大节约实验成本。
2. PCR扩增方法优化。采用巢式 PCR, 提高了微量模板 cDNA的扩增效率 , 经过两次特异 PCR
筛选 , 增加了扩增产物的特异性 , 扩增结果基本都是单一的条带。另外 , 在本方法的巢式 PCR过程
中 , 第一轮 PCR采用改良的降落 PCR, 可以很好解决第一轮 PCR中上下游引物间退火温度差别太大
的问题。本方法中一般采用的退火温度范围为 66～46 ℃, 由于高温下引物的错配率低 , 使用降落
PCR可以通过高温阶段的循环 , 不仅减少了非特异扩增的产生 , 而且使目标模板 cDNA 得到富集
(Don et al. , 1991) , 从而提高了第二轮 PCR扩增出目的片段的概率。
3. 快速且低廉。利用该方法花费小 , 一次试验只须几十元 , 同时所需时间少 , 所有步骤可以在
1 d内完成。而常用的 5′2RACE试剂盒动辄几千 , 且不能很好保证成功率 , 同时时间也比较长 ,
TaKaRa法则需 2 d。
总之 , 改良后的 TdT加尾扩增法不但能满足克隆一般基因 5′末端序列的要求 , 而且由于降落
PCR和巢式 PCR对转录本的有效放大作用 , 还能用于克隆生物体中低丰度的基因。因此 , 该方法实
用性强、应用面广、成本低、耗时少 , 具有广阔的应用前景 , 值得在普通实验室推广使用。
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