全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (6) : 1051～1055
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 04 - 20; 修回日期 : 2005 - 10 - 26
基金项目 : 中国热带农业科学院重点基金资助项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhiqiangjin@ sohu1com)
类黄酮 3pi, 5pi羟基化酶基因的克隆及转化铁炮百合
徐碧玉　刘菊华　金志强 3
(中国热带农业科学院热带生物技术研究所 , 热带作物生物技术国家重点实验室 , 海口 571101)
摘 　要 : 利用 RT2PCR技术从矮牵牛的紫色花瓣中克隆了两个控制花色的类黄酮 3pi, 5pi羟基化酶基因
Hf 1和 Hf 2, 并构建了植物表达载体 , 利用农杆菌介导法对铁炮百合进行了遗传转化 , 获得了转基因植株。
关键词 : 铁炮百合 ; 类黄酮 3pi, 5pi羟基化酶基因 ; 转化
中图分类号 : S 68212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0621051205
C lon ing of Flavono id23pi, 5pi2hydroxyla se Gene and Its Tran sforma tion in to
L ily ( L ilium longiforum )
Xu B iyu, L iu Juhua, and J in Zhiqiang3
(S tate Key Laboratory of Tropica l C rops B iotechnology, Institu te of Tropical B ioscience and B iotechnology, Chinese A cadem y of
Tropical A gricu ltura l Sciences, Haikou 571101, China)
Abstract: Flavonoid23pi, 5pi2hydroxylase ( F3pi, 5piH ) is a key enzyme in the biosynthesis of anthocya2
nins, which can divert the p roduction of delphinidin p igments. Two cDNA s designated as Hf 1 and Hf 2 enco2
ding F3pi, 5piH were isolated from the purp le flower of Petun ia hybrida by using RT2PCR and also sequenced.
A construct of Hf 2 in a sense2orientation driven by CaMV 35S p romoter was constructed and transformed into
L ily (L ilium long iforum ) by using A g robacterium tum efacien mediated method. The transgenic p lants were
confirmed that Hf 2 gene was integrated into lily genome by PCR and Southern blot.
Key words: L ilium long if lorum ; Flavonoid23pi, 5pi2hydroxylase; Genetic transformation
植物花色是因为特定色素在花瓣细胞中的存在〔1, 2〕并受多种因子协同作用的结果。花瓣细胞中决
定花瓣颜色的色素主要有 3类 , 即类黄酮 ( flavoniods)、类胡萝卜素 ( carotenoids) 和甜菜色素 ( be2
talains)。类黄酮色素是植物 3类色素中最常见的调控花色的色素 , 而花色素苷是类黄酮中一类主要
色素 , 对其生物合成途径研究较多〔2, 3〕。花色素苷能控制花的红、蓝、紫和紫红等颜色。类黄酮 3pi,
5pi羟基化酶 ( flavonoid23pi, 5pi2hydoxylase; F3pi, 5piH ) 属于细胞色素 P450家族 , 它决定二氢堪非醇 B
环的羟基模式 , 并最终决定产生花色的花色苷结构 , 是合成蓝色的花翠素 - 3 - 葡萄糖苷的关键酶。
矮牵牛编码 F3pi, 5piH的基因 Hf 1和 Hf 2〔4〕的表达均能使花色苷生物合成途径趋向于产生蓝色的花翠
