全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (4) : 604～608
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 12 - 27; 修回日期 : 2005 - 05 - 233 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: hengz@ sdau1edu1cn)
‘蛇龙珠 ’等酿酒葡萄品种的 DNA分析
姚玉新 1 　左方梅 1 　翟　衡 13 　刘来馨 2
(1 山东农业大学园艺科学与工程学院 , 泰安 271018; 2 烟台中粮长城葡萄酒公司 , 蓬莱 265608)
摘 　要 : 为了进一步明确蛇龙珠品种的来源和亲缘关系 , 利用 36个 RAPD引物对 14个酿酒葡萄品种
基因组 DNA扩增 , 通过聚类分析将其划分为 4个类群 , 其中赤霞珠、品丽珠、美乐和蛇龙珠同属于一个类
群。利用 SSR技术对该类群 (含 3个不同地区来源的蛇龙珠 ) 进一步分析结果表明 : 蛇龙珠、赤霞珠、品
丽珠和美乐是 4个独立的品种 , 遗传距离最大的是品丽珠和赤霞珠 , 为 3146, 遗传距离最近的是美乐与品
丽珠 , 遗传距离为 2140。就蛇龙珠不同类型而言 , 3个不同地区来源的蛇龙珠遗传上存在差异 (欧氏遗传
距离在 1141～1173之间 ) , 但明显小于与其他品种的差异。与其他品种相比 , 3个地区的蛇龙珠都与品丽
珠遗传距离最近 (2145～2164) , 都与赤霞珠最远 (2183～3132)。
关键词 : 葡萄 ; RAPD; SSR; 聚类分析 ; 起源
中图分类号 : S 66311　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0420604205
The RAPD and SSR Ana lysis of ‘Cabernet Shelongzhu’and O ther W ine
Grape Cultivars
Yao Yuxin1 , Zuo Fangmei1 , Zhai Heng13 , and L iu Laixin2
(1 College of Horticultural Science and Engineering, Shandong A gricultural U niversity, Ta ipian 271018, China; 2 Yanta i CO FCO
W inery, Penglai 265608, Ch ina)
Abstract: ‘Cabernet Shelongzhu’ is an important grape cultivar in China used for wine. However, its
genetic origin is not clear yet. In this study, depending on the RAPD (Random Amp lification Polymorphism
DNA ) analysis with 36 p rimers, 14 wine grape cultivars were classified into four group s by UPGMA ( un2
weighted pair group method using arithmetic average) cluster analysis. Four cultivars of them, i. e. Cabernet
Sauvignon, Cabernet Shelongzhu, Cabernet Franc and Merlot, belonged to the same group. The SSR ( Simp le
Sequence Repeat) analysis further indicated that they were four independent cultivars. A lso, the results from
SSR analysis showed that three phenotypes of‘Cabernet Shelongzhu’ samp led from different regions were ge2
netically distinct with Euclidean distances ranging from 1141 to 1173, which were much smaller than those a2
mong distinct cultivars. Comparing with other cultivars, the phenotype of Cabernet Shelongzhu from Beigou at
Penglai was the closest to Cabernet Franc with the Euclidean distance of 2145, and followed by Changli and
Yantai with the Euclidean distances of 2156 and 2164, respectively. The historical origin of the cultivar
‘Cabernet Shelongzhu’was investigated and discussed.
