全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (4) : 680～683
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 02 - 01; 修回日期 : 2005 - 06 - 06
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30370994)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: mym63@heinfo1net)
用 AFL P分子标记鉴定冬枣自然授粉实生后代杂种
的研究
鹿金颖 1 　毛永民 23 　申莲英 2 　彭士琪 2 　刘　敏 1
(1 中国科学院遗传与发育生物学研究所 , 北京 100101; 2 河北农业大学中国枣研究中心 , 保定 071001)
摘 　要 : 应用 AFLP技术对 65株冬枣自然授粉实生后代进行杂种鉴定 , 从 81对 EcoRⅠ和M seⅠ选择性
引物中筛选出 12对带型清晰且多态性较高的引物。用这 12对引物共扩增出 517条谱带 , 其中多态性带 376
条 , 多态性百分率为 7217%。共扩增出金丝小枣特征带 10条 , 鉴定出 34株冬枣 ×金丝小枣杂交实生苗 ;
扩增出尖枣特征带 7条 , 鉴定出冬枣 ×尖枣杂交实生苗 15株 ; 不能确定的有 16株。
关键词 : 枣 ; 实生后代 ; AFLP标记 ; 杂种鉴定
中图分类号 : S 66511　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0420680204
Applica tion of AFL P M arkers for Iden tif ica tion of Hybr ids from O pen Polli2
na ted D ongzao ( Zizyphus ju juba M ill. ) Progen ies
Lu J inying1 , Mao Yongm in23 , Shen L ianying2 , Peng Shiqi2 , and L iu M in1
(1 Institu te of Genetics and D evelopm ental B iology, Chinese A cadem y of Sciences, B eijing 100101, Ch ina; 2 Research Center of
Chinese Ju jube, A gricultural U niversity of Hebei, B aod ing 071001, Ch ina)
Abstract: The 65 open2pollinated‘Dongzao’ ( Z izyphus ju juba M ill. ) p rogenies were detected with
AFLP technique. Twelve pairs of p rimers which amp lified distinct and polymorphic segments were selected
from 81 pairs of EcoRⅠand M seⅠ p rimers. Then twelve pairs of p rimers were used in the AFLP analysis.
A ltogether 517 bands were p roduced among which 376 bands were polymorphic ones with the percentage of
polymorphism being 7217%. Ten markers were p resent only in ‘J insi Xiaozao’. Thirty2four hybrids from
‘Dongzao’בJ insi Xiaozao’were identificated. Seven markers were p resent only in ‘J ianzao’. Fifteen
hybrids from ‘Dongzao’בJ ianzao’were identificated. Sixteen p lants were not confirmed.
Key words: Chinese jujube; Progeny; AFLP marker; Identification of hybrid
1　目的、材料与方法
本试验采用 “空间隔离法 ”〔1〕, 先获得枣树自然授粉实生苗 , 再通过现代分子生物学技术对实生
苗进行杂种鉴定 , 解决了枣树人工杂交育种中因花小和人工去雄授粉操作困难 , 致使坐果率低而不易
获得杂种后代的困难 , 为枣树遗传育种工作提供了一个新的途径。
2000年 10月从河北省黄骅市林业局冬枣示范园 (面积 015 hm2 , 主栽品种 ‘冬枣 ’549株 , 授
粉品种 ‘金丝小枣 ’20株、‘尖枣 ’10株 , 授粉树以中心式在枣园中均匀种植。枣园周围 1 km内无
其它枣园和单株枣树。树龄 10年 , 均以 ‘酸枣 ’为砧木嫁接繁殖 ) 采集冬枣果实 , 取种仁。2001年
4月 15日播种于河北省邢台市任县太平庄枣育种园 , 得到 617株冬枣实生后代。
样品采集 : 2002年 9月 2日从 2年生冬枣实生后代中随机取样 65株 , 单株采样 , 采枣吊中上部
健康叶片 , 放入冰壶带回实验室 , 液氮速冻后保存于 - 70℃超低温冰箱中备用。母本冬枣、父本金丝
