全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(6)：699～702
Aeta Hordculturae&reca
康乃馨 ACC氧化酶反义基因遗传转化康乃馨的研究
张树珍 汤火龙 杨本鹏 刘飞虎2
( 中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室 ，海 口 571101； 云南大学生命科学学院 ，昆明 650091)
摘 要 ：在建立康乃馨从愈伤组织到完整植株的高频再生体系的基础上，用花特异表达启动子驱动 的
康乃馨 ACC氧化酶反义基 因通过农杆菌介导法对康乃馨进行遗传转 化，获得 了 3株转基 因植株 ．经多重
PCR及 PCR-Southem杂交检测，证实康乃馨 ACC氧化酶的反义基因已整合进康乃馨 的基 因组中。
关键词 ：康乃馨 ；ACC氧化酶 ；花特异表达启动子 ；反义基因；遗传转化
中图分类号 ：S 68 文献标识码 ：A 文章编号：0513．353X (2003)06-0699—04
康乃馨 (D／anthus caryophylus L．)是典型的呼吸跃变型花卉 ，控制其 乙烯生物合成 ，是延缓衰
老、延长保鲜期的主要途径 。利用反义 RNA技术把康乃馨 ACC合成酶或 ACC氧化酶基因反向导入康
乃馨优 良品种中，可在一定程度上抑制其内源 ACC合成酶或 ACC氧化酶基 因的表达，抑制乙烯的生
物合成。Savin等把反义 ACO和ACS基因转入康乃馨 中，得到的转基 因植株没有 明显的乙烯和呼吸
峰，并且可以延迟花瓣衰老 】,23；Kiss等把反向的 ACC合成酶基因通过 EHA105和 LBA4404转入到康
乃馨中，经 NPTII的 Southem杂交以及 RT—PCR检测 ，证实外源基因已转入康乃馨中 3j。
在 自然衰老过程中，康乃馨 ACC氧化酶基因是在花器官中被诱导表达 】。PchsA是光依赖性的并
在花器官中特异表达的启动子 5l6j。我们首先采用 RT—PCR技术分离 、克隆了康乃馨 ACC氧化酶的
cDNA ，又通过 PCR技术获得花特异表达基因 CHSA的启动子 PchsA[8j，并以 PchsA为启动子构建了
康乃馨 ACC氧化酶基因的反义植物表达载体 ，通过农杆菌介导法把其导入康乃馨优良的栽培品种中，
以期获得能延长插瓶寿命的康乃馨新品种 。
1 材料与方法
1．1 材料
以康乃馨马斯特 (Mastet)、多明戈 (Domingo)和达拉斯 (Dalas)品种的无菌苗叶片为试材，农
杆菌 EHA105为浸染菌株 ，含有质粒 pCBO (图 1)。生化试剂均购 自Sigma公司。
RB匝 三 圃 三 匝 二 一匹 一 三 lB
图 1 pCBO质粒图谱
rig． 1 IXagram ofplasmid pCBO
1．2 方法
1．2．1 康乃馨高频再生体 系的建立 分别从 3个品种的无菌苗上取生长健壮的幼嫩叶片，将其切成
约 O．2 em的薄片接种于诱导培养基 (MS+2，4一D 0．1～1．0 mg／L+蔗糖 3O L，pH 5．8)，于 1500 lx，
14 h／d，(25±1)oC条件下培养，以诱导愈伤组织。再把生长 良好的愈伤组织转移到分化培养基 (MS
+BA或者 KT，Zit，AD 1～2 mg／L+蔗糖 3O L，pH 5．8)，于 25℃，1500 Ix，14 h／d条件下培养，以
诱导小植株产生。待小植株长至约 2 em高时转至生根培养基 (MS+NAA或者 L ，IBA 1 mg／L+蔗
糖 2O L，pH 5．8)，于 2000 Ix，14 h／d的光照条件下培养以诱导生根。
收稿 日期 ：2003—04—17；修 回日期：2003—06—11
基金项目：中国博士后科学基金项 目 (2002C0003M)；云南省自然科学基金项 目 (20020~02M)
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700 园 艺 学 报 30卷
1．2．2 农杆菌菌液的准备 从新鲜的农杆菌保存平板上挑取单菌落接种到 5 mL YEP (含 Str 25 g／
mL、Rif 25 t~,／mL、Kan 50 t~,／mL)液体培养基中，于 28c，200 r／rnin培养至对数后期 (约 24 h)。取
2 mL于 150 mL三角瓶中扩大培养到 40 mL含相同抗生素的 YEP液体培养基 中，于相同条件下培养至
