全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2001 , 28 (1) : 12～18
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2000 - 07 - 05 ; 修回日期 : 2000 - 11 - 08
通过农杆菌介导法将哈兹木霉几丁质酶
Th En242 基因导入核桃
汤浩茹1 ,2 　Wallbraun M. 2 　任正隆3 　Reustle G. M. 2 　Krczal G. 2
(1 四川农业大学林学园艺学院 , 雅安 625014 ;　2 德国莱茵兰 —法尔兹植物生物技术中心 , 67435 Neustadt/
W. ;　3 四川农业大学植物遗传育种实验室 , 雅安 625014)
摘 　要 : 通过根癌农杆菌 C58C1 ATHV RifR 介导法 , 利用烟草花叶病毒 35 S 双启动子和苜
蓿花叶病毒引导序列控制下的含抗新霉素磷酸转移酶基因 ( npt Ⅱ) 和哈兹木霉几丁质酶基因
( ThEn242) 的质粒 pBin19ESR 为载体 , 对 3 个核桃体细胞胚系进行遗传转化 , 结果获得 41 个
抗卡那霉素的体细胞胚系。经 PCR 和复式 PCR 检测 , 41 个转化系均含有 npt Ⅱ基因 , 其中 38
个转化系含有 ThEn242 基因。Southern 杂交分析表明 , ThEn242 基因已被整合到核桃体的基因
组中。几丁质酶活性检测结果表明 , 转化的体细胞胚系的几丁质酶活性比对照高几十至几千
倍。遗传转化的体细胞胚系已萌发成苗。
关键词 : 核桃 ; 几丁质酶 ; 转基因 ; 体细胞胚
中图分类号 : S 664. 1 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2001) 0120012207
利用核桃 ( Juglans regia L. ) 品种的抗性防治病虫害是安全而经济的有效途径。用遗
传转化的方法将抗病基因引入核桃是培育抗病新品种经济有效的方法。
目前 , 已有多种抗病虫基因得到了分离与克隆〔1 ,2〕。苏云金芽孢杆菌 Bt 毒素基因和几
丁质酶基因在植物抗病虫基因工程中应用最为广泛。几丁质酶不仅能催化几丁质 (真菌细
胞壁的主要成分) 水解 , 而且能分解肽聚糖 (细菌细胞壁和节肢动物外骨骼的主要成分) 。
通过基因工程技术的方法将不同来源 (植物、微生物) 的几丁质酶基因转入植物后 , 获得
的转基因植株 , 表达几丁质酶活性 , 使植株的抗病、抗虫能力提高〔3 ,4〕。从生防真菌哈兹
木霉 P21 株系 ( Trichoderma harzianum) 分离的几丁质酶具有很高的抗真菌活性〔5〕。Hayes
等〔6〕从该株系中分离和克隆了编码几丁质酶的 ThEn242 基因。Lorito 等〔7〕和 Bolar 等〔8〕分别
将 ThEn242 基因转入了烟草、马铃薯和苹果 , 获得的转基因植株具有较强的抗烟草赤星菌
( Alternaria alternata) 、马铃薯早疫病菌 ( A . solani) 、灰葡萄孢菌 ( Botrytis cinerea) 、立枯丝
核菌 ( Rhizoctonia solani) 和苹果黑星菌 ( Venturia inaequalis) 的能力。我们利用 ThEn242
基因导入核桃 , 以期获得抗性株系 , 并探索该基因在林木抗病育种中的应用。
1 　材料与方法
1. 1 　材料
供试的转化外植体为‘W628’体细胞胚无性系 3 个。该体细胞胚系源于德国优良核
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桃品种‘No. 120’的子叶〔9〕。按文献 〔10〕的方法生产体细胞胚。新形成的次生胚 (1～
3 mm 大小) 用于遗传转化。
1. 2 　质粒与工程菌
哈兹木霉几丁质酶 ThEn242 基因表达
载体为 pBin19ESR 质粒 (图 1) 。通过直接
转化法将此质粒导入超毒力农杆菌 C58 C1
ATHV RifR 菌株中而获得含 ThEn242 基因的
工程菌。工程菌培养在 LB 培养基 (附加
利福平 15 mg/ L 和卡那霉素 50 mg/ L , pH
7. 0) 。
图 1 　含 ThEn242 基因的质粒 pBin19ESR结构图
Fig. 1 　The plasmid pBin19ESR conaining
the ThEn242 gene
1. 3 　遗传转化
取新形成的 1～3 mm 大小的体细胞胚于新鲜的、对数生长期的工程菌液 (DW 培养基
配制 , 含乙酰丁香酮 0. 1 mmol/ L , 菌细胞含量为 2. 0 ×108 个/ mL) 浸没 15 min , 按文献
