全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2001 , 28 (1) : 62～64
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2000 - 06 - 26 ; 修回日期 : 2000 - 09 - 19
基金项目 : 河北省自然科学基金资助项目 (399485) ; 国际植物遗传资源研究所自然科学基金资助项目
‘品丽珠’葡萄离体茎尖超低温保存的研究
赵艳华　吴永杰
(河北省农林科学院昌黎果树研究所 , 昌黎 066600)
摘　要 : 研究了包埋干燥法超低温保存‘品丽珠’葡萄离体茎尖的影响因素 ———芽的位
置、干燥时间、预冰冻温度及材料生理状态。选继代培养 4 个月以上的侧芽 , 蔗糖预培养
3 d、干燥 5 h , 两步降温和直接在 MS培养基上培养 , 存活率达 40 %。
关键词 : 葡萄 ; 茎尖 ; 超低温
中图分类号 : S 663. 1 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2001) 0120062203
1 　目的、材料与方法
超低温保存作为植物种质长期保存的方法越来越受到人们的重视〔1 ,2〕。1989 年 Ezawa
研究了葡萄休眠枝的超低温保存 , 认为经过冬季冷驯化的休眠枝经干燥处理后 , 超低温保
存可以存活。采用‘霞多丽’葡萄离体茎尖进行超低温保存 , 获得了较高的存活率 (40 %
～60 %)〔3 ,4〕。但目前葡萄离体茎尖的超低温保存仍仅限于对一个品种的固定程序的研究。
为进一步扩大试材范围 , 提高其实用性 , 我们对影响葡萄离体茎尖超低温保存因素进行了
研究。
试材来源于河北省农林科学院昌黎果树研究所无病毒苗木实验室 , ‘品丽珠’试管无
性系建立于 1994 年 , 超低温保存试验时间为 1998 年 11 月～1999 年 12 月。试管无性系继
代培养基为 B5 + IAA 0. 1 mg/ L + IBA 0. 1 mg/ L + 蔗糖 20 g/ L + 琼脂 4. 5 g/ L。100 mL 的三
角瓶中加 60 mL 培养基 , 培养温度 (25 ±2) ℃, 光照 16 h/ d , 光照强度 2 000～3 000 lx。
茎尖再生培养基 MS + BA 0. 5 mg/ L + NAA 0. 1 mg/ L + 蔗糖 30 g/ L + 琼脂 5. 0 g/ L , 培养条
件同上。
基本程序 : 将继代培养 120 d 的试管材料置于 5 ℃光照培养箱低温驯化 30 d , 无菌条
件下切取其茎尖 , 分别放在 0. 3、0. 7、1. 0 mol/ L 蔗糖溶液中预培养各 1 d , 之后移入 3 %
藻酸钠中 , 用取液器吸取含一个茎尖的藻酸钠液体滴入 0. 1 mol/ L 的 CaCl2 溶液中 , 30 min
后取出凝固的包埋丸 , 放入无菌硅胶中干燥 5 h , 装入冷冻管以 0. 2 ℃/ min 的降温速率降
至 - 40 ℃, 浸入液氮。25 ℃水浴快速化冻 2 min , 然后接种到再生培养基上。在其它因素
不变的前提下进行如下单因子试验 : (1) 蔗糖预培养 , (2) 干燥 , (3) 预冰冻温度 , (4)
芽着生位置 , (5) 继代培养时间 , (6) 超低温保存方法。每处理 20 个茎尖 , 3 次重复。
存活率为化冻后形成新的植株或叶片的茎尖数占茎尖总数的百分比。
2 　结果分析与讨论
2. 1 　蔗糖预培养对茎尖存活的影响
切取离体培养的茎尖直接接种在 MS 培养基上 (对照) , 90 %以上的茎尖能够再生 ,
并形成丛状芽。为使茎尖达到逐渐脱水的目的 , 对包埋的茎尖进行了蔗糖预培养处理。由
表 1 可见 , 在经验浓度及处理时间范围内 , 7 种处理对茎尖的存活没影响 , 存活率均在
90 %以上。在以后的试验中采用 0. 3、0. 7、1. 0 mol/ L 蔗糖处理各 1 d。
2. 2 　干燥时间对茎尖存活的影响
预培养后的包埋丸分别干燥处理 1、
2、4、5、6 和 8 h , 结果表明 (表 2) , 干
燥时间在 1～5 h 范围内 , 差异不显著 ( P
< 0. 05) , 茎尖存活率均在 60 %以上 , 随
着干燥时间的延长 , 存活率急剧下降 , 干
燥 6 h 时为 33. 3 % , 8 h 仅为 10 %。经方差
分析 (P < 0. 01) , 后 2 种处理与前 4 种处
理间差异极显著。以下研究各影响因素 ,
均以 5 h 为临界。
2. 3 　芽的着生位置对超低温保存后茎尖
存活的影响
取不同着生位置的顶芽和侧芽 , 采用
相同的处理 : 包埋 →0. 3、0. 7、1. 0 mol/ L
蔗糖预培养各 1 d →干燥 →两步降温
(0. 2 ℃/ min , - 40 ℃) →液氮保存。化冻
后于 MS 培养基上再培养 , 20 d 后观察 ,
顶芽无一存活 , 侧芽存活率为 38. 7 %。在
以后的研究中全部采用侧芽。
2. 4 　预冰冻温度对超低温保存后茎尖存
活的影响
表 1 　蔗糖预培养对茎尖存活的影响
Table 1 　The effect of sucrose on the shoot
tip regeneration rate
蔗糖预培养浓度
Sucrose preculture (mol/ L)
存　活　率
Regeneration rate ( %)
0. 3 , 1 d 100
0. 5 , 1 d 95
0. 7 , 1 d 90
1. 0 , 1 d 97
1. 0 , 2 d 90
0. 3 , 1 d + 0. 7 , 1 d 95
0. 3 , 1 d + 0. 7 , 1 d + 1. 0 , 1 d 100
CK 90
表 2 　干燥时间对茎尖存活的影响
Table 2 　The effect of dehydration time
on the shoot tip regeneration rate
干 燥 时 间
Dehydration time (h)
存　活　率
Regeneration rate ( %)
1 71. 4