OD6o所需值 (1．3752)，转移到离心管中，于 25c，4000 r／min离心 5 min，倒掉上清，吸干残液，用
等体积 MR液体培养基 (1／5 MS+2，4．D 0．5 mg／L+AS 200 t~tmol／L+果糖 10 mmol／L+葡萄糖 10 retool／
L+蔗糖 25 g／L，pH 5．3)重悬细菌 ，于 25oC，200 r／min培养 2 h，诱导细菌 r基因表达。作为感染
转化材料的菌液原液 ，稀释至农杆菌 1×lOs～1×lO9个／mL (OD6o1=3×lO9 Cels／mL)。
1．2．3 叶盘法转化 将无菌的康乃馨幼叶切成小块 (0．2 cm)转入处理好的农杆菌菌液中，侵染 3O
min后用无菌吸水纸吸干，再接种于 MR固体培养基上于 19c暗培养 2～3 d，其后将外植体用无菌水
冲洗 3次 ，并用无菌滤纸吸干 ，又将外植体接种于含 G418 40 t~,／mL，Car 200 t~,／mL的诱导愈伤组织
培养基 (MS+2，4．D 0．5 mg／L+蔗糖 3O g／L，pH 5．8)中，于 1500 lx，14 h／d光照条件下培养，其间
每周在相同培养基中继代 1次。当愈伤组织长至 0．2～0．5 cm时，将其转接到含 Car 100 W．,／mL，G418
40 W．,／mL的分化培养基 (Ms+BA 2 mg／L+蔗糖 3O g／L，pH 5．8)中诱导小苗的再生。当在抗性培养
基上长成的小植株约 2 cm高时 ，移入含 Car 100 t~,／mL，G418 40 t~,／mL的生根培养基 (MS+NAA 1
mg／L+蔗糖 2O L，pH 5．8)上 ，于 2000 lx、14 h／d光照条件下诱导生根 ，进一步筛选转化子 (转化
过程中使用的抗生素的浓度根据抗性预试验结果而定)。
1．2．4 转化植株的分子检测 取转化及未转化植株嫩叶各 4片 (约 0．1 g)，采用 SDS法分别提取总
DNA作为模板 ，首 先 以 ⅣJ Ⅱ基 因的特异性 引物 进行 PCR扩增 。引物 1：5’-CCCCTCGGTATC-
CAATIAGAG-3’；引物 2：5’ CGGGGGGTGGC~GAAGAACTCCAG-3’。正对照的模板为质粒 pCBO DNA，
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析并照相。将上述 PCR产物的电泳凝胶进行 Southem转膜后以 ⅣJ Ⅱ基
因作探针进行杂交【 。以经 Ⅳ尸 Ⅱ基因 PCR—Southem杂交检测呈阳性反应的转化植株的总 DNA为模
板，分别用花特异表达启动子 (PchsA)的引物 P1(5’．GGAAGCTYITCCI~TIEAAACATI~ATG-3’)、ⅣJ
Ⅱ基因的引物 P1和 ACC氧化酶基因的引物 P1(5’．GCTCTAGA1_1Tr] A ； TrArI℃T．3’)为特异引物 ，
进行双重 PCR扩增 ，正对照的模板为质粒 pCBO DNA，负对照的模板为正常植株的 DNA。
2 结果与分析
2．1 康乃馨的高频再生体系
以无菌苗的幼叶为外植体 ，其在各种诱导培养基上培养一周后叶块均开始膨大，10 d开始生长愈
伤组织，25～30 d整个叶片切 口都长满了愈伤组织。这说明使用的培养基均能诱导康乃馨幼叶产生愈
伤组织 ，其中以 MS+2，4．D 0．5 mg／L+蔗糖 3O g／L，pH 5．8培养基最好，在其上长出的愈伤组织呈致
密颗粒状，愈伤组织的诱导频率为 100％ (见插页 2图版 ，1)。愈伤组织在各种分化培养基上培养 2O
d后便开始发育形成丛状的小植株，以在 Ms+BA 2 mg／L+蔗糖 3O g／L，pH 5．8培养基上长出的小植
株最多，愈伤组织分化芽的频率也高达 100％ (指每块愈伤组织均能分化出苗，但每块愈伤组织不止
分化一个植株 ，见插页 2图版 ，2)。小植株在生根培养基上培养 2周后开始生根 ，20 d后便形成了完
整的根系，随之植株也进一步长大，生根率可达 100％。使用的几种生根培养基均能诱导生根 ，其中
以 MS+NAA 1 mg／L+蔗糖 2O g／L，pH 5．8培养基生根最快。3个品种再生频率无明显差异。
2．2 农杆菌介导法转化康乃馨的结果
用含植物表达载体 pCBO的农杆菌 EHA 105，以农杆菌 1×lOs～1×lO9个／mL的菌液和康乃馨叶
片侵染 2O～30 min后 ，在 MR培养基上共培养 2～3 d，之后将叶片接种于含 G418 40 t~,／mL、Car 200