〔11〕总结的操作步骤进行。设 3 个重复 , 每重复 20 个体细胞胚。
1. 4 　转基因体细胞胚的萌发与植株再生
按文献 〔12〕中Ca (NO3) 2·6H2O 脱水方法进行。
1. 5 　PCR扩增鉴定
参照文献 〔13〕的方法 , 取 20～30 g 体细胞胚或叶片进行液氮研磨提取 DNA。纯化
的 DNA 溶于 1 ×TE溶液中备用。PCR 引物购自德国 MWG2Biotech AG。用于扩增新霉素磷
酸转移酶基因 ( npt Ⅱ) 的引物序列为 : npt Ⅱ25 , 5’2AGG CTA TTC GGC TAT GAC TG23’;
npt Ⅱ23 ; 5’2GTC CAG ATC ATC CTG ATC G23’。用于扩增几丁质酶基因 ThEn242 的引物序
列为 (复式扩增) : NAD25 , 5’2TAG CCC GAC CGT AGT GAT GTT AA23’; NAD23 , 5’2ATC
ACC GAA CCT GCT CTC AGG AA23’; Trendo25 , 5’2TGG AAC GAC GTC GGT AAC AAT G23’;
Trendo23 , 5’2CTC AAC AGC TCG TCC GAT GAT GG23’。按美国 Roche Molecular Systems , Inc
提供的 Perkin2Elmer PCR 试剂盒上的方法 , 50μL npt Ⅱ2PCR 总反应液中含 npt Ⅱ25 和 npt
Ⅱ23 引物各 12 pmol/ mL , dNTPs 10μmol/ mL , DNA 样品约 10 ng , AmpliTaqTM DNA 聚合酶
2. 5 U 和 10 ×PCR 缓冲液 (Tris2HCl 100 mmol/ mL , KCl 500 mol/ mL , MgCl2 25 mmol/ mL , 明
胶 0. 1 % , pH 8. 3) 9μL。50μL ThEn2422PCR 总反应液中含 NAD25 和 NAD23 引物各
4 pmol/ mL , Trendo25 和 Trendo23 引物各 12 pmol/ mL , dNTPs 20μmol/ mL , DNA 样品约 2 ng ,
AmpliTaqTM DNA 聚合酶 2. 5 U 和 10 ×PCR 缓冲液 9μL。npt Ⅱ基因的扩增程序为 : 94 ℃预
处理 2 min , 94 ℃45 s , 55 ℃30 s , 72 ℃45 s。35 个循环后 72 ℃保温 2 min。ThEn242 基因
的扩增程序为 : 94 ℃预处理 5 min , 94 ℃30 s , 55 ℃30 s , 72 ℃30 s。40 个循环后 72 ℃保
温 2 min。扩增产物用 1. 5 %琼脂糖凝胶电泳 , 0. 1 %溴化乙锭水溶液染色 , 310 nm 紫外观
测仪观测。以经 C58C1 ATHV RifR/ p GUS2Int2Kan 转化的体细胞胚〔14〕为正对照 , 未转化的体
细胞胚为负对照。
1. 6 　Southern blot 分析
按文献 〔15〕的方法 , 取 15～20μg DNA , 用 EcoR I 和 NcoI 酶切后 , 在 0. 8 %琼脂糖
凝胶上电泳 12 h , 再转移到 NC膜上 , 用　32 P 标记的 ThEn242 基因片段探针于 65 ℃下杂交
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过夜。膜经漂洗后在 X - 光胶片上进行放射性自显影。
1. 7 　几丁质酶活性测定
按文献 〔16〕的方法 , 取 10～20μL 蛋白质提取物 (约含蛋白质 10μg) , 加入 37 ℃保
温的 250 mL 42methylumbellifery12β2D2N , N′, N″2triacetyl chitotrioside (MuchT) (5 mg/ L) 反
应液 , 在 37 ℃以下准确反应 5 min , 用 Na2CO3 0. 3 mol/ L 终止反应。反应产物 Methylumbe2
lliferone (MU) 用美国 Bio2Rad Laboratories 的 Bio2Rad VersaFluorTM荧光仪测定。用酶的国际
单位 (U) 表示酶含量。一个酶国际单位 (1 U) 表示每分钟每微克蛋白质产生 1μmol MU
所需的酶量。
以经 C58C1 ATHV RifR/ p GUS2Int2Kan 转化的体细胞胚〔14〕和未经转化的体细胞胚为对照 ,
同一体细胞胚系测定 3 次 , 试验结果以平均数表示。
2 　结果与分析
2. 1 　抗卡那霉素的体细胞胚系的获得