Key words: Grape; RAPD; SSR; Cluster analysis; H istorical origin
葡萄是大宗果品中加工比例最高的水果 , 与其他果树品种追新求变不同 , 酿酒葡萄品种受葡萄酒
文化的制约而恪守传统甚至于保守。我国最早的酿酒葡萄品种是 1892年张裕公司建厂后从欧洲引进
的 , 其中包括赤霞珠、品丽珠、蛇龙珠 , 生产上俗称 “三珠 ”。“三珠 ”成为我国红色酿酒葡萄的代
表 , 特别自 20世纪 90年代末红葡萄酒盛行以来 , 赤霞珠和蛇龙珠成为发展酿酒葡萄的首选品种。
在很长一段时间内国内同行都认为蛇龙珠与其他二珠一样也是法国品种。随着国际交流的增加 ,
欧洲葡萄专家否认了蛇龙珠在法国的存在 , 阿根廷专家在考察了昌黎的蛇龙珠后认为蛇龙珠就是品丽
　4期 姚玉新等 : ‘蛇龙珠 ’等酿酒葡萄品种的 DNA分析 　
珠〔1〕。国内有关专家在研究了蛇龙珠的形态特征以后也认为其与品丽珠很相似 , 可能是引进时品种
混淆或以后发生变异〔1, 2〕。近年随着引种繁殖增加 , 人们发现各地栽培的蛇龙珠形态也有明显差异 ,
更加希望澄清蛇龙珠的身份 , 而单纯形态学分析很难确认蛇龙珠的来源。本试验收集了与蛇龙珠有渊
源关系的波尔多栽培品种以及其他已知起源于同一个家族或关系密切的不同品种群共 14个品种进行
了遗传关系分析 , 并利用 SSR技术重点对 Cabernet家族品种做进一步地遗传考证 , 以便从基因型上
明确蛇龙珠的地位。
1　材料与方法
111　供试材料
RAPD分析所用 14个品种为 : 1高特 (Cot)、2佳利酿 (Carignan)、3西拉 ( Syrah)、4黑比诺
( Pinot Noir)、5白比诺 ( Pinot B lanc)、6贵人香 (R iesling Italian)、7白诗南 (Chenin B lanc)、8雷
司令 (R iesling)、9赤霞珠 ( Cabernet Sauvignon)、10蛇龙珠 (烟台当地品种 ) ( Cabernet Shelong2
zhu)、11品丽珠 (Cabernet Franc)、12美乐 (Merlot)、13白索味浓 ( Sauvignon B lanc) 和 14霞多丽
(Chardonnay)。
SSR分析所用试材为 : G01, 法国引进的赤霞珠 ; G02, 昌黎栽培的蛇龙珠 ; G03, 品丽珠 ;
G04, 烟台本地栽培的蛇龙珠 ; G05, 美乐 ; G06, 蓬莱北沟蛇龙珠。
所选繁殖材料为葡萄枝条 , 温室催芽 , 取刚萌发的芽或幼叶作为提取 DNA的材料。
112　D NA的提取、扩增及电泳
DNA的提取参照遆卫国〔3〕、王跃进等〔4〕的方法 , 略有改动。
RAPD扩增 : 反应体系 25 μL, 分别为 215 μL 10 ×buffer, 210 mmol/L MgCl2 , 100 μmol/L
dNTPs, 012μmol/L 引物 , 115 U Taq DNA聚合酶及 10～15 ng模板 DNA。热循环程序为 : 94℃预变
性 1 m in 45 s, 94℃变性 30 s, 36℃退火 45 s, 72℃延伸 2 m in, 45个循环 , 72℃延伸 10 m in。
SSR扩增 : VVMD系列为反应体系 20μL, 分别为 210μL 10 ×buffer, 110 mmol/L MgCl2 , 200
μmol/L dNTPs, 20 pmol引物 , 015 U TaqDNA聚合酶及 10 ng模板 DNA。热循环程序为 : 94℃预变性
2 m in, 92℃变性 30 s, 52℃退火 30 s, 72℃延伸 2 m in, 40个循环 , 72℃延伸 7 m in。VVS系列为反
应体系 10μL, 分别为 110 μL 10 ×buffer, 115 mmol/L MgCl2 , 200 μmol/L dNTPs, 25 pmol引物 ,
01625 U Taq DNA聚合酶及 25 ng模板 DNA。热循环程序为 : 95℃预变性 5 m in, 94℃变性 1 m in,
50℃退火 50 s, 50～72℃ 1 m in, 72℃延伸 1 m in, 26个循环 , 72℃延伸 7 m in。