　4期 鹿金颖等 : 用 AFLP分子标记鉴定冬枣自然授粉实生后代杂种的研究 　
小枣和尖枣叶片采自河北省黄骅市林业局冬枣示范园。
叶片 DNA提取为 CTAB法〔2〕。AFLP试验程序在 Vos的基础上加以改进〔3, 4〕。
2　结果与分析
211　AFL P引物筛选
用 6组不同的 DNA 样品从 81对 EcoR Ⅰ和
M seⅠ选择性引物中筛选出 12对带型清晰且多态
性较高的引物。用 12对引物对冬枣、金丝小枣、
尖枣以及 65个冬枣实生后代进行扩增 , 结果见表
1。共扩增出 517 条 AFLP谱带 , 多态性带 376
条 , 多态性百分率为 7217%。
212　冬枣 ×金丝小枣、冬枣 ×尖枣杂种鉴定
以引物对 7为例介绍杂种鉴定过程。如图 1
所示 , 冬枣和尖枣没有金丝小枣特有的两条 DNA
片段 ACCCAT18 ( 172 bp ) 和 ACCCAT19 ( 170
bp) , 冬枣实生后代中 2、4～6、9、11、19、20、
24～26、29、30、37、38、41、43、45～47、49、
表 1　冬枣实生后代 12对引物选择性扩增结果
Table 1　Result of AFL P selective am plif ica tion by twelve
selecting pr im er pa irs of‘D ongzao’progeny
引物对
编号
Primer
pairs
EcoRⅠ
引物
EcoRⅠ
p rimers
M seⅠ
引物
M seⅠ
p rimers
扩增
条带
Total
bands
多态性条带
Polymorphic
band
多态性百分率
Percentage of
polymorphic band
( % )
1 ACC CCA 31 20 6415
2 AAC CCT 56 44 7816
3 AGG CCC 42 39 9219
4 ACT CAT 51 37 7215
5 ACA CAT 52 42 8018
6 AAG CCC 43 36 8317
7 ACC CAT 42 28 6617
8 AAC CAT 45 34 7516
9 AAC CTG 43 26 6015
10 AAC CTA 43 27 6218
11 ACT CTT 37 20 5411
12 ACT CTG 32 23 7119
54、57、60、61、63共 26株具有这两条金丝小枣特征带 ; 尖枣有两条特有的 DNA片段 ACCCAT20
(169 bp)、ACCCAT21 (167 bp) , 冬枣和金丝小枣都不具有 , 冬枣实生后代中 3、16、20、27、34、
35、48、53、59、65共 10株具有这两条尖枣特征带。20号植株既具有金丝小枣的特征带 , 又具有尖
枣的特征带 , 我们把 20号植株列为不能确定的一类。
图 1　引物对 7 ( E: ACC, M : CAT) 扩增的金丝小枣和尖枣部分特征带在冬枣实生后代中的分离情况
A: 冬枣 , B: 金丝小枣 , C: 尖枣 ; 1～65: 冬枣实生后代植株 , M: pBR322 DNA /M sp Imarkers。
F ig. 1　Segrega tion of som e markers presen t on ly in ‘J in si X iaozao’and markers presen t on ly in ‘J ianzao’genera ted
in ‘D ongzao’progeny by pr im er pa irs ( E: ACC, M : CAT)
A: Dongzao, B: J insi Xiaozao, C: J ianzao; 1 - 65: The‘Dongzao’p rogeny, M: pBR322 DNA /M sp Imarkers.
如表 2所示 , 6对引物扩增出 10条金丝小枣特征带 , 冬枣实生后代中 1、2、4、5～ 7、9～11、
14、18～20、22～26、28～33、36～41、43～ 47、49、50、54、55、57～63共 46株具有金丝小枣特
征带 ; 4对引物扩增出 7条尖枣特征带 , 冬枣实生后代中 1、3、8、12、13、15～17、20、21、27、
28、34、35、39、40、41、48、52、53、56、57、59、64、65共 25株具有尖枣特征带。
由表 3可见 , 冬枣实生后代中有 8株既有金丝小枣又有尖枣的特征带 , 将这 8株归为不能确定的
一组。如 57号植株 , 有 4条金丝小枣的特征带 , 1条尖枣的特征带 , 我们分析 57号植株是冬枣 ×金
丝小枣后代的可能性大 , 出现的 1条尖枣的特征带可能是配子形成过程中染色体的不等价交换或其他
原因造成的 , 可能不是真正的尖枣特征带 , 因此这类植株也归为不能确定的一类 , 有待进一步研究证
实。冬枣实生后代中共 9株出现了冬枣、金丝小枣、尖枣没有的特征带 , 这些特殊标记可能由于配子
形成过程中染色体的不等价交换产生的新序列或其他原因造成的 , 因此将这 9株归为不能确定的一
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
类。其中 28、41、59号植株更加特殊 , 谱带中既有金丝小枣的特征带又有尖枣的特征带 , 同时还出
现了新带 (冬枣、金丝小枣、尖枣没有的特征带 ) , 也归为不能确定的一类。42和 51号植株即不具
有金丝小枣的特征带又不具有尖枣的特征带。以上几种类型均不能确定为冬枣 ×金丝小枣、冬枣 ×尖
枣杂交实生苗。
表 2　用于冬枣实生后代杂种鉴定的 AFL P特征带
Table 2　AFL P markers used to iden tify hybr ids from the‘D ongzao’progeny
