全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 333 - 338
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 06 - 12; 修回日期 : 2006 - 12 - 28
基金项目 : 山东农业大学博士基金资助项目 (23226)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hrshu@ sdau1edu1cn)
冬枣两个乙烯受体编码基因的克隆及序列分析
魏绍冲 , 彭福田 , 束怀瑞 3 , 孙旭东
(山东省作物生物学重点实验室 , 山东农业大学园艺科学与工程学院 , 山东泰安 271018)
摘 　要 : 根据植物乙烯受体 ETR1家族氨基酸和核苷酸的保守区序列设计简并引物 , 通过 RT2PCR从
半红期冬枣果实中分离了两个 1 058 bp的乙烯受体 cDNA片段。在分析已知序列基础上 , 分别通过 3′RACE
及对两个基因上游 5′端编码区的扩增 , 得到了两个包含完整开放阅读框 (ORF) 以及 3′端非编码区 ( 3′
UTR) 的乙烯受体编码基因 , 即 Z jETR1和 Z jERS1。它们分别编码 738个和 632个氨基酸。这两个编码基因
的氨基酸与其它植物乙烯受体氨基酸高度同源 , 分别属于 ETR1亚类和 ERS1亚类乙烯受体。
关键词 : 枣 ; 乙烯受体 ; 果实成熟 ; 序列分析 ; 基因克隆
中图分类号 : S 66511　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220333206
C lon ing and Sequence Ana lysis of Two Encod ing Ethylene Receptor cD NA s
in ‘D ongzao’Jujube
W E I Shao2chong, PENG Fu2tian, SHU Huai2rui3 , and SUN Xu2dong
( Key Laboratory of C rop B iology of Shandong Province, College of Horticulture Science and Engineering, Shandong A gricultural
U niversity, Ta ipian, Shandong 271018, China)
Abstract: Two cDNA fragments with 1 058 bp were amp lified from Chinese jujube ( Z izyphus ju juba
‘Dongzao’) fruit at a half2red mature stage through RT2PCR using degenerated p rimers, and then both 5′en2
coding region and 3′2end with a UTR ( untranslated region) of these two cDNA fragment sequences were ob2
tained. The obtained ethylene recep tor genes with two open reading frames, referred to Z jETR1 and Z jERS1,
encoded 738 and 632 am ino acids, respectively. Sequence analysis indicated that Z jETR1 and Z jERS1 shared
a high sim ilarity with other ethylene recep tors at the polypep tide level, and could be divided into the ETR1
and ERS1 sub2group s.
Key words: Jujube; Ethylene recep tor; Fruit ripening; Sequence analysis; Gene cloning
自番茄 NR 基因被分离并研究了其在果实中表达模式后 (W ilkinson et al. , 1995 ) , 人们对桃
(Bassett et al. , 2002; Rasori et al. , 2002)、苹果 (Cin et al. , 2005)、柑橘 ( Katz et al. , 2004) 等果
实中乙烯受体编码基因进行了克隆及表达分析。通过基因工程的手段调控番茄中乙烯受体基因的表
达 , 可以改变转基因植株对乙烯的敏感性 (Ciardi et al. , 2000; Tieman et al. , 2000)。本研究中运用
RT2PCR技术成功克隆了冬枣乙烯受体基因家族中包括编码区全序列的 Z jETR1和 Z jERS1两个成员 ,
并对其进行了序列分析 , 可为进一步揭示乙烯作用与冬枣果实成熟、衰老的关系打下基础。
1　材料与方法
试验以半红期 ‘冬枣 ’ ( Z izyphus ju juba ‘Dongzao’) 果实为材料 , 切成薄片用液氮速冻后置于
- 70℃冰箱中备用。DNA回收纯化试剂盒和 pMD218T载体为大连宝生物公司产品。试验所用的感受
态细胞为大肠杆菌 ( E. coli) DH5α菌株产品。DNA序列测定委托上海英骏生物技术公司完成。