RAPD扩增产物用 112%琼脂糖凝胶电泳分离 , 经溴化乙锭染色后用紫外凝胶成像系统分析。
SSR扩增产物 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染观察。
113　数据分析
利用欧氏距离系数法计算遗传距离 (D ) , 根据遗传距离 D值 , 利用分析统计软件 STATISTACA
对各品种进行 UPGMA (非加权算术平均法 ) 聚类分析。
2　结果与分析
211　14个酿酒葡萄品种的 RAPD分析
21111　RAPD分析 　选用发表过的、在葡萄上具有多态性的 36个引物〔5～7〕, 分别对 14个酿酒葡萄品
种进行扩增 , 筛选出 14个扩增谱带清晰且多态性好的引物用于进一步分析 (表 1)。14个引物共扩
增出 137条 DNA带 , 平均每个引物 918条 , 其中 98条具有多态性 , 占总条带数的 7115% ; 每个引物
可扩增出 3～10条多态性带 , 平均 7条。其中引物 X102多态性谱带最多 (13条 ) , 而多态性谱带百
分率最高的是 S462和 S347 (图 1) , 各为 8819%。
21112　品种间遗传距离及聚类分析 　通过聚类分析以 610水平将 14个品种分成 4类 (图 2) , 类群 1
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为霞多丽、白比诺、黑比诺、雷司令、贵人香、
白诗南和西拉 ; 类群 2为白索味浓和佳利酿 ; 类
群 3为赤霞珠、品丽珠、蛇龙珠、美乐 ; 类群 4
为高特。利用 RAPD标记计算不同品种的欧氏距
离 , 14个品种欧氏距离在 3132～7148之间 , 其
中美乐和品丽珠的遗传距离最近为 3132, 蛇龙珠
　　 表 1　所筛选的 RAPD引物序列及扩增结果
Table 1　The sequence and results of selected RAPD pr im ers
引物
Primer
序列
Sequence
扩增谱带数
Number of
amp lified
bands
多态性谱带数
Number of
polymorphic
bands
多态性
Rate of
polymorphic
bands( % )
S238 TGGTGGCGTT 10 6 6010
S462 TCGGCACGCA 　9 8 8819
S347 CCTCTCGACA 　9 8 8819
S450 TCAGAGCGCC 　9 4 4414
S35 TTCCGAACCC 10 9 8710
S119 CTGACCAGCC 　9 7 7718
S262 ACCCCGCCAA 12 9 7510
S94 GGATGAGACC 　9 7 7718
S445 CCCAGTCACT 　9 4 4414
S446 CCACGGGAAG 10 8 8010
X102 TACCGTGGCG 13 10 7619
X101 TTTGCCGCCC 11 6 5415
X105 CCACACGTAG 11 9 8118
X115 CGCGTTCCTG 　6 3 5010
总计 Total 137 98 7115 图 1　RAPD引物 S347扩增图谱M. PCR marker; 1～14为供试材料 , 图 2同。F ig. 1　The am plied results of RAPD pr im ers S347M. PCR marker; 1 - 14. Experimental samp le numbers of materials图 2　14个酿酒葡萄品种的 UPGM A聚类分析结果
F ig. 2　The UPGM A cluster ana lysis of 14 w ine grapes
和黑比诺的遗传距离最远为 7148。在解百纳类型中蛇龙珠和品丽珠的遗传距离比较近 (5120) , 其次
是和美乐 (6100) , 和赤霞珠最远 , 为 6124。可见该 4个品种在遗传上存在明显差异 , 但又有着密切
的关系 , 都属于解百纳家族。
212　赤霞珠、品丽珠、美乐及不同地区栽培蛇龙珠的 SSR分析