t~,／mL的诱导培养基上培养，约 90％逐渐褐化死亡 ，约 10％能形成愈伤组织。这些愈伤组织经分化
培养 ，只有约 15％能发育形成小植株。小植株继续在抗性培养基上长至 2 cm后转入含 G418 40 ~g／mL
的生根培养基上培养约 3～4周后有 40％的幼苗能生根，幼苗也随之长大 ，再继续培养 2～3周后幼苗
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6期 张树珍等 ：康乃馨 ACC氧化酶反义基因遗传转化康乃馨的研究 701
根系发育 良好，具有主根和各级侧根 ，而那些不长根的幼苗便逐渐黄化死亡 (见插页 2图版，3)。这
说明 40 rTlL的 G418对转化体的初步筛选是有效的。根系发育良好的小植株移人土壤中栽培成活率
达 100％。本试验获得 5株生长 良好的转化再生植株 ，转化再生频率达到 0．6％。
2．3 转基因植株的分子鉴定
2．3．1 NPT1I基 因的 PCR扩增 由于导人的外源基 因 (ACC氧化酶的反义基因)与该植物的内源基
因 (ACC氧化酶基因)同源 ，因此不能直接用 PCR方法检测外源基因的整合情况，而 NPT I基因是
与 ACC氧化酶的反义基因一同导人的，通过 PCR方法检测 NPT1I基因在转化植株中的整合情况可以
间接证明 ACC氧化酶的反义基因在其中的整合情况。故本试验以转化植株的总 DNA为模板，用 NPT
Ⅱ的特异性引物进行 PCR扩增检测。从图2可知，对照植株无任何扩增条带 ，而有 3株转化植株扩增
出约 1．1 kh的 DNA条带 ，这与 Ⅳ尸 Ⅱ基因大小相符 ，表明 NPT1I基因已转入康乃馨染色体中。
2．3．2 转基因植株 NPT1基因的 PCR—Southem检测 为了进一步证明这 3株转基因植株的可靠性，
本试验又以 NPT1I基因为探针，对上述 PCR结果做 PCR—Southem杂交 ，结果如图 3所示，3株植株
均呈阳性反应，进一步证明 M Ⅱ基因已整合进这 3株康乃馨的基因组 中。
图 2 转基因植株 NPT1I的 PCR检测结果
1．PCR ma~eis；2质粒 DNA；3．非转化植株；4～8．转化植株
ng．2 PCR analysis ofNPTrfortransgenic plants
1．Markeis；2．Plasmid DNA；3．Nontransgenic plant~4—8．Tmrtsfonnants
图 3 转基因植株 NPT1I的 PCR—Southern检测结果
1．质粒 DNA；2 非转化植株；3～7．转化植株。
Fig．3 PCR -Southern analr,Js of NPTn for缸铀 plants
1 Plasmid DNA；3． Nontransgenic plant；3～7．Transforrnants．
2．3．3 转基 因植株的双重 PCR检测 为了进一步证明上述结果的可靠性 ，又以上述分子检测证明的
3株转基因康乃馨总 DNA为模板 ，分别采用 NPT1I基因的 5’端引物、花特异表达启动子的 5’端引
物和反义 ACC氧化酶基因的 3’端引物进行双重 PCR检测 ，结果为 ：以花特异表达启动子的 Pl和
ACC氧化酶基因的 Pl进行的双重 PCR，扩增得到一条 1．7 kJ)左右的片段 ，而对照没有得到相应的片
段 (图 4)。花特异表达启动子 PchsA为 514 bp，而 ACC氧化酶基因为 l156 bp，这说明花特异表达启
动子和反义 ACC氧化酶基因以二相联的方式转入到康乃馨的染色体 DNA中。
以 NPT1I基因的 Pl和 ACC氧化酶基因的 P1进行双重 PCR，也扩增得到了一条大小为 2．9 kb左
右 的片段，对 照没有该 片段 (图 5)。其中 NPT1I基因约 1．1 kb，NPT1I基 因的终止子 NOS—tern约
图 4 转基因植株的 PdlsA+反向ACO的 PCR检测结果
1．LDNA HindⅢ+PCRmarkers；2．质粒 DNA；
3．非转化植株；4—6．转化植株。
． 4 P(3R锄 磺 4-antism ~AI20 for位 雌 I plants
1．LDNA HindⅢ+PCR~ ers；2．Plasmid DNA；3．Nontransgerlic
plant；4—6．Trarmforrrmnts．
图 5 转基因植株 NPTⅡ+反向 ACO的 PCR检测结果
1．LDNA HindⅢ +PCRmarkers；2．质粒 DNA；
3．非转化植株 ；4—6．转化植株。