素 - 3 -葡萄糖苷 , 从而使花趋于蓝色 , 其中 Hf 2控制花瓣中 F3pi, 5piH的活性〔5, 6〕。
目前 , 对花色素苷代谢途径进行基因操作已在多种植物上获得成功。1988年首次利用反义 ( an2
tissense) 技术将苯基苯乙烯酮合成酶基因 (CHS ) 反义 RNA转入矮牵牛 , CHS的 mRNA活性下降 ,
使花颜色变浅或成白色 ; 利用共抑制法将 CHS的多个拷贝导入植物体 , 可得到白色花或图案变化十
分丰富的彩瓣花〔7〕。玉米 D FR基因导入矮牵牛 RL01突变体后 , 使二氢堪非醇还原 , 从而提供了天
竺葵色素生物合成的中间产物 , 使花色变为淡砖红色〔6〕。Florigene和 Suntory两家公司通过转基因已
经获得了蓝色康乃馨 , 并在澳大利亚和日本上市〔8〕。
我们从蓝色矮牵牛 ( Petun ia hybrida) 花瓣提取 RNA, 经 mRNA纯化试剂盒纯化 , 反转录 cDNA ,
采用 RT2PCR方法获得了编码 F3pi, 5piH的 Hf 1和 Hf 2基因 , 将 Hf 2连接于 35S启动子的下游 , 构建
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了植物表达载体 , 转化铁炮百合 (L ilium long iforum ) , 获得经 PCR筛选的转化植株。
1　材料与方法
111　材料
矮牵牛由中国热带农业科学院品质资源研究所提供。大肠杆菌 DH5α, 农杆菌菌株 GV3103由本
实验室保存。其它生化试剂购自北京华美生物试剂公司。
112　F3pi, 5piH基因的克隆和表达载体的构建
取蓝色矮牵牛花瓣 , 于液氮中研磨 , 采用异硫氢酸胍 —苯酚 —氯仿法提取 RNA〔9〕, 用 Promaga
公司提供的 mRNA纯化试剂盒 , 按说明书纯化 mRNA。以 mRNA 为模板 , oligo ( dT) 为引物 , 在
AMV反转录酶的作用下合成 cDNA第一链。
根据文献 〔4〕报道的编码 F3pi, 5piH的 Hf 1和 Hf 2基因序列 , 设计合成两对特异引物 , 在其 5’
端引物的上游加入 X baⅠ酶切位点。
Hf 1 基因的 5pi引物序列为 : 5pi2GTTCTAGAGTCATGATGCTACTTACTGAGC23pi; 3pi引物为 : 5pi2
TAGCTATGGTACATAAACATCCAATTGTAA23pi。Hf 2 基因的 5pi引物序列为 : 5pi2GTTCTAGATGGTGC2
TACTTAGTGAGCTTGCTGCA23pi; 3pi引物为 : 5pi2GTTTCAAGCTAAAGGTGCATAAACATC23pi。以 cDNA第
一链为模板 , 进行 PCR扩增。反应条件为 94℃ 5 m in, 94℃ 1 m in, 56℃ 45 s, 72℃ 1 m in; 72℃ 10
m in, 共 35个循环。
用 X baⅠ和 SacⅠ双酶切载体 pHF2, 用相同的酶双酶切 pB I121载体 , 分别回收目的片段和载体
片段 , 用 T4DNA连接酶连接载体和目的基因片段 , 获得植物表达载体 pBHF2。
113　转化
11311　外植体处理 　挖取铁炮百合鳞茎 , 以新鲜鳞片作为外植体 , 在流水中冲洗 30 m in, 随后在超
净工作台上 , 用 75%酒精浸泡 30 s, 无菌水冲洗 3次 , 再用 20%次氯酸钠浸泡 20 m in, 无菌水冲洗
3～5次 , 用灭菌滤纸吸干水分备用。
11312　农杆菌浸染 　挑取经转化含有目的基因 (pBHF2) 的单菌落 , 在 YEP液体培养基中 , 28℃摇
至 OD260为 015左右 , 即可浸染外植体 , 浸染时间 5 m in。用灭菌的滤纸吸干外植体表面的菌液 , 放入
再生培养基中诱导愈伤组织及分化出苗。
11313　转化植株 PCR检测　转化植株总 DNA的提取参照傅荣昭的方法〔10〕, 用 Hf 2基因的特异引物
进行 PCR反应 , 反应条件同上。
11314　转化植株 Southern blot检测 　取转化铁炮百合植株叶片提取总 DNA〔10〕。DNA 用内切酶
EcoRⅠ消化 , 1%琼脂糖电泳检测 , 酶切产物转膜 , 杂交〔11〕。
2　结果与分析
211　矮牵牛 F3pi, 5piH基因的克隆及序列分析
用 mRNA反转录的 cDNA第一链为模板 , 在
PE2400PCR仪进行 RT2PCR, 扩增出两条特异性条
带。Hf 1和 Hf 2大小分别与 DNA标准分子量中的
115 kb和 116 kb相当 , 与文献报道的相一致 (图 1)。
PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离后 , 用
DNA回收试剂盒回收 , 回收产物与 pGEM 2T Easy
Vector连接 , 通过蓝白筛选 , 挑取独立的白菌落 ,
小量法提取质粒 DNA , 通过酶切鉴定筛选出阳性
重组子。阳性重组子由上海生工生物工程公司测
图 1　H f 1、H f 2的 PCR扩增图
F ig. 1　Electrophoresis of PCR am plif ica tion products
M: DL 2 000～15 000 marker ( bp) ; 1: Hf 1; 2: Hf 2
2501
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序 , 序列分析结果表明 , Hf 1长度为 1 514 bp, 登陆 NCB I采用 BLASTn比较 , 与 NCB I登录的 cDNA
序列 ( Z22545) 同源率为 100% , 编码 504个氨基酸。Hf 2长度为 1 530 bp, 与 NCB I登录的 cDNA序
列 ( Z22544) 同源率均为 94% (图 2) , 编码 510个氨基酸。
图 2　H f 2序列测定结果 ( 1) 与 Z22544序列 ( 2) 比较
1: 本文克隆序列 ; 2: Z22544序列
F ig. 2　H f 2 gene sequenc ing result ( 1) and com par ison w ith Z22544 ( 2)
212　植物表达载体 pBHF2构建
构建的含有目的基因片段的植物表达载体 pBHF2如图 3所示。经酶切鉴定表明 , Hf 2基因已正
向插入到植物表达载体的启动子下游 (图 4)。
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图 3　植物表达载体 pBHF2构建示意图
F ig. 3　S igna l f igure of the con struction of plan t expression vector pBHF2
213　转化
21311　转化铁炮百合出愈、分化及生根 　经农
杆菌浸染的铁炮百合鳞茎在 MS + NAA 110 mg/L
+ 30%蔗糖的培养基上培养 3周长出愈伤组织 ,
5周开始分化出苗。苗高 1 cm左右时将其转入
M S + NAA 2 mg/L + 30%蔗糖的培养基上培养
3～4周开始生根。本研究初步获得 57株抗性筛
选植株 , 并将其移栽大田进一步筛选及鉴定性
状 (图 5)。
21312　PCR及 Southern检测 　转化植株 PCR检 图 4　植物表达载体 pBHF22XbaⅠ、SacⅠ双酶切鉴定F ig. 4　 Iden tif ica tion of plan t expression vector pBHF2w ith XbaⅠ, SacⅠ d igestion
图 5　转化铁炮百合出愈 ( a)、分化 ( b)、生根 ( c) 及大田移栽 ( d)
F ig. 5　Ca lli forma tion ( a) , d ifferen tia tion ( b) , root forma tion of tran sforma ted lily ( c) and tran sferred them in to f ield ( d)
测显示 , 57株抗性植株中 23株为阳性 , 阳性植
株又经 Southern blotting, 结果显示有 16株有杂交
信号 , 确定为转基因植株 , 图 6显示为部分植株
Southern杂交结果。
3　讨论
蓝色在花卉和果实中属于稀有色系 , 尤其是
切花用百合、香石竹、月季、玫瑰等都缺乏蓝色
图 6　转化植株 Southern blotting
CK: 阴性对照 ; 1～7: 转基因植株。
F ig. 6　Southern blotting of tran sforma ted plan tlets
CK: Negative control; 1 - 7: Transformated p lantlets.
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花系。我们克隆了可影响蓝色形成的关键酶基因 , 希望通过转基因培育出蓝色花卉 , 不仅可增加花卉
品种 , 而且其经济价值亦会有极大的提高。百合为重要的切花花卉 , 近几年通过杂交育种培育了一些
新品种 , 但蓝色百合的培育还未见报道。我们通过转基因技术初步获得数十株铁炮百合转化植株 , 目
前正在大田移栽 , 以进一步确定其性状。
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