未经农杆菌感染的体细胞胚 (对照 , E00) , 78. 6 % ±3. 2 %能够产生次生胚 , 平均产
生 7. 9 ±0. 92 个次生胚 ( E01) 。经农杆菌感染后 , 在不含卡那霉素的培养基上 , 有 66. 5 %
±1. 8 %的体细胞胚 ( EA0) 产生次生胚 , 平均产生 3. 2 ±0. 83 个次生胚 ( EA1) 。经农杆菌
感染后 , 在含 100 mg/ L 卡那霉素的培养基上 , 有 35. 0 % ±4. 7 %的体细胞胚 ( EK0) 产生
　　　　　　 表 1 　遗传转化的核桃体细胞胚系的 PCR反应与几丁质酶活性
Table 1 　Expression of the npt Ⅱand ThEn242 genes and chitinase activity in different transformed somatic embryo lines
胚　系
Embryo
line
PCR
npt Ⅱ ThEn242 几丁质酶活性 Chitinase
activity (U)
A0 - - 　0. 1
Ak5212121 + + 13. 5
Ak8212124 + + 25. 3
Ak8222122 + + 51. 2
Ak3232121 + + 148. 0
Ak9212121 + - 　0. 7
Ak10212127 + - 　1. 9
Ak15232127 + ( + ) 　4. 8
Ak15232425 + + 45. 3
Ak15232428 + + 24. 9
Ak15232429 + + 28. 9
Ak17212221 + + 96. 3
Ak17222121 + + 112. 1
G+17222321 + - 　0. 1
G+17222326 + - 　0. 9
胚　系
Embryo
line
PCR
npt Ⅱ ThEn242 几丁质酶活性 Chitinaseactivity ( U)
B0 - - 　0. 3
Bk3222124 + + 20. 4
Bk5222221 + + 14. 3
Bk5222222 + + 11. 2
Bk8222224 + ( + ) 　5. 0
Bk8262222 + + 96. 8
Bk11262226 + + 68. 5
Bk15222123 + + 18. 2
Bk15222127 + + 86. 9
Bk17212121 + + 140. 8
Bk17222123 + + 297. 7
Bk19222322 + + 95. 0
Bk19262621 + + 248. 2
Bk19262627 + + 163. 9
Bk19262727 + + 199. 0
G+3212522 + - 　5. 0
胚　系
Embryo
line
PCR
npt Ⅱ ThEn242 几丁质酶活性 Chitinaseactivity ( U)
C0 - - 　0. 2
Ck2212125 + + 297. 7
Ck2212921 + + 227. 6
Ck2212928 + + 219. 8
Ck4242621 + + 43. 5
Ck5212121 + + 16. 0
Ck5212123 + + 15. 1
Ck11222321 + + 43. 5
Ck11222325 + + 43. 9
Ck11232223 + + 18. 9
Ck11292322 + + 180. 0
Ck15212121 + + 199. 6
Ck15212221 + + 284. 3
Ck15212423 + + 205. 0
Ck17212921 + - 10. 6
Ck19212221 + + 31. 6
G+7212121 + - 　7. 9
　　胚系 : A0、B0 和 C0 : 分别表示未转化对照 ; Ak ; Bk 和 Ck : 分别表示卡那霉素选择系 ; G+ : 表示含 npt Ⅱ基因的
正对照。PCR : + : 带纹明显 ; - : 无带纹 ; ( + ) : 带纹极弱。
A0 , B0 and C0 indicate non2transformed embryo lines (negative controls) ; Ak ; Bk and Ck indicate embryo lines transformed and
selected by kanamycin ; G+ indicates embryo lines transformed with npt Ⅱ (positive controls) . + means PCR test with visible bands ;
- means PCR test without visible bands ; ( + ) means PCR test with weak bands.
