全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (4) : 688～690
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 10 - 21; 修回日期 : 2005 - 01 - 21
基金项目 : 国家 ‘863’项目资助 (2004AA241140)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xxdeng@mail1hzau1edu1cn)
柑成熟种子胚培养获得四倍体植株
洪　柳　刘永忠　邓秀新 3
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 , 国家柑橘育种中心 , 武汉 430070)
摘 　要 : 通过组培方法从 374粒 　柑种子培养中获得 449株小苗。利用流式细胞仪进行染色体倍性分
析 , 发现其中 7株小苗为四倍体植株。采用 13对 SSR引物分析表明这 7株四倍体植株均来自珠心细胞 , 为
同源四倍体。这些四倍体的获得为下一步培育三倍体无核品种奠定了基础。
关键词 : 　柑 ; 多倍体 ; 四倍体 ; 流式细胞仪 ; SSR
中图分类号 : S 666　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0420688203
O bta in ing of Ponkan ( C itrus re ticu la ta Blanco ) Tetraplo id by Cultur ing
Em bryos of M a ture Seeds
Hong L iu, L iu Yongzhong, and Deng Xiuxin3
(N ational Key Laboratory of C rop Genetic Im provem ent, N ationa l Cen ter of C itrus B reed ing, Huazhong A gricu ltura l U niversity,
W uhan 430070, China)
Abstract: Seedless or few seed trait is one of the goals of Ponkan breeding. By culturing the embryos of
mature seeds, a total of 449 polyembryonic seedlings from 374 seeds were obtained; and seven of them were
verified to be tetrap loid by flow cytometry. SSR ( simp le sequence repeat) analyses with 13 p rimers indicated
that these tetrap loid seedlings were all autotetrap loid from the nucellar cells. These tetrap loid seedlings will be
of great value for creating seedless Ponkan through sexual hybridization.
Key words: Ponkan; C itrus reticu la ta B lanco; Polyp loidy; Tetrap loid; Flow cytometry; SSR
1　目的、材料与方法
柑橘无核育种一直是育种工作的重点之一。三倍体柑橘由于减数分裂不正常 , 不能形成种子 , 而
发育成为无核果实 , 因此培育三倍体柑橘成为获得无核柑橘品种的重要途径之一。然而靠自然产生获
得三倍体柑橘的比例非常小 ; 通过胚乳培养获得的三倍体因其移栽难成活 , 染色体数目不稳定等原因
一直未能实用化〔1〕。因此 , 目前三倍体的培育大多是先获得四倍体 , 然后将其与二倍体有性杂交而
获得〔2, 3〕。20世纪 50年代以后 , 随着无核育种工作的开展 , 我国先后通过芽变 , 实生变异的筛选获
得 119个 　柑无核或少核类型〔4〕, 但由于产量较低等原因尚未大面积推广。作者以 　柑成熟种子胚为
材料 , 希望通过组织培养途径获取三倍体无核类型种质资源 , 或为创造三倍体无核类型提供多倍体杂
交亲本。
供试材料 　柑 (C itrus reticu la ta B lanco) 购自华中农业大学市场。　柑种子经 10%次氯酸钠表面
消毒 20 m in, 无菌条件下用无菌水冲洗 5次 , 播种于 MT + GA3 (1 mg·L - 1 ) 的培养基上 , 待胚开始
萌芽 , 立即将其挑离分开培养。成苗后 , 参照张俊娥等〔5〕的方法对单株小苗用流式细胞仪进行倍性
鉴定 , 同时用微量 DNA提取法提取叶片 DNA, 进行 SSR分析。SSR引物 13对 , 为 TAA1、TAA15、
TAA27、TAA33、TAA52、TAA45、AGG、CAC15、CAC39、CAC33、CAC23、CAC19、TAA41等〔6〕。
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　4期 洪 　柳等 : 　柑成熟种子胚培养获得四倍体植株 　
SSR分析参考庞晓明等〔7〕的方法。
2　结果分析与讨论
211　 柑组培苗流式细胞仪检测结果
本试验共播种两批。第 1批 115颗种子 , 获
得 179株小苗 , 经流式细胞仪检测 (图 1) 其中
有 2株为四倍体。第 2批 259颗种子 , 获得 270
株小苗 , 经检测其中 5株为四倍体。两批均无三
倍体植株发生。
212　四倍体小苗的 SSR分析
取第 1批的 1株二倍体和第 2批的 2株二倍
体为对照 , 对 7株四倍体做 SSR分析。结果发现
在所有 13对引物中四倍体与二倍体都表现出相同
的带型 (图 2)。由于 　柑是多胚品种 , 获得的四
图 1　 柑叶片流式细胞仪倍性分析
以 2x为对照 , 将 2x与 4x样品混合检测 , 对照 2x峰值
在 50左右 , 4x峰值在 100左右出现
F ig. 1　Ana lyses of flow cytom etry of ponkan leaves
The detect samp le is the m ixture of 2x and 4x. The peak
value of 2x is about 50, 4x is about 100
倍体有两种可能 , 一种是来自四倍体珠心细胞 , 即同源四倍体 ; 另一种是来自于杂交起源的异源四倍
体 , 即可能是未减数的 2n雌配子与 2n雄配子结合产生异源四倍体 , 或者是正常合子自然加倍形成四
倍体。假若异源四倍体是来自 2n雌配子与 2n雄配子的结合 , 因为 SSR分析结果均为一条带 , 加上
SSR为共显性标记 , 可以认为母本所测位点为纯合的基因型。在开放授粉情况下 , 父本的基因型有 3
种可能 , 即 AA, A a和 aa, 母本的基因型有 AA和 aa两种可能。而产生纯合的基因型 (AAAA, aaaa)
概率为 1 /3。若要使 13对 SSR引物分析结果带型均一致 , 则概率为 (1 /3) 13 , 为小概率事件 , 很难
发生。同样假若四倍体是第二种情况 , 即合子加倍产生异源四倍体 , 雌雄配子各有两种可能 A和 a,
合子产生纯合基因型的概率为 1 /2, 13个位点同时表现出纯合位点的可能性为 (1 /2) 13 , 也为小概率
事件 , 几乎不可能出现本试验的结果。因此 , 可以认为所获得的四倍体为四倍体珠心细胞发育而来的
同源四倍体。
图 2　SSR分析结果
A、B、C分别为引物 AGG、TAA15、TAA45; 1～3为二倍体 ; 4～10为四倍体。
F ig. 2　Results of SSR ana lyses
A. Primer AGG; B. Primer TAA15; C. Primer TAA45; 1 - 31Referred to diploids; 4 - 101Referred to tetraploids. 图 3　温室中的 柑 4x苗F ig. 3　Ponkan tetraplo id ingreen house
相对田间而言 , 多胚性柑橘品种的成熟种子通过人工培养可以使大部分的珠心胚培养成苗 , 可以
广泛应用到柑橘品种三倍体和四倍体 , 甚至其它多倍体的筛选。过去一些研究表明 , 从实生苗 , 特别
是从单胚品种及单多胚混合型品种的实生苗中可以筛选出三倍体〔8～10〕。本试验并未从 　柑成熟胚培
养中获得三倍体 , 原因可能是三倍体体胚在发育过程中早期夭折 , 以及三倍体 (来自合子胚 ) 相对
一个种子中胚增加后的比例下降等因素所致。而所得到的 7株 　柑四倍体植株 (图 3) , 将为三倍体
　柑育种提供非常有价值的原始材料。
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
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