21211　SSR分析 　利用 12对 SSR引物对 3个不同地区来源的蛇龙珠、赤霞珠、品丽珠及美乐共 6个
品种 (类型 ) 进行扩增分析。12对 SSR引物筛选出 9对多态性的引物 (表 2) , 9对引物共扩增出 27
条 DNA带 , 其中 22条具有多态性 , 占总条带数的 8114%。每对多态性引物可扩增出 1～5条带 , 平
均 214条 , 其中引物 VMD6多态性最好 (图 3) , 扩增出 5条多态性带。
表 2　所筛选的 SSR引物序列及扩增结果
Table 2　The sequence and results of selected SSR pr im ers
引物对
Primer
序列 (5pi- 3pi)
Sequence
扩增带数
Number of
amp lified bands
多态性带数
Number of
polymorphic bands
多态性 Rate
of polymorphic
bands( % )
VMD5 CTAGAGCTACGCCAATCCAA　TATACCAAAAATCATATTCCTAAA 4 4 100
VMD6 ATCTCTAACCCTAAAACCAT　CTGTGCTAAGACGAAGAAGA 5 5 100
VMD7 AGAGTTGCGGAGAACAGGAT　CGAACCTTCACACGCTTGAT 4 4 100
VMD8 TAACAAACAAGAAGAGGAAT　AGCACATCCACAACATAATG 3 2 66
VVS1 ACAATTGGAAACCGCGTGGAG　CTTCTCAATGATATCTAAAACCATG 2 1 50
VVS2 CAGCCCGTAAATGTATCCATC　AAATTCAAAATTCTAATTCAACTGG 4 3 75
VVS3 TGCCCTATCAATTAGTTCACCTA　TCGACTTTGATATATTGATGATT 2 1 50
VVS4 CCATCAGTGATAAAACCTAATGCC　CCCACCTTGCCCTTAGATGTTA 2 1 50
VVS5 ATTGATTTATCAAACACCTTCTACAT　TAGAAAGATGGAAGGAATGGTGAT 1 1 100
总计 Total 27 22
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图 3　SSR引物 VMD6扩增图谱
M. PCR marker; G01～G06为供试材料 , 图 4同。
F ig. 3　The am plied results of SSR pr im er pa irs VMD6
M. PCR marker; G01 - G06. Experimental sample numbers of materials
图 4　不同类型蛇龙珠和其他品种的 UPGM A聚类分析结果
F ig. 4　C luster results of three phenotyp ic Cabernet Shelongzhu
and other cultivars
21212　品种 (类型 ) 间遗传距离及聚类分析 　SSR分析结果表明蛇龙珠 3个类型在遗传上存在差异 ,
并不是完全相同 , 昌黎的蛇龙珠和蓬莱北沟的蛇龙珠较近 , 遗传距离为 1141; 昌黎的蛇龙珠、蓬莱
北沟的蛇龙珠和烟台本地蛇龙珠较远 , 遗传距离都为 1173。但蛇龙珠品种之间的遗传差异明显小于
蛇龙珠品种和其他品种之间的差异 , 蛇龙珠与品丽珠最近 , 遗传距离在 2145～2164之间 , 其中蓬莱
北沟的蛇龙珠与品丽珠遗传距离最小 ( 2145) , 烟台本地的蛇龙珠与品丽珠遗传距离最大 ( 2164)。
烟台本地、昌黎和蓬莱北沟三地的蛇龙珠都与赤霞珠最远 , 遗传距离分别为 2183、3100和 3132。
就 6个品种 (类型 ) 而言 (不包含蛇龙珠 3个类型之间 ) , SSR分析结果表明 , 遗传距离最近的
是美乐与品丽珠 , 遗传距离为 2140, 这与 14个品种 RAPD分析结果一致 ; 遗传距离最大的是赤霞珠
和品丽珠 , 为 3146, 与 14个品种的 RAPD分析结果不一致 , 其遗传距离最大的是赤霞珠和蛇龙珠 ,
为 6124。