引物对编号
Primer pairs
金丝小枣特征带
Markers p resent only in‘J insi Xiaozao’
尖枣特征带
Markers p resent only in‘J ianzao’
1 ACCCCA5 (275 bp)
4 ACTCAT27 (150 bp)
5 ACACAT33 (140 bp)
7 ACCCAT18 (172 bp) , ACCCAT 19 (170 bp) ACCCAT20 (169 bp) , ACCCAT 21 (167 bp) , ACCCAT45 (95 bp)
8 AACCAT36 (124 bp) , AACCAT 37 (123 bp)
9 AACCTG18 (165 bp) , AACCTG41 (103 bp)
10 AACCTA21 (155 bp) , AACCTA22 (153 bp)
11 ACTCTT42 (81 bp) , ACTCTT43 (79 bp)
12 ACTCTG30 (120 bp)
表 3　冬枣实生后代杂种鉴定结果
Table 3　 Iden tif ica tion of hybr ids in‘D ongzao’progeny
冬枣 ×金丝小枣杂交
实生苗 Hybrids from
‘Dongzao’בJ insi Xiaozao’
冬枣 ×尖枣杂交
实生苗 Hybrids of
‘Dongzao’×
‘J ianzao’
既有金丝小枣特征带
又有尖枣特征带的植株
Plants with markers
p resent in both‘J insi
Xiaozao’and‘J ianzao’
冬枣、金丝小枣、尖枣
都没有的特征带的植株
Plants with markers no
p resent in‘Dongzao’,
‘J insi Xiaozao’and‘J ianzao’
既不具有金丝小枣的特征
带又不具有尖枣的特征带
的植株 Plants without markers
p resent in both‘J insi Xiaozao’
and‘J ianzao’
2, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14, 18,
19, 22, 23, 24, 25, 26, 29,
30, 31, 32, 36, 37, 38, 43,
44, 47, 49, 50, 54, 55, 58,
60, 61, 62, 63
3, 8, 12, 13,
15, 16, 17, 21,
27, 34, 35, 48,
52, 53, 56
　
1, 20, 28, 39, 40,
41, 57, 59
　
　
　
10, 28, 33, 41, 45,
46, 59, 64, 65
　
　
　
42, 51
　
　
　
　
　　注 : 1～65: 冬枣实生后代植株。Note: 1 - 65: The‘Dongzao’p rogeny.
鉴定出冬枣 ×金丝小枣杂交实生苗 2、4～7、9、11、14、18、19、22～26、29～32、36～38、
43、44、47、49、50、54、55、58、60～63共 34株 , 冬枣 ×尖枣杂交实生苗 3、8、12、13、15～
17、21、27、34、35、48、52、53、56共 15株 (表 3) , 不能确定的 1、10、20、28、33、39、40～
42、45、46、51、57、59、64、65共 16株。
使用纯合显性标记 , 只需一个即可鉴定出全部的普通型杂种后代 , 如果使用杂合的显性标记要鉴
定出 97%的有性杂种 , 至少要使用 5个父本标记。因为理论上每个标记只能鉴定出 50%的有性杂种 ,
这样标记 Ⅰ50% +标记 Ⅱ25% +标记 Ⅲ1215% +标记 Ⅳ6125% +标记Ⅴ3113% = 9619% (共需 5个杂
合显性标记 )〔5〕。本试验中鉴定冬枣 ×金丝小枣杂种时共用了 10个金丝小枣标记 ; 鉴定冬枣 ×尖枣
杂种时共用了 7个尖枣标记 , 虽然这些标记均为杂和的显性标记 , 但在杂种鉴定中所用的标记数是足
够的。
冬枣是优良的鲜食品种 , 果实种仁率较高 , 为 35% , 并且冬枣实生后代中杂种率很高 , 因此冬
枣适合于作母本进行杂交育种。
参考文献 :
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Zhang K C, L i R Q, B i X Y, Yin S P, W u L P, J ing S X. Sexual hybrid identification in apom ictic‘Pingyitiancha’ seedlings using RAPD
markers. Journal of Agricultural B iotechnology, 1997, 5 (4) : 392～396 ( in Chinese)
收稿日期 : 2005 - 03 - 01; 修回日期 : 2005 - 05 - 23
基金项目 : 韩国农林部尖端技术开发事业课题 (104320) ; 上海理工大学博士启动基金
新高梨贮藏期间糖、有机酸和多酚类物质的变化
张赟彬 1 　崔 　清 2 　 (1 上海理工大学食品与生物技术研究所 , 上海 200093; 2 韩国岭南大学食品科技系 , 大邱 )
Changes of Sugars, Organ ic Ac ids and Polyphenols in Singo Pear dur ing Storage