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根据 GenBank中登录的拟南芥、番茄、桃等植物 ETR1类乙烯受体氨基酸和核苷酸保守区序列 ,
设计简并引物 , 上游引物 P1为 : 5′CTT ( G/A ) T ( G/T) CA ( G/A) TTTGGTGCTT 3′, 下游引物 P2
为 : 5′TCTTC ( T/A) A ( G/A ) CCT ( T/G/C /A) GAAAGATC 3′。根据测序结果分析 , 设计 Z jETR1
和 Z jERS1的 3′RACE巢式上游共同引物 P321: 5′GAAAC (A /T) GG (A /T) (A /C) G (A /G) CAT2
GT (C /T) AG (A /G) ATG 3′, 以及 Z jETR1和 Z jERS1第 2次 PCR 上游引物 P322: 5′GCTGAG2
CAACGCCTGAT 3′和 P323: 5′CATTGCATTGTCTTCACTTCTTTT 3′。3′RACE下游通用引物 B26序列为 :
5′GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT 3′。扩增 5′端编码区上游引物为 P521: 5′ATGGAG
( G/T) C (A /T/C) TGCAA (C /T) TGTATTG 3′( Z jETR1) 和 P522: 5′ATGGA (A /G) TC (A /T/
C) TGTGATTG (C /T) AT 3′( Z jERS1)。下游引物根据测序结果设计 , 分别为 P4: 5′CTCCGCAGC2
CTTGTTTTT 3′( Z jETR1) , P6: 5′ACATGCCTTCCAGTTTCTT 3′( Z jERS1)。
总 RNA的提取参照 Salzman等 ( 1999) 的方法进行 , 按照 MB I公司说明书合成 cDNA第 1链。
PCR反应体系 : 215 mmol/L dNTP 8μL, 25 mmol/L MgCl2 5μL, 10 ×LA PCR缓冲液 5μL, 上下游引
物各 2μL (约 10 pmol/L) , 逆转录产物 1μL, LA Taq酶 015μL (5 U /μL) , 用 dd H2 O补充至总体积
50μL。保守区片段 PCR反应条件为 94℃预变性 5 m in后 , 按以下程序进行 PCR扩增 : 94℃变性 60
s, 50℃退火 60 s, 72℃延伸 90 s, 共进行 30个循环 , 最后 72℃延伸 10 m in结束反应。3′末端扩增 :
采用巢式 PCR方式。首先用 P321和通用引物 B26进行 , 反应条件为 94℃预变性 5 m in, 然后 94℃变
性 60 s, 54℃退火 60 s, 72℃延伸 90 s, 共 20个循环。将 PCR产物稀释 40倍后 , 取 1μL作为模板用
P322或 P323与 B26进行第 2次 PCR扩增 , 反应条件与第一次相同 , 进行 25个循环。5′端编码区扩
增 : 根据测序结果设计下游特异引物 P4和 P6, 分别与引物 P521或 P522进行 PCR扩增。反应条件为
94℃预变性 5 m in, 然后 94℃变性 45 s, 52℃退火 45 s, 72℃延伸 60 s, 共 30个循环。
测序结果用 ContigExp ress进行序列拼接 , 而序列分析则采用 DNASTAR和 DNAMAN软件进行。
2　结果与分析
211　Z jETR1和 Z jERS1保守区基因片段的克隆
以果实 cDNA为模板采用引物 P1和 P2扩增
得到的 PCR产物长度约为 111 kb (图 1)。将其
与 pMD218T载体连接 , 转化 DH5α感受态细胞后
获得重组质粒用于进一步的序列测定。根据载体
两端双向的 DNA测序结果 , 得到了两个 1 058 bp
大小、均编码 352个氨基酸的 cDNA片段。将两
个序列的核苷酸和氨基酸序列分别在 NCB I服务
器的 B last ( blastn和 blastp) 软件中进行检索 , 初
步推断它们为冬枣乙烯受体成员的保守区序列。
212　ZjETR1编码基因的克隆
根据 Z jETR1的保守区序列设计特异引物 P32
2, 以 P321和 B26的 PCR产物作为模板 , PCR产
物获得一个约 1 100 bp大小的预期片段。DNA序
列测定表明该 3′RACE产物大小为 1 106 bp。采
用简并引物 P521和特异引物 P4扩增得到了一个
384 bp大小的 cDNA片段 , 序列测定结果表明其
为 Z jETR1的 5′端上游编码区序列 (图 2)。
图 1　Z jETR1和 ZjERS1保守区的 RT - PCR扩增结果
F ig. 1　The RT - PCR results of con served reg ion
of Z jETR1 and ZjERS1
1. DL 2000 marker; 2. cDNA fragment of ZjETR1 and ZjERS1.
图 2　ZjETR1与 Z jERS1 5′端编码区片段和 3′RACE结果
F ig. 2　The 5′encod ing cD NA fragm en ts and 3′RACE
products of Z jETR1 and ZjERS1
M. DL 2000; 1. 5′encoding cDNA fragment of Z jETR1;
2. 3′RACE p roduct of Z jETR1; 3. 5′encoding cDNA
fragment of Z jERS1; 4. 3′RACE p roduct of Z jERS1.
