全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (6) : 1008～1012
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 01 - 06; 修回日期 : 2005 - 04 - 04
基金项目 : 国家发展与改革委员会项目 ; 科技部科技攻关项目 ( 2001BA502B09204) ; 河北省科技攻关项目 ( 04220111D ) ; 河北
农业大学科技将帅选拔培养计划和科研发展基金项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: kjliu@mail1hebau1edu1cn)
秋水仙素离体诱导冬枣和酸枣四倍体
王　娜　刘孟军 3 　代　丽　秦子禹
(河北农业大学中国枣研究中心 , 保定 071001)
摘 　要 : 以冬枣和酸枣组培苗丛芽为材料 , 研究了秋水仙素诱导染色体倍性变异的最佳浓度与时间组
合、多倍体的特征及其纯化技术。结果表明 : 秋水仙素处理的最佳组合为 50 mg·L - 1秋水仙素处理 40 d,
诱导酸枣和冬枣染色体加倍的频率分别达 36137%和 26167%。嵌合体经 3～4次继代分离得到了纯化 , 并
对纯化后的变异株进行了增殖和生根。变异株根尖染色体数加倍 (2n = 4x = 48) , 叶片增厚 , 栅栏组织、
海绵组织明显发达 , 茎尖 LⅠ、LⅡ和 LⅢ层细胞均显著变大 , 充分表明获得的变异株为同质四倍体。同质
四倍体的主要特征为 : 叶片增大 , 叶色浓绿 , 叶缘锯齿增大 , 保卫细胞增大 , 气孔密度降低。变异株在诱
导期间表现出生长缓慢、叶片变圆、节间变短的暂时现象。
关键词 : 枣 ; 酸枣 ; 秋水仙素 ; 四倍体
中图分类号 : S 66512　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0621008205
In V itro Tetraplo id Induction of Ziziphus ju juba ‘D ongzao’and Z. ac idoju2
juba ( Z. spinosa Hu) w ith Colch ic ine
W ang Na, L iu Mengjun3 , Dai L i, and Q in Ziyu
(Research Center of Chinese Jujube, A gricu ltura l U niversity of Hebei, B aoding 071001, Ch ina)
Abstract: In vitro tetrap loid induction of‘Dongzao’ ( Z iziphus ju juba M ill. ) and sour jujube ( Z.
acidoju juba C. Y. Cheng et. M. J. L iu) was studied by treating cluster buds with colchicines supp lemented
in medium. The results indicated that the highest induction rates of sour jujube and ‘Dongzao’were
36167% and 26167% , respectively, under op tim ized colchicines treatment combination of 50 mg·L - 1 for
40 d. After separated and subcultured 3 to 4 times, the chimeraswere effectively purified and the purified p la2
ntlets were p roliferated and rooted. The chromosome number of root2tip cells of the purified p lantlets was 2n =
4x = 48. The section of paraffin2embeded shoot ap ices and leaves showed that the tetrap loid leaveswere thicker
than dip loid, the fence tissue and sponge tissue are more upgrowth, and the cell size of each layer of the tetra2
p loid was larger than that of the dip loid, which p roved that the autotetrap loid was obtained. Compared with the
dip loid, the tetrap loid leaves showed bigger, darker and thicker with larger leaf serration and guard cell and
lower density of stomas. In addition, the induced p lantlets showed slower growth, smaller leaf index and shor2
ter internode during the course of induction, which was only a temporary phenomena.