Zhang Ynubin1 and Cui Q ing2 ( 1 Institu te of Food and B iotechnology, U niversity of Shanghai for Science and Technology,
Shangha i 200093, China; 2D epartm en t of Food Science and Technology, Yeungnam U niversity, South Korea)
关键词 : 梨 ; 糖 ; 有机酸 ; 多酚类化合物 ; 贮藏
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0420683201
‘新高梨 ’ ( Pyrus pyrifolia Nakai var. ) 于 2003年 9月 18日和 10月 2日采自韩国那州庆山梨园 , 树龄 8～9年。果
实成熟后采收健康整齐的果实 , 用聚乙烯薄膜包装在 4℃冷藏库贮藏 7个月。试验在韩国岭南大学食品科技系食品化
学实验室完成。测定了新高梨果皮、果肉和果心 3部分在贮藏期间糖 (HPLC法 )、有机酸 (气相色谱法 ) 和多酚类
物质 ( Folin - Ciocalteu法 ) 的含量变化。
结果 (表 1) 表明 , 新高梨在贮藏期间 , 果皮、果肉和果心中糖含量的变化相似 , 以果糖最多 , 且 3种糖含量均
随着贮藏期的延长而增加。果肉中没能检出蔗糖 , 果心中贮藏 2个月后检出蔗糖 , 且逐渐增加。单糖类随着贮藏期的
延长而增加 , 可能与双糖和多糖的分解有关。本试验测定了 4种非挥发性有机酸含量的变化。果皮中延胡索酸含量最
多 , 且逐渐减少。果肉中以琥珀酸的含量为最多 , 也在贮藏期间渐渐减少。果心部分苹果酸含量最多 , 且逐渐增加。
本试验表明 , 果皮中含有多酚类物质最多 , 果心次之 , 果肉最少 , 均随着贮藏时间的延长而增加 , 以果心部分的增加
最为显著 , 说明多酚类物质在贮藏期间不断积累。多酚类物质具有抗氧化、清除自由基等作用 , 因此将食品厂加工后
的梨果渣 (主要是果皮和果心 ) 用于多酚类物质的开发 , 可能有较好的价值 , 有待进一步的研究。
表 1　新高梨 4℃贮藏期间糖、有机酸、多酚含量的变化
Table 1　Changes of sugars, organ ic ac ids and polyphends in S ingo pear dur ing storage a t 4℃
贮藏时间
Storage time
(Month)
部位
D ifferent
part
果糖
Fructose
( % )
葡萄糖
Glucose
( % )
蔗糖
Sucrose
( % )
柠檬酸
Citric acid
(mg/mL)
苹果酸
Malic acid
(mg/mL)
琥珀酸
Succinic acid
(mg/mL)
延胡索酸
Fumaric acid
(mg/mL)
多酚
Polyphenol
(mg/g)
0 果皮 Fruit skin 6172 1126 0138 - 31229 351194 51580 56
果肉 Flesh 7109 1143 - 01446 21784 71528 31379 4
果心 Fruit core 5168 1133 - 21742 21040 101898 01173 20
1 果皮 Fruit skin 7141 1135 0146 - 31105 341275 41770 63
果肉 Flesh 7126 2188 - 01469 21649 61924 21924 4
果心 Fruit core 5183 1185 0109 21833 21149 111138 01170 20
2 果皮 Fruit skin 7192 1182 0147 - 31029 321679 41238 70
果肉 Flesh 8126 2194 - 01495 21469 51338 21765 7
果心 Fruit core 6128 2197 0110 21916 21190 121565 01165 22
3 果皮 Fruit skin 8106 1188 0151 - 21996 311825 21732 71
果肉 Flesh 8158 3106 - 01510 21430 41822 21433 7
果心 Fruit core 6149 2138 0111 21917 21840 131925 01177 25
4 果皮 Fruit skin 8167 2134 0156 - 21917 301016 11808 71
果肉 Flesh 8181 3137 - 01651 21251 31244 31807 7
果心 Fruit core 6169 2154 0113 31341 31840 141758 01146 30
5 果皮 Fruit skin 8168 2141 0158 - 21896 291861 11682 72
果肉 Flesh 8192 3146 - 01662 21248 41808 31858 8
果心 Fruit core 7121 2167 0118 31341 31941 141792 01142 31
6 果皮 Fruit skin 8172 2146 0160 - 21763 291803 11627 63
果肉 Flesh 9103 3158 - 01693 21240 41622 31901 8
果心 Fruit core 7136 3106 0123 31416 31948 151029 01140 31
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