全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(3)：360—362
Aeta Hortic~turae Sinica
小金海棠抗缺铁相关基因—— 基因片段的克隆
戚金亮 韩振海h 印莉萍 许雪峰 张连忠
(。中国农业大学农学与生物技术学院果树分子生物学实验室，北京 100094； 首都师范大学生物系遗传与生物工程重
点实验室，北京 100037； 山东农业大学园艺学院，泰安 271018)
摘 要：以高效抗缺铁苹果种小金海棠 (Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)为试材，以异源的小麦
Nramp基因为探针进行杂交分析。Southem杂交结果表明：小金海棠基因组中存在该家族基因。Northern杂
交结果表明：在根和叶中，Nramp基因在正常供铁和缺铁胁迫下均能得以转录，且叶中的转录受缺铁胁迫
的诱导而加强。通过 PCR方法已从基因组 DNA中扩增出了752 bp的特异性产物，该片段与水稻的 一
Nramp3具有83％的氨基酸序列同源性。
关键词：小金海棠；铁；Nramp；杂交
中图分类号：S 661 文献标识码：A 文章编号：0513~53X (2004)03-0360-03
Ooning of Nran~ Gene Fragment Being Relating to Related to Resistance of Iron
Deficiency Stress from Ma／us xiaojinensis
Qi Jinliang。一，Han Zhenhaih，Yin Liping ，Xu Xuefeng。，and Zhang Lianzhong
(。Molecular Biology Laboratory of Fruit Tree，Colege ofAgronomy and Biotechnology，China agric~ural University，Belting
100094，China； The Key Laboratory ofGenetics and Biotechnology，Biology Department ofCapital Normal University，Belting
100037，China； Department ofHorticulture，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China)
Abstract：To initially study the role of Nramp gene in resisfng iron deficiency stress，we analyzed this
gene in Malus xiaojinensis Cheng et Jiang by using blot hybridization technique with Nramp gene fragment of
wheat as probe．Southern blot result suggested that there was Nramp gene in the genome of Malus xiaojinensis．
Northern blot confirmed that transcription ofthe Nramp gene is induced in both roots and leaves and strength—
ened in leaves by iron stress．A 752 bp fragment ofNramp gene was obtained by PCR from the genomic DNA，
which has 83％ identities to OsNramp3 of rice in amino acid leve1．The results lead to the prediction that
Nramp gene ofMalus xiaojinens／s may play a crucial role in resisting iron stress．
Key words：Malus xiaojinensis Cheng et Jiang；Iron；Nramp；Blot
1 目的、材料与方法
小金海棠 (Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)为高效抗缺铁胁迫基因型苹果种 J¨。研究表明，
Nramp(natural resistance—associated macrophage protein)基因与植物的抗缺铁能力有较大关系，并受缺
铁胁迫诱导加强表达l2|3 J，推测可能在一种全新的铁素吸收机理——内吞机理 (endocytotic mecha—
nism) 系统中发挥着重要的作用。本研究对小金海棠中该基因做了初步探索。
小金海棠播种后长至6～7片真叶时进行试验处理。处理为 EDTA—Fe(I) (0，40~nol／L)，其
它元素与完全营养液相同。提取叶片DNA分别进行Sail、BamHI[宝生物工程 (大连)有限公司]
单酶切，并于处理后不同天数时取叶片和根系提取RNA进行甲醛变性胶电泳和转膜；制备 [(it_32P]
dCTP(亚辉生物公司)标记的小麦 Nramp基因片段 (首都师范大学生物系保存)异源探针，进行
收稿日期：2003—09—23；修回日期：2004—02—23
基金项目：国家自然科学基金项目 (30170552)；教育部高等院校青年教师科教奖励基金资助项目；北京市自然科学基金资助项目
}通讯作者 Authors for corespondence
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3期 戚金亮等：小金海棠抗缺铁相关基因—— P基固片段的克隆
Southern和Northe1．n杂交。PCR反应体系及条件：l×Ex Taq bufer，Mgcl2 2 0 mmol／L．dNTP Mixture
0．2 mmol／L，引物0．4~Lmol／L，模板DNA 0．8 P．g。94℃预变性3 rain；94℃变性30 s，55℃退火60 s，
72℃延伸90 s．3O个循环；72℃延伸J0 min l 游引物Fl：5’CAATCACTIGCAGCTAGGCTAGG 3’．
下游引物Rl：5’GTcccGcATAAcTTccTcTAATTc 3、一PCR扩增产物克隆于pGEM-T载体上进行l浏序
(上海联众基因科技研究院测序) 序列在htp：／／v,-,vw．ncbi．nlm．nih．gov／blasl网站提供的软件中进行
同源性比较。
2 结果分析与讨论
2．1 小金海棠中Nramp基因的Southern和Northern杂交
由图1．a可以看出，小金海棠基因组DNA酶切效果好，酶切后产生大小不等的弥散条带。将此
胶转膜用于Southern杂交，两种单酶叨均有明显的杂交信号 (图1．b)，证明小金海棠基因组中存在
Nramp家族基因 进一步进行Northern杂交的结果 (图2，b)表明，无论正常还是缺铁条件下，根
系和叶片中该家族基因均能得以转录；与正常供铁处理的叶片相比，缺铁胁迫处理第3天叶片Nramp
转录最强，第6天稍有降低，第9天时与对照相比仍然有较强的杂交信号 说明该家族基因的转录受