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次生胚 , 平均产生 3. 4 ±0. 72 个次生胚 ( EK1) 。经一次继代培养 , 有 76. 5 % ±5. 2 %的
E01 , 64. 5 % ±0. 8 %的 EA1和 41. 9 % ±1. 3 %的 EK1产生次生胚 , 分别产生 7. 8 ±1. 21 个 E02 ,
3. 8 ±1. 01 个 EA2和 5. 3 ±0. 83 个 EK2。
以对照为一个体细胞胚系 ( E03) , 以经农杆菌感染后产生第 3 代体细胞胚的第 2 代体
细胞胚为一个体细胞胚系 , 共获得 84 个体细胞胚系 , 其中 41 个为抗卡那霉素的体细胞胚
系 ( EK3) (表 1) 。
2. 2 　PCR检测 npt Ⅱ与 ThEn242 基因
经 PCR 检测 , 对照体细胞胚系 ( E03) 和 42 个未经卡那霉素选择的体细胞胚系 ( EA3)
均为 npt Ⅱ2PCR 负反应 , 而 41 个经卡那霉素选择的体细胞胚系 ( EK3) 均为 npt Ⅱ2PCR 正
反应 (图 2) 。在 41 个 npt Ⅱ2PCR 正反应的体细胞胚系中 , 有 38 个 (86. 4 %) 为 ThEn2422
PCR正反应 (图 3) 。3 个含 npt Ⅱ基因的正对照体细胞胚系表现为 npt Ⅱ2PCR 正反应而
ThEn2422PCR 负反应 (表 1 , 图 2 和图 3) 。
图 2 　遗传转化的核桃体细胞胚 PCR扩增产物
1. 100 bpDNA 标记 ; 2. 含 npt Ⅱ基因的质粒 DNA
(约 420 bp) ; 3. 未转化的核桃体细胞胚 (负对照) ;
4～11. 遗传转化的核桃体细胞胚系 ;
12. 含 GUS 和 npt Ⅱ基因的核桃体细胞胚 (正对照) 。
Fig. 2 　The PCR product of the walnut somatic embryos
mediated with Agrobacterium tumefaciens
1. 100 bpDNA ladder ; 2. the plasmid DNA (～420 bp) ;
3. non2transformed somatic embryos (negative control) ;
4 - 11. transformed somatic embryos ; 12. Somatic embryos
containint the GUS and npt Ⅱgenes (positive control) .
图 3 　遗传转化的核桃体细胞胚复式 PCRR扩增产物
1. 100 bpDNA 标记 ; 2. 纯水 (负对照 1) ;
3～11. 遗传转化的核桃体细胞胚系 ;
12. 未转化的核桃体细胞胚 (负对照 2) ;
13. 含 GUS 与 npt Ⅱ基因的核桃体细胞胚 (正对照 1) ;
14. 含 ThEn242 基因的质粒 DNA (603 bp , 正对照 2) 。
Fig. 3 　The multiplex PCR amplified DNA from somatic
embryos mediated with Agrobacterium tumefaciens
1. 100 bp DNA ladder ; 2. water (negative control 1) ;
3 - 11. transformed somatic embryos ; 12. non2transformed
soamtic embryos (negative control 2) ; 13. somaitc embryos
containing the GUS and npt Ⅱgenes (positive control 1) ;
14. the plasmid DNA (603 bp , positive control 2) .