在聚类图上 (图 4) , 我们以 215水平将 6品种 (类型 ) 分成 3类 , 类群 1由不同来源的蛇龙珠
构成 , 类群 2由品丽珠和美乐构成 , 类群 3由赤霞珠构成。
3　讨论
311　蛇龙珠、赤霞珠、品丽珠及美乐的亲缘关系分析
从本文结果可以看出 , 14个酿酒葡萄品种的分类基本上和传统的栽培学分类相一致 , 也和葡萄
品种的地理 /产地分布基本符合。
有关蛇龙珠与其他 3个品种的亲缘关系 , 前人仅进行了形态学分析和栽培学比较 , 本试验通过
RAPD和 SSR标记技术分析的结果认为 , 蛇龙珠属于解百纳家族的一员 , 是一个独立的品种 , 蛇龙珠
的基因型和品丽珠、美乐和赤霞珠之间的遗传关系比较近 , 但差异很明显 ; 和供试的其他酿酒葡萄品
种则差异较大。蛇龙珠品种存在较多的生态变异类型 , 类型间也存在着较明显的基因型差异。张裕公
司采用液相、气相色谱、质谱等分析技术确定了构成张裕解百纳葡萄酒的蛇龙珠品种有 4个不同的类
型。
赤霞珠、品丽珠及美乐都起源于法国西部 , Bowers等〔7〕用 RFLP等分子标记技术对 3个品种进行
了亲缘关系研究 , 认为赤霞珠和品丽珠的亲缘关系最近 , 其次是和美乐。随后的研究发现赤霞珠是白
索味浓和品丽珠杂交后代〔8〕。而本研究用 SSR标记获得的结果认为 , 美乐和品丽珠的亲缘关系最近 ,
其次才是和赤霞珠。这也证明不同地区的同一栽培品种可能会有差别〔9〕。
312　关于蛇龙珠来源的探讨
1892年张弼士在烟台创建张裕葡萄酿酒公司 , 随后从欧洲引进 129个酿酒品种的苗木栽培于烟
台西山和东山葡萄园。由于以外文记名不便 , 公司给每个品种进行了编号。葡萄结果之后 , 公司邀请
文人给品种命名 , 就这样产生了各种富有诗意的葡萄品种中文名称并一直沿用至今 : 1#玛瑙红 , 2#大
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宛红 , 3#大宛香 , 4#品丽珠 , 5#蛇龙珠 , 6#赤霞珠 , 7#冰雪丸 ⋯17#雷司令 , 18#李将军 ⋯25#贵人香
⋯72#紫北塞 ⋯129#玫瑰香。直到上世纪的 70年代 , 张裕公司葡萄园的老工人还能准确地把葡萄编号
和名称对应起来。因此可以肯定最早蛇龙珠和赤霞珠、品丽珠及美乐都是当时张裕公司同时引进并命
名的。
然而有关蛇龙珠的来源仍然疑窦丛生。首先是苗木的来源 /输出国问题。由于没有原始的档案保
留 , 在最早的记录 (张裕公司葡萄品种特性记载 , 1957, 油印资料 ) 中写明从欧洲 (法国、意大利 )
进口。而我们推测苗木从法国进口的可能性小于从奥地利进口的可能性 , 理由之一是 , 有的品种如蛇
龙珠是用德语标注的 Cabernet Gernischt, 这些标注应是在出口国内完成的 , 不是到达烟台后才写的 ;
但是据考证 , 这一词的含义 , 按德文应是 “混杂的 Cabernet”〔1〕。理由之二是 , 进口的品种包含了东、
西欧多个国家的原产品种 , 具有明显的第三国引种迹象。因此合理的推测是这些品种是由奥地利从各
国引种栽培的 , 后来因张裕公司的需求而出口到了中国。
关于蛇龙珠的多型性问题 , 根据张裕公司退休的老工程师冯贻标先生回忆 , 当他 1952年进入张
裕公司时葡萄园还保留有 32个号的品种 , 老工人对他说当时进口的葡萄品种里有很多具有生草味或
Cabernet味的品种。后来工作中他发现 , 仅在蛇龙珠编号种植的小区内就有多个类型 , 以第一种果穗
较大 , 果粒也较大 , 丰产性好 , 是当时烟台地区推广繁殖的主要类型 , 但在需要量大时其他类型的枝
条也流入社会 , 因此造成了现在各地栽培的蛇龙珠类型不一致的现象。
由以上研究可以推论 : 蛇龙珠主要是从输出国完成了品种变异和变型 , 葡萄品种在栽培中发生生
物型变异是常有的事 , 国外已经开展了大量的品种品系鉴定 , 如法国的赤霞珠有 15个品系 , 黑比诺
有 45个品系 , 我国在这方面的研究还是空白 ; 蛇龙珠是与品丽珠亲缘关系很近的品种 , 但要确定蛇
龙珠的直接亲本还需要进行大量的研究工作。
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