到缺铁胁迫的诱导而加强。
用小麦,vra~．p基因为探针对小金海棠进行的Scuthetal杂交分析
小盒诲襞摹因蛆 DNA的限制 内时酶酶叼；b：~uthem
杂交结果 I：Sail酶纠：2：BamHI酶切
F ．1 Southern analysis of e genomic DNA
wilh wheatNramp gene|IS probe
a：M xia M， genomi~ ^Il ￡ I I【。y l rk-lion em]onueie~
en⋯ ；b：R~uhs of Southe~htot 1：By s_ll；2：BY B ndII
在缺铁胁迫下，小金海棠可能合成更多的
NIL&MP蛋白，从而能够从土壤和胞外空间中吸收
转运更多的Fe 来满足细胞对铁的需求：值得注
意的是，Nramp在地上部能得以转录揭示了该基
因可能在植物体内胞间铁素的高效利用或重新利
用方面起着重要的作用，因为在缺铁胁迫下，植
物体除了提高根系吸收转运 “的能力外，对地
上部的铁素利用效率及重新利用效率的提高可能
也是其高效抗缺铁机理的一部分。
2．2 小金海棠中Nramp基因组DNA片段的克隆
根据 Gerd3ank中公布的植物Nramp基因家族
的功能保守区设计引物．以小金海棠基因组DNA
图2 用小麦Nramp基因为探针对小金海棠
进行的Northern杂交分析
a：小金海棠根系干u叶片总RINA；b：Nordle~杂交结果
L 缺铁处理6 d根系：2：LE常供铁6 d根系 3～6：叶片
【3：iE常供铁：4：缺铁3 d：5：缺铁6 d；6：映铁9 d
Fig．2 Northern analysis of朋 xiaojtaen~i．~10tal RNA th
wheatNramp gene as probe
：TnI RNA( [删 tc,~ts I lexves；b：Results of
Northern blol l：In⋯ 【 目目for 6 days oft~315：2：Contml ofm
3—6：LI熄 f 3：Contr~d：4：【ron sh s 3 da,~s：5：LrDD
slr 日 r 6 days：6：lmn s *for 9 da~s)
图3 小童诲棠中Nramp基因组DNA片段的PCR扩增结幂
I：【00 bp marker；2：小金海棠中Nramp基因组
DNA片段的PCR扩增产物
Fig．3 PCR r~u／ts ofNrtm~ genomicDNAfyag~ t-m
M．栅 em
I：l00 bp marker：2：PCR producl~ofNram~ge~omic
DNAf3~ tl ginM H
■
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362 园 艺 学 报 31卷
为模板，．扩增出了752 bp的特异性产物 (图3)。将该片段回收纯化后克隆于 pGEM-T载体并测序，
结果如图4。该基因被命名为MxNramp1基因 (Genbank登录号为AY188777)。
5’GGTTGTGACTGGGAAGCATCTTGCTGAGCACTGCAGGGATGAAI．ATCCCAAGGTCACAAACTTCATCTIlATGGATTCTTGCAGAACTGG
V V T G K H L A E H C R D E Y P K V T N F I L W I L A E L
CTGT GTTGCGTGCGACATTCCTGAAG W TGGAACCG( TTTGCTTTGAACATGCTCTTCAAAATTCCGA1．ATGGTGTGGTGTTCTCA1=
A V V A C D I P E V I G T A F A K N M L F K I P I W C G V L I
ACTGGGCTCAGCACTCTGATGCTCCTGTTCCTGCAACAATATGGGGTCCGTAAACTGG从 TTTCTGAT GCATTm GGTATTCTTGA1lAGC
T G L s T L M L L F L Q Q Y G V R K L E F L I A F L V F L I A
AACTTG●：TTCTT GTTGAACTTGGGTATTCTAAACCAAATTCTTCAGAAGTTGTGCGAGGCCTTTTTGTTCCTGAAATTAAAGGAGATGGAG
T C F L V E L G Y S K P N S S E V V R G L F V P E I K G D G
CTACAGGTCTTGC1．ATCTCACTACTTGGTGCTA『rGGTGATGCCGCAC从 TCTTTTTCTCCACTCAGCATTGGTACTGTCAAGAAAAGTACCA
A T G L A I S L L G A M V M P H N L F L H S A L V L S R K V P
CGATCAGTTCATGGGATCAAAGAGGCCTGTAGATTCTA，IlATGATTG从 AGTGCATTTGCCCTCACAGTAGCATTTCTGATCAACATCTCTAT
R S V H G I K E A C R F Y M I E S A F A L T V A F L I N I S I
CAI．ATCTGTT GTGGTGCAGTTTGCAGTGCAGA TTGAACCCTGAAGACCGGATG从 TTGC从 TGATCTAGATCTT从 CAAAGCTTCAT
I S V S G A V C S A D N L N P E D R M N C N D L D L N K A S
TCTTGTTAAAGAATGTCCTCGGAAATTGGAGCTCAAAGGTGTTCGCTATTGCCTTATGGGCATG3’
F L L K N V L G N W S S K V F A I A L W A
图4 小金海棠MxNrampl基因部分核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Fig．4 The partial nudeolide acid sequence and deduced gmino acid sequence for MxNrampl
gene ofMalus xiaojinensis Cheng et JiaⅡg
序列同源性比较表明，该 DNA片段与水稻 OsNramp3和拟南芥AtNramp1基因分别具有83％和
80％的氨基酸序列同源性。对小金海棠的MxNramp1基因片段与其他物种的Nramp基因家族成员之间
进行了多序列比对分析并绘制出了它们之间的进化树聚类分析图 (图5)。
试验为进一步通过反向PCR法或制备探针筛选基因组 DNA文库等方法克隆该基因的全长及进一
步研究其功能奠定了基础。
图5 MxNrampl与其他物种Nramp家族基因之间进化树聚类分析
Fig．5 Average distance ofMxNrampl wiU1Nramp family genes of other biology species
参考文献：
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5 戚金亮，韩振海，印莉萍，等．植物Nramp基因及其与金属离子转运的关系．生命科学，2003，15(1)：46～49
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