2. 3 　Southern blot 分析
Southern blot 分析表明 , 在所测的核桃体细胞胚系中 , ThEn2422PCR 正反应的体细胞胚
系均含有标记的 ThEn242 基因带 , 而对照体细胞胚无任何带纹 (图 4) 。这表明 , ThEn242
基因已被整合到了核桃体细胞胚的基因组中。
2. 4 　ThEn242 基因的活性表达
几丁质酶活性测定表明 , 未经遗传转化的体细胞胚系 (对照 E03) 的几丁质酶活性极
低 , 仅有 0. 1～0. 3 个单位。经遗传转化的 npt Ⅱ2PCR 正反应而 ThEn2422PCR 负反应的体
细胞胚系 ( EA3) 几丁质酶活性与仅含 npt Ⅱ基因的正对照体细胞胚系的几丁质酶活性相
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似 , 分别为 0. 1～7. 9 和 0. 2～10. 6 个单位。经遗传转化的、npt Ⅱ2PCR 和 ThEn2422PCR 均
为正反应的体细胞胚系 ( EK3) 几丁质酶活性达 12. 0～341. 4 个单位 (表 1 , 图 5) 。
2. 5 　转基因体细胞胚的萌发与植株再生
选取不同倍数于对照 ( E03) 几丁质酶活性的转基因体细胞胚系 ( EK3) , 经Ca (NO3) 2·
6H2O 脱水处理 3 d 后 , 在 1/ 2 DKW + 0. 5 %蔗糖 + 0. 7 %琼脂的培养基 (含或不含 0. 5 %的
活性炭) 上萌发 , 获得了转基因植株 (图 6) 。
图 4 　部分 PCR正反应核桃体细胞胚
的 Southern blot 分析
1. 阳性对照 (质粒 DNA) ; 2. 阴性对照 (未转化的
核桃体细胞胚) ; 3～8. PCR 正反应核桃体细胞胚系。
Fig. 4 　Southern blot analysis of genomic DNA from
transofrmed soamaitc embryos of walnut
1. positive control (plasmid DNA) ; 2. negetive control
(non2transformed somatic embryo) , 3 - 8. transformed
somatic embryo lines.
图 6 　遗传转化的核桃体细胞胚萌发的植株
Fig. 6 　Transgenic plantlets derived from walnut
somatic embryos containing the ThEn242 gene
图 5 　不同遗传转化的核桃体细胞胚系的几丁质酶活性
Fig. 5 　Specific activity of the endochitinase in different transgenic walnut somatic embryo lines
3 　讨论
自 1984 年 Herrera2Esfrella 等首次用遗传转化的方法获得转基因的烟草植株以来 , 在许
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多作物上都获得了转基因植株 , 其中包括核桃〔11〕。用遗传转化的方法改良作物的关键在
于有效的作物离体培养再生系统和转化基因在转化体内的稳定表达。体细胞胚胎发生与植
株再生是迄今为止的唯一用于核桃转基因研究成功的离体培养再生植株系统〔11〕。尽管核
桃的次生胚为表皮单细胞起源〔17〕, 但是 , 由于接种时体细胞胚发育的阶段不同 , 受转化
的第一代、乃至第二代体细胞胚将出现不同程度的嵌合性〔14 ,18〕。由于农杆菌侵染的随机
性 , 受转化的第一代体细胞胚可能起源于不同的感染位点。因此 , 以第二代体细胞胚为基
础建立的转基因体细胞胚系 , 不仅是纯合体 , 而且还能避免不同感染位点起源的转化体的
混杂〔14 ,18〕。本试验同时以含 GUS 基因内含子的质粒/ 菌株 p GUS2Int/ C58C1 ATHV RifR 转化
同一体细胞胚系 , 经组织化学测定 , 受转化的第三代体细胞胚为纯合体。经 pBin19ESR/
C58C1 ATHV RifR 转化而获得的转化体细胞胚系 , 在 npt Ⅱ与 ThEn242 基因和几丁质酶活性
上系内具有较高的同一性而系间表现多样性。仅管如此 , 本试验所获得的遗传转化系是否
为相互独立的纯合转化系有待进一步测试。
核桃的体细胞胚对卡那霉素具有较强的忍耐性。但卡那霉素预选择不仅可以减少用分
子生物学的方法 (PCR) 的选择量 , 同时也是获得遗传转化体的关键〔19〕。在 41 个经卡那
霉素预选择的遗传转化系中 , 100 %的表现为 npt Ⅱ2PCR 正反应 , 86. 3 %表现为 ThEn2422
PCR 正反应 , 而未经卡那霉素预选择的 42 个“遗传转化系”中 , 无一 PCR 正反应存在。
Npt Ⅱ基因与 ThEn242 基因是紧密联锁的。在本试验中 , 有 3 个 npt Ⅱ2PCR 正反应的遗传
转化体细胞胚系表现为 ThEn2422PCR 负反应。这可能是 ThEn2422PCR 对此 3 个遗传转化体
细胞胚系的扩增产物量小 , 出现极弱的 PCR 带。事实上 , npt Ⅱ2PCR 的带纹很强 (图 2) ,