2 66. 8
4 60. 0
5 66. 8
6 33. 3
8 10. 0
　　将预培养和干燥后的包埋茎尖 , 按两步降温法进行预冰冻处理 , 其温度分别为 0、
- 10、- 20、 - 40 ℃, 前三者超低温保存后茎尖无存活 , 而后者 , 即 - 40 ℃预冰冻处理超
低温保存后存活率可达 23 %。
2. 5 　继代培养时间对超低温保存效果的影响
继代培养 20、60 和 120 d 3 种处理的对照茎尖再生率均为 100 %。将上述材料放入 5 ℃
培养箱驯化 30 d , 继代培养 20 d 的茎尖无一存活 , 其他两种存活率为 100 %。将低温驯化
30 d 的后两种材料用于超低温保存 , 在程序相同的情况下 , 继代培养 60 d 的茎尖经超低
温保存后无一存活 ; 而继代培养 120 d 的茎尖超低温保存后存活率 40 % (两步降温法) 。
2. 6 　超低温保存方法对茎尖存活的影响
比较极慢速降温法、玻璃化法和包埋干燥法 3 种方法对葡萄茎尖存活的影响 , 结果前
二者超低温保存后茎尖无一存活 , 而后者茎尖存活率为 35 % , 因此认为包埋干燥法适宜
于品丽珠离体茎尖的超低温保存。
通过此项研究建立了较好的超低温保存技术程序 : 继代培养 4 个月的侧芽 →蔗糖预培
养 3 d →干燥 5 h →两步降温。同时利用所建的超低温保存技术程序保存了‘LN33’和
361 期 　　　　　　　　赵艳华等 :‘品丽珠’葡萄离体茎尖超低温保存的研究 　　　　　　　　　
‘霞多丽’葡萄 , 也分别获得了 10 %和 29. 5 %的存活率 , 初步验证了其可行性。今后需进
一步研究地域之间、品种和砧木之间、基因型之间的差异 , 以期建立完善的、具有广泛适
应性的超低温保存技术程序 , 为建成超低温种质库奠定基础。
参考文献 :
1 　赵艳华 , 吴永杰 , 陈霜莹 , 等. 包埋干燥超低温保存苹果离体茎尖. 园艺学报 , 1998 , 25 (1) : 93～95
2 　T Niino , A Sakai . Cryopreservation of alginate2coated shoot tips of apple , pear and mulberry , Plant Science , 1992 , 87 : 199～
206
3 　Pascale Plessis , Claude Leddet , Jean Dereuddre. Resistance to dehydration and to freezing in liquid nitrogen of alginate2coated
shoot2tips of grape vine ( Vitis vinifera L. cv. Chardonnay) . C. R. Acad. Sci . Paris , 1991 , 313 : 373～380
4 　Plessis P , Leddet C. Cryopreservation of Vitis vinifera L. cv. Chardonnay shoot tips by encapsulation2dehydration : effects of pre2
treament , coolong and postculture conditions. Cryo2Letter , 1993 , 14 : 309～320
Study on Cryopreservation of in Vitro Cultured Cabernet France Shoot Tips
Zhao Yanhua and Wu Yongjie
( Changli Institute of Pomology , Hebei Acadimic of Agriculture and Forestry Sciences Institute , Changli 066600)
Abstract : Bud location , dehydration , prefreezing and subculture time were studied on grapevine Cabernet France
shoot tip cryopreservation by the encapsulation2dehydration process. Best result (40 %) was obtained in the following
procedare : 70 select lateral buds after four months’subculture as explants , preculture them for 3 days , dehdrate for
five hours then cool them in two steps and finally subculture them on standard culture medium.
Key works : Grape ; Cryopreservation ; Shoot tips
(上接 30 页)
10. 早熟无核葡萄 ———希姆劳特无核 　欧美杂交种 , 6 月底成熟 , 平均粒重 8g , 平均穗重 750g , 完
全无核 , 果粒金黄透明 , 品质极上等 , 高抗黑痘病、霜霉病 , 用药量和喷药次数不到巨峰的 1/ 5 , 丰产 ,
大面积栽培平均亩产 4 000～6 000 kg , 是南方无核葡萄商品化栽培的代表品种。年育苗量 40 万株。
11. 核桃和美国黑核桃 　主要品种有漾濞核桃、薄壳香、中林 1 号等 , 年育苗量 25 万株。另可提供
部分美国黑核桃苗。
12. 大枣 　主要品种有梨枣、牛奶枣、鸡蛋枣、大雪枣等 , 年育苗量 20 万株。新引进品种有台湾大
青枣高朗一号、二十一世纪等 , 年育苗 5～10 万株。
13. 杏 　主要品种有红丰、新世纪、凯特杏等。年育苗量 15 万株。
14. 蟠桃 　拥有国内 12 个优良蟠桃品种。
还可提供猕猴桃、板栗、银杏、杨梅、荔枝、龙眼、苹果、杜仲、桑、松、杉、小叶榕等苗木。
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