№ ．5 略 t锄由sis磺 脚 I’n+antismseAI20for协睡释 pIaIlts
1．LDNA HindⅢ +PCR markers；2．Plasmid DNA：
3．Nontransgenic plant； 4—6．Tmnsforrnants．
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0．2 kb，而 PchsA+反向 ACO约为 1．6 kb，其大小刚好是它们之和。这进一步说明 ⅣP Ⅱ基因与花特
异表达启动子和反义 ACC氧化酶基因已以三相联的方式转人到康乃馨的染色体 DNA中。
以上分子检测的结果证明这 3株转化植株为康乃馨 ACC氧化酶反义基因的转基因植株 ，这 3株
均为马斯特品种转基因植株。目前转基因植株移栽成活且生长良好。
3 讨论
康乃馨在组织培养过程中很容易玻璃化 ，茎 、叶失绿 ，呈半透明状态，外观形态异常 ，分化能力
低 ，难以继代增殖，也很难发根。为了能有效地进行遗传转化 ，我们通过调整不同的培养基配方及培
养条件建立了康乃馨从幼叶一愈伤组织一完整植株的高频再生系统，有效地克服了玻璃化的形成。
农杆菌介导的遗传转化受很多因素影响 ，如农杆菌菌株 、质粒的毒性 、诱导物的种类及浓度、培
养基的 pH值 、外植体的生理状态 、侵染及共培养的时间、温度等均影响转化的效果。本试验采用康
乃馨无菌苗的幼叶为转化受体材料 ，EHA105为转化的农杆菌菌株 ，NPTⅡ基因为筛选标记基因，花
特异表达启动子驱动的康乃馨 ACC氧化酶的反义基因为 目的基因对康乃馨进行 了遗传转化 ，经 G418
抗性筛选 ，获得了5株抗性植株。经分子鉴定从中筛选出 3株康乃馨 ACC氧化酶反义基因的转基因
植株。转化效率仍然不高 ，还须再进行大量的转化以获得更多的转基因植株 。至于转基因植株中外源
基因的表达 、遗传稳定性分析和进一步的保鲜期的测定还有待于进一步的试验。
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Genetic Transformation of Carnation with Its ACC Oxi_da~ Antisense Gene
Zhang Shuzhen ， Tang Huolong ， Yang Benpeng ，an d Liu Feihu。
( National研 Biotechnology Laboratoryfor Tropical Crops，Chinese Academy ofTropic Agricultural Sciences，Haikou 571101，China；
Co／ege of Sc／ence，Yuamm Un／,~rshy，／(ammh~650091，China)
Abstract： The high frequency regeneration system of carnation from leaf to callus to plantlets was established．
Then genetic transformation of the carnation with the ACO an tisense gene．which controled by flower-specifc ex-
pression promoter(PchsA)was performed via agrobacterium mediated method and obtained 3 of transgenic plants
via the pathway of regeneration plantlets from calus at last．Th e resuhs of the PCR and PCR．Southem hybridization
analysis showed that the carnation ACC oxidase antisense gene Was integrated into carnation genomes．It will be a
good foundation for improvement the longevity of carnation flowers．
Key words： Carnation； ACC oxidase； Antisense gene； Genetic transformation
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