而 ThEn2422PCR 的带纹很弱 (图 3) 。这可能造成部分极弱带未能显示出来。
遗传转化体中外源基因的稳定与表达关系到遗传转化体的实用价值。基因表达的主要
形式是经转录后合成蛋白质。几丁质酶的合成是检验几丁质酶基因是否表达的重要指标之
一。Southern 杂交结果表明 , ThEn242 基因已被整合到了核桃体细胞胚的基因组中。几丁
质酶活性测定表明 , 经遗传转化的体细胞胚系呈几十、几百 , 甚至几千倍于对照的表达几
丁质酶的活性。这不仅说明外源几丁质酶 ThEn242 基因的存在 , 而且说明该基因能够在核
桃中表达。
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19 　Tang H R , Ren ZL , Reustle GM , et al . An evulation of antibiotics for the elimination of Agrobacterium tumefaciens from walnut
somatic embryos and for the effects on proliferation of somatic embryos and regeneration of transgenic plants. Plant Cell Rep . ,
2000 , 19 (9) : 881～887
Genetic Transformation of the Trichoderma Endochitinase Gene
Th En242 to Somatic Embryos of English Walnut
Tang Haoru1 ,2 , Wallbraun M. 2 , Ren Zhenglong3 , Reustle G. M. 2 , and Krczal G. 2
(1 College of Forestry and Horticulture , Sichuan Agricultural University , Ya’an , 625014 ;　2 Zentrum Grüne Gentech2
nik , SL FA , 67435 Neustadt/ W. , Germany ;　3 State Key Laboratory of Plant Genetics and Breeding , Sichuan Agricul2
tural University , Ya’an 625014)
Abstract : Somatic embryos of English walnut ( Juglans regia L. ) were Agrobacterium2mediate2
ly transformed with the Trichoderma endochitinase gene ThEn242 under the control of a double 35 S
CaMV promoter and Alfalfa Mosaic Virus leader sequence. The selectable marker gene neomycin
phospotransferase Ⅱ ( npt Ⅱ) driven by the nopaline synthase promoter was also used. A total of 41
putatively transformed somatic embryo lines were evaluated for expression of the npt Ⅱand ThEn242
genes by PCR and multiplex PCR. All of the 41 somatic embryo selections expressed the npt Ⅱgene ,
among which 38 somatic embryo selections expressed the ThEn242 gene. Analysis of chitinase activity
by using a fluorometric assay showed dozens to 1 0002fold higher chitinase activity in transformed so2
matic embryos than that in non2transformed ones. All of the tested chitinase2postive somatic embryo
lines analyzed by Southern blotting had an intact copy of the ThEn242 gene. Chitinase expressing so2
matic embryos were further germinated and are being propagated for disease resistance assays.
Key words : Walnut ( Juglans regia) ; Chitinase ; Genetic transformation ; Somatic embryos
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