Key words: Z iziphus ju juba; Z. acidoju juba ( Z. spinosa Hu) ; Colchicine; Tetrap loid
枣 ( Z iziphus ju juba M ill. ) 和酸枣 ( Z. acidoju juba C. Y. Cheng etM. J. L iu) 均是原产我国的特
色果树 , 具有重要的经济利用价值〔1〕。但二者的新品种选育工作还非常薄弱 , 目前仍基本停留在地
方品种选优阶段。枣杂交育种由于存在花小、去雄困难、早期胚败育、坐果率低等障碍 , 一直进展缓
慢。果树多倍体一般具有生长健壮、枝粗、叶厚、果大、少籽或无籽、产量高、适应性强和抗逆性强
等优点 , 且这些优点可通过无性繁殖得到保持。目前在园艺植物中已报道了一批自然产生或人工创造
的多倍体。赞皇大枣是目前发现的唯一自然三倍体枣品种〔1〕; 20世纪 80年代初期 , 山东省果树研究
　6期 王 　娜等 : 秋水仙素离体诱导冬枣和酸枣四倍体 　
所曾培育出了金丝小枣、圆铃枣、长红枣的胚乳三倍体植株〔2〕, 严仁玲等〔3〕在离体条件下获得了金
丝小枣的茎段四倍体材料。蒋洪恩等〔4〕在田间人工诱导获得了冬枣、辣椒枣的四倍体和八倍体材料 ,
但未完全纯化。迄今 , 尚无冬枣在离体条件下及酸枣在离体或田间条件下人工获得多倍体的报道。本
研究旨在探索一套将组织培养和秋水仙素诱变技术相结合 , 高效率人工诱导冬枣和酸枣多倍体的方法
及快速纯化技术体系。
1　材料与方法
试验于 2002～2004年在河北农业大学中国枣研究中心进行 , 试材为继代 1年的冬枣和 4号优系
酸枣组培苗 (2n = 2x = 24)。选取生长一致的组培苗剪切成双芽茎段 , 接种到增殖培养基 (冬枣 : MS
+BA 310 mg/L + IBA 012 mg/L; 酸枣 : MS +BA 210 mg/L + IBA 012 mg/L) , 增殖过程中选择含 3～5
个芽、高 1～115 cm的丛芽 , 接种到分别含秋水仙素 10、50和 100 mg/L的固体增殖培养基 (植物生
长调节剂浓度与增殖培养基相同 ) , 分别处理 10、20和 40 d, 以不含秋水仙素的培养基为对照。处
理完毕后 , 转入不含秋水仙素的增殖培养基中逐步进行嵌合体的分离。稳定后诱导生根 (冬枣 :
1 /2MS + IBA 210 mg/L; 酸枣 : 1 /2MS + IBA 110 mg/L)。
选取变异株与对照株组培苗从基部起第 3～5片叶 , 测量叶长、叶宽、叶面积、叶形指数 , 每次
测量 30片叶 , 求平均值。每叶片随机选取 20个视野 , 统计 125μm2 的气孔密度 , 换算成 1 mm2 气孔
数。用目镜测微尺测量保卫细胞的大小 , 统计其中的叶绿体数。游标卡尺测量二、四倍体组培苗从基
部起第 3～5节节间长度和茎粗 , 每次测量 30个节间和茎粗 , 求平均值。
将经过嵌合体分离纯化的植株进行生根诱导 , 采用去壁低渗法检测根尖的倍性 , 每个材料检测分
散好的分裂细胞 30个。
选取经根尖染色体鉴定的变异组培苗 , 石蜡切片法观察茎尖组织发生层 (LⅠ、LⅡ、LⅢ) 细胞
大小和叶片横切面结构。切片厚度为 8～10μm , 番红 —固绿染色。用显微测微尺在 400倍镜下测量
细胞大小 , 每个组织发生层测量 20个细胞 , 200倍镜下测量叶片厚度。
2　结果与分析
211　四倍体的诱导
如表 1所示 , 秋水仙素对冬枣和酸枣丛芽的
诱导效果因处理浓度和时间的不同而异。10 mg/L
的秋水仙素对丛芽伤害最小 , 但诱变效果较差 ,
即使延长处理时间也无法得到加倍植株。随着秋
水仙素处理浓度的增加 , 诱变效果逐渐增强 , 在
附加 50 mg/L秋水仙素的培养基中处理 40 d, 冬
枣和酸枣丛芽的加倍频率均最高 , 分别达
26167%和 36167%。但过高的秋水仙素浓度会对
丛芽产生较大的毒害作用 , 在含 100 mg/L秋水仙
素的培养基中处理 20 d, 16167%的冬枣和 10%
的酸枣丛芽因受毒害而死 , 即使已发生加倍的植
株也无法存活下来。
212　四倍体的形态及染色体数
21211　表观形态 　诱变初期变异株与对照株在整
体外观形态和生长势方面均有明显区别 , 变异株
生长缓慢 , 且常表现花叶现象 , 这一点可作为多
表 1　秋水仙素对 ‘冬枣’和酸枣丛芽的诱导效果
Table 1　 Induc ing effects of colch ic ine on cluster buds
of‘D ongzao’and sour jujube
种 /品种
Species/
cultivar
秋水仙素
Colchicine
(mg/L)
处理时间
Period of
treatment( d)
丛芽处理数
Number of
treated buds
致死率
Death
( % )
变异率
Mutated
( % )
酸枣 10 10 30 0100 0100
Sour jujube 20 30 0100 0100
40 30 0100 3133
50 10 30 0100 16167
20 30 3133 26167
40 30 6167 36167