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　2期 魏绍冲等 : 冬枣两个乙烯受体编码基因的克隆及序列分析 　
　　用 ContigExp ress软件将以上 3个序列进行拼接 , Z jETR1为 2 290 bp, 包含一个 2 214 bp的 ORF
(开放阅读框 ) 及 73 bp的 3′2UTR (3′端非编码区序列 ) , 该基因编码 738个氨基酸 (图 3) , 推测的
分子量为 8215 kD, 等电点 ( P I) 为 7121。
图 3　ZjETR1的核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列
划线为 N端 3个跨膜的结构域位置。
F ig. 3　The nudeotide and deduced am ino ac id sequences of ZjETR1
Three N2term inal hydyophobic transmemberances are underlined.
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213　ZjERS1编码基因的克隆
根据 Z jERS1已知序列设计特异引物 P323, 与 B26通过巢式 PCR获得一个 1 054 bp大小的基因片
段 , 测序结果分析表明该片段为 Z jERS1的 3′端编码区序列和 3′UTR。采用简并引物 P522和特异引物
P6扩增得到了 437 bp的 Z jERS1 5′端编码区序列 (图 2)。
用 ContigExp ress软件将以上 3个序列进行拼接 , Z jERS1为 2 139 bp, 包含一个 1 896 bp的 ORF
及 240 bp的 3′2UTR。该基因编码 632个氨基酸 (图 4) , 推测的分子量为 7015 kD , 等电点为 6168。
图 4　ZjERS1的核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列
划线为 N端 3个跨膜的结构域位置。
F ig. 4　 The nudeotide and deduced am ino ac id sequences of Z jERS1
Three N2term inal hydyophobic transmemberances are underlined.
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　2期 魏绍冲等 : 冬枣两个乙烯受体编码基因的克隆及序列分析 　
214　ZjETR1和 ZjERS1序列分析
序列分析表明 , ZjETR1和 ZjERS1的氨基酸序列 N端均存在 3个跨膜的结构域 (图 3、4) , 符合
ETR1类乙烯受体的特点。
ZjETR1与苹果、柑橘、桃、草莓等植物的 ETR1亚类乙烯受体均具有 80%以上同源性 , 其中与
桃 PpETR1高达 9013% ; 而 ZjERS1则与苹果、桃、草莓等植物已知的 ERS1亚类乙烯受体氨基酸序列
具有 80%左右同源性 , 可以确认它们均为冬枣的乙烯受体。
系统树分析表明 , ZjETR1和植物的 ETR1亚类乙烯受体位于一组 , 而 ZjERS1则位于 ERS1组中
(图 5)。
图 5　一些植物 ETR1类乙烯受体蛋白系统树
F ig. 5　Phylogenetic tree of som e ETR12like plan t ethylene receptors
3　讨论
植物激素的生理效应最终通过其感受和信号转导过程实现。乙烯受体是乙烯信号转导的初始组
分 , 位于细胞的内质网上 , 与 CTR1协同负调控乙烯反应 ( Guo & Ecker, 2004)。
以往乙烯的研究主要集中于跃变型果实中 , 但非跃变型果实同样也能产生乙烯。近年来乙烯信号
转导研究也开始转向草莓和柑橘等非跃变型果实 , 相关研究的深入有助于我们正确认识乙烯在果实成
熟中作用。
乙烯受体在植物中由多基因家族所编码。根据其编码蛋白结构不同 , 可分为 ETR1和 ETR2家族
两大类。ETR1家族又可分为 ETR1亚类和 ERS1亚类 , 它们主要区别在于是否存在反应调节器结构
域。
各乙烯受体在植物中的表达模式具有明显差异。番茄 L eETR1在果实发育进程中组成型表达 , 基
本不受乙烯的诱导 , 而 N R 则在成熟果实中表达明显增加 , 并受乙烯的诱导 (Lashbrook et al. ,
1998)。
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草莓中 3个乙烯受体在不同成熟阶段的果实中的表达模式也明显不同 : 其中两个 ETR1类受体
( FaEtr1和 FaErs1) 表达水平随着果实成熟进程持续增加 , 而 ETR2类受体 ( FaE tr2) 则在白熟期果
实中达最高水平 ( Traninotti et al. , 2005)。
我们采用同源基因克隆策略克隆了两个乙烯受体基因保守区 cDNA 片段 , 在此基础上 , 进一步获
得了 Z jETR1和 Z jERS1的乙烯受体编码基因序列。
通过对两个序列进行分析和同源性比较 , 表明 Z jETR1和 Z jERS1分别为 ETR1亚类和 ERS1亚类
受体。此外 , 我们还从冬枣中成功分离了一个 ETR2类的乙烯受体基因 (待发表 )。我们将重点分析
这几个乙烯受体基因在冬枣果实不同时期的表达特性及其调控规律 , 以便为果实成熟、衰老的控制提
供更为科学的依据。
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