100 10 30 6167 13133
20 30 10100 6167
40 30 10100 10100
冬枣 10 10 30 0100 0100
Dongzao 20 30 0100 0100
40 30 0100 0100
50 10 30 3133 16167
20 30 3133 20100
40 30 6167 26167
100 10 30 10100 13133
20 30 16167 6167
40 30 10100 10100
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
倍体初选的标志。当处理浓度过大、处理时间过长时 , 诱变材料容易出现畸形现象 , 表现为矮化丛
生、无伸长生长或分枝异常。变异株经 3～4次继代后基本稳定 , 表现为叶色浓绿、叶片和叶缘锯齿
增大。
需要指出的是 , 在以前的多倍体研究中 , 很多报道认为叶片变圆、节间变短是多倍体的显著特征
之一。本试验中处理材料在诱变期的确表现出类似的特征 , 如表 2所示 , 酸枣变异株初期叶形指数和
节间长度均显著小于二倍体植株。但当变异株逐渐恢复正常生长后与二倍体无显著差异。冬枣和酸枣
均表现同样的趋势。
表 2　二倍体和四倍体叶形指数和节间长度比较
Table 2　Com par ison of leaf index, leaf area and in ternode length between d iplo id and tetraplo id plan tlets
种 /品种
Species/cultivar
倍性
Ploidy
叶面积 A rea of leaves( cm2 )
诱变初期
Beginning of inducing
稳定期
Stable period
叶形指数 Leaf index
诱变初期
Beginning of inducing
稳定期
Stable period
节间长度 Internode length ( cm)
诱变初期
Beginning of inducing
稳定期
Stable period
酸枣 Sour jujube 4x 1161 a 2153 a 1109 b 1181 a 01531 b 01778 a
2x 1153 a 1153 b 1182 a 1182 a 01774 a 01774 a
冬枣 Dongzao 4x 2126 a 4149 a 1116 b 1171 a 01512 b 01691 a
2x 2123 a 2122 b 1176 a 1176 a 01698 a 01698 a
　　注 :表中数据用邓肯新复极差检测法 ,不同小写字母表示 5%水平。
Note: The data was tested by Duncanpis method, the different small letter indicates 5% level.
21212　解剖形态 　叶片气孔观察表明 , 四倍体气孔保卫细胞增大、密度减小 (图版 , B4、D4) , 保
卫细胞内叶绿体数目增多 (表 3)。茎尖石蜡切片表明 , 变异株各梢端切片组织发生层的 3层细胞大
小与对照株明显不同 , 四倍体的 LⅠ、LⅡ、LⅢ层细胞均显著大于二倍体 (表 3, 图版 , A3、B3)。
叶片解剖观察还表明 , 四倍体植株叶片增厚 , 栅栏组织、海绵组织均更加发达 (图版 , C3、D3)。
表 3　二倍体和四倍体叶片气孔及茎尖组织发生层细胞的比较
Table 3　Com par ison of stoma s and cell size of each layer of shoot2tip between d iplo id and tetraplo id
种 /品种
Species/cultivar
倍性
Ploidy
气孔密度
Density of stomas
(Number/mm2 )
保卫细胞 Guard cell
长 Length
(μm)
宽 W idth
(μm)
叶绿体数 Number of
chlorop lasts/mm2
茎尖细胞大小
Cell size of shoot tip (μm)
LⅠ LⅡ LⅢ
酸枣 Sour jujube 4x 29150 a 22152 a 34185 b 26130 a 8132 a 8134 a 8140 a
2x 15162 b 14185 b 105115 a 16135 b 5198 b 5194 b 6104 b
冬枣 Dongzao 4x 31105 a 21140 a 51130 b 30120 a 8106 a 8110 a 8104 a
2x 18123 b 16195 b 104110 a 16115 b 5102 b 5110 b 5116 b
21213　染色体数 　将经过嵌合体分离纯化的植株进行生根诱导 , 生根后对根尖进行染色体数目鉴定。
结果表明 , 对照株根尖染色体数 2n = 2x = 24 (图版 , A2、C2) , 变异株根尖染色体数加倍 , 2n = 4x
= 48 (图版 , B2、D2)。
本试验通过对变异株气孔 (来源于 LⅠ层 )、根尖 (来源于 LⅢ层 ) 染色体数目的检测结果表明 ,
LⅠ和 LⅢ层细胞染色体已加倍。叶片由原基的 LⅠ、LⅡ、LⅢ层共同组成 , 茎尖石蜡切片表明 3层
细胞均成功加倍。因此 , 本试验获得的变异株为同质四倍体。
213　四倍体的增殖与生根
本试验以丛芽为诱变材料 , 最初获得的变异多为嵌合体。利用组织连续切割分离的方法对嵌合体
进行继代分离 , 经 3～4次继代嵌合体得到充分分离 , 有效防止了回复突变。对经鉴定为四倍体的植
株进行增殖培养 , 冬枣的增殖培养基为 MS + BA 315 mg/L + IBA 012～016 mg/L; 酸枣的为 MS + BA
215 mg/L + IBA 012～016 mg/L , 增殖系数分别为 312和 316; 二倍体的增殖系数分别为 211和 213。
由此可见四倍体的增殖能力比二倍体强。
对经鉴定为四倍体的植株进行生根培养 , 冬枣的生根培养基为 1 /2MS + IBA 210 mg/L; 酸枣的为
1 /2MS + IBA 110 mg/L, 生根率均为 100% , 二倍体的生根率也为 100% , 但从根的形态看 , 二倍体的
根细长 (图版 , A5、C5) , 四倍体的根粗壮 (图版 , B5、D5)。
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　6期 王 　娜等 : 秋水仙素离体诱导冬枣和酸枣四倍体 　
图版说明 : A1～A5. 酸枣二倍体组培苗、染色体 ( 2n = 2x = 24) ( 3 000 ×)、茎尖石蜡切片 ( 400 ×)、气孔 ( 120 ×)、诱导生根 ;
B1～B5. 酸枣四倍体组培苗、染色体 (2n = 4x = 48) (3 000 ×)、茎尖石蜡切片 (400 ×)、气孔 (120 ×)、诱导生根 ; C1～C5. 冬
枣二倍体组培苗、染色体 (2n = 2x = 24) (3 000 ×)、叶片石蜡切片 (200 ×)、气孔 (120 ×)、诱导生根 ; D1～D5. 冬枣四倍体组
培苗、染色体 (2n = 4x = 48) (3 000 ×)、叶片石蜡切片 (200 ×)、气孔 (120 ×)、诱导生根。
Explana tion of pla tes: A1 - A5. Plantlets, chromosomes (2n = 2x = 24) (3 000 ×) , paraffin section of shoot tip (400 ×) , stomas (120 ×)
and rooting of dip loid sour jujube; B1 - B5. Plantlets, chromosomes (2n = 4x = 48) (3 000 ×) , paraffin section of shoot tip (400 ×) , stomas
(120 ×) and rooting of tetrap loid sour jujube; C1 - C5. Plantlets, chromosomes (2n = 2x = 24) ( 3 000 ×) , paraffin section of leaves ( 200
×) , stomas (120 ×) and rooting of dip loid Z. ju juba ‘Dongzao’; D1 - D5. Plantlets, chromosomes ( 2n = 4x = 48) ( 3 000 ×) , paraffin
section of leaves (200 ×) , stomas (120 ×) and rooting of tetrap loid Z. ju juba ‘Dongzao’.
3　讨论
形态观察是鉴定多倍体最简易最快捷的方法 , 可用于对变异株的初步筛选 , 能大大减少工作量。
多倍体植株的巨大性特征早已被许多研究多倍体的学者所证实〔4～6〕。本试验得到的多倍体组培苗也表
现了叶片增大、增厚、叶色加深等多倍体的一般特征。但在多倍体植株的叶形指数和节间长度变化方
面 , 本试验结果与以往研究有所不同 , 即变异株叶形指数、节间长度分别表现为先变小、变短 , 而后
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均恢复并保持稳定的现象。这种变化趋势可能是由于在诱变期植株受秋水仙素的抑制严重 , 伸长生长
受到限制 , 而一旦度过秋水仙素抑制期后植株又恢复生长 , 叶形指数和节间长度也随之恢复。但四倍
体组培苗移栽到大田后是否又会表现出叶片变圆、节间变短的现象 , 还需作进一步的研究。
在多倍体的诱导过程中 , 发生加倍效应的往往仅是部分细胞 , 嵌合体的产生是难以避免的。能否
对嵌合体进行及时有效的分离成为获得同质多倍体的关键因素。在离体条件下 , 嵌合体的分离可及时
进行 , 只需在工作台上将植株的变异部分分离继代 , 操作简便快捷 , 较田间诱变具有明显的优越性。
本试验在离体条件下首次获得了冬枣和酸枣的同质四倍体材料 , 为进一步培育果大、适应性强、综合
性状优良的枣和酸枣新品种特别是三倍体品种打下了良好基础。
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