全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2003 , 30 (1) : 6～10
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2002 - 03 - 26 ; 修回日期 : 2002 - 07 - 22
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (39970524) ; 国家高技术研究发展计划 (863 计划) 项目 (2001AA241172) ; 国家“十五”
科技攻关项目 (2002BA515B11)3 通讯作者。
中国野生葡萄果实抗白腐病基因的分子标记
徐　炎1 　王跃进1 , 3 　周　鹏2 　张剑侠1
(1 西北农林科技大学园艺学院 , 杨凌 712100 ;　2 热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室 , 海口 571101)
摘 　要 : 以感病 ×抗病的葡萄种间杂交组合白玉霓 ×塘尾的 F1 代 17 个单株及塘尾自交一代 16 个单株
为试材 , 采用 BSA 法和 RAPD 技术 , 通过对 155 个随机引物的筛选 , 获得了一个与中国野生葡萄抗白腐病
基因连锁的 RAPD 标记 OPP092760 , 并在中国野生葡萄 8 个种的 32 个株系及欧洲葡萄 16 个品种中得到验证。
进一步将该 DNA 片段克隆并测序 , 根据两端序列 , 设计了一对长 26 bp 的特异引物分别扩增供试材料 , 获
得了与该 RAPD 标记相同大小的DNA 片段 , 成功地将 RAPD 标记转化为 SCAR 标记 , 可以用作抗白腐病基因
的分子辅助选择的依据。
关键词 : 葡萄 ; 中国野生葡萄 ; 白腐病 ; RAPD ; SCAR ; 抗病基因
中图分类号 : S 663. 1 ; Q 943 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2003) 0120006205
葡萄白腐病 〔Coniothyrium diplodiella (Speg) Sace〕是世界性的葡萄重要真菌病害 , 每年因该病造
成产量损失 20 %～50 % , 严重年份达到 80 %以上〔1 ,2〕。目前生产上对该病的防治主要以化学药剂防治
为主 , 易引起果实农药残毒和环境污染 , 而且真菌能产生耐药性。利用抗病基因选育抗病品种是防治
白腐病根本有效的措施。中国野生葡萄是葡萄抗白腐病育种的重要种质资源〔3 ,4〕, 分子标记技术的应
用〔5 ,6〕为基因分析和鉴定提供了新手段。本研究利用 RAPD、SCAR 分子标记技术 , 对中国野生葡萄及
其杂种后代进行抗病基因的快速标记 , 以达到分子标记辅助抗病育种早期鉴定选择杂种的目的。
1 　材料与方法
试材为葡萄种间杂交组合欧洲葡萄品种白玉霓 ×刺葡萄塘尾的 F1 代 17 个单株 , 塘尾自交一代 16
个单株 , 中国野生葡萄 8 个种 32 个株系和欧洲葡萄 16 个品种 (表 1 , 表 2) , 均取自西北农林科技大
学葡萄种质资源圃。葡萄白腐病的发病盛期 (6～9 月) 进行田间自然鉴定、田间和室内接种鉴
定〔3 ,7〕。
大肠杆菌为 E. coli DH5α, 由中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室提供 ; 质粒
载体为 p GEM2T、p GEMR2T2Easy Vector Systems I , 购自 Promega 公司。Taq 酶、RNase , dNTPs、IPTG、X2Gal、
溶菌酶、琼脂糖等购自上海生工公司 , 各限制性内切酶 , DNA/ Hind Ⅲ+ E. coR I、Tryptone、Yeast
Extract、Amp r、10 个碱基随机引物等购自 Promega 公司。
葡萄基因组 DNA 的提取采用改良 CTAB 法〔8〕, RAPD 反应体系参照王跃进等〔6 ,8〕的方法。
PCR 产物回收参照姜泊等〔9〕的方法 ; 连接反应参照 p GEMR2T Easy Vector Systems I说明书 , 感受态细胞
的制备、转化、阳性克隆的筛选鉴定参照 Sambrook 等〔10〕的方法 ; 样品送上海生工公司进行测序。
根据 DNA 序列分析结果 , 在上海生工公司分别合成 26 个碱基的两个引物。引物 1 : 5′ACTAAG2
GACAGTGAATTCCAAAG 3′; 引物 2 : 5′GATCAGGTTACCTATTGAGAAAGTAT 3′。以上述所有抗感材料为
模板进行 PCR 扩增。在无菌的 0. 5 mL PCR 薄壁管中依次加入下列组分建立反应体系 : 无菌水
13. 7μL , 10 ×buffer 2. 5μL , dNTPs 2. 5μL , Taq 酶 0. 3μL (5 U/μL) , 25 mmol/ L MgCl2 2μL , 模板
DNA 2μL ( 25 ng/μL ) , 引物 1 ( 25μmol/μL ) 和引物 2 ( 25μmol/μL ) 各 1μL。混匀后总体积为
25μL。在其上加 25μL 石醋油后 , 按下面的循环程序进行 PCR 扩增反应 : 94 ℃预变性 5 min ; 94 ℃变
性 1 min , 65 ℃退火 1 min , 72 ℃延伸 2 min , 40 个循环 ; 最后 72 ℃延伸 10 min。用 1. 0 %琼脂糖凝胶电
泳检测 PCR 扩增结果。
表 1 　中国野生葡萄和欧洲葡萄对白腐病的抗性
Table 1 　The resistance of the Chinese wild Vitis and V. vinifera L. to white rot
种
Species
株 系 或 品 种
Clones or varieties R or S OPP092760
刺葡萄 塘尾 Tangwei R +
V . davidii 雪峰 Xuefeng R +
福建 - 4 Fujian24 R +
济南 - 1 Jinan21 R +
略阳 - 4 Lüeyang24 R +
裂叶刺葡萄 宁强 - 6 Ningqiang26 R +
var. ningqiangensis
复叶葡萄 留坝 - 9 Liuba29 R +
V . piasezkii 留坝 - 8 Liuba28 R -
留坝 - 7 Liuba27 R -
眉县 - 6 Meixian26 R +
甘肃 - 91 Gansu291 S -
秋葡萄 江西 - 1 Jiangxi21 R +
V . romanetii 平利 - 2 Pingli22 R -
平利 - 7 Pingli27 R +
留坝 - 1 Liuba21 R +
江西 - 2 Jiangxi22 S -
留坝 - 11 Liuba211 S -
山葡萄 左山 - 1 号 Zuoshan21 R +
V . amurensis 左山 - 75097 Zuoshan275097 R +
通化三号 Tonghua23 R +
双优 Shuangyou R +
葡萄 安林 - 3 Anlin23 R +
V . thunbergii 泰山 - 1 Taishan21 S -
种
Species
株 系 或 品 种
Clones or varieties R or S OPP092760
华东葡萄 白河 - 35 - 1 Baihe23521 R +
V . Pseudoreticulata 白河 - 13 - 1 Baihe21321 R -
毛葡萄 8324296 ( ♀) S -
V . quinquangularis 8324294 S -
8324249 S -
8324285 S -
泰山 - 12 Taishan212 S -
渭南 - 3 Weinan23 S -
欧洲葡萄 商南 - 24 Shangnan224 S -
V . vinifera 法国兰 Blue French S -
黑比诺 Pinot Noir S -
霞多丽 Chardonnay S -
赤霞珠 Cabernet Sauvignon S -
小白玫瑰 Muscat Blanc S -
白诗南 Chenin Blanc S -
品丽珠 Cabernet Franc S -
白玉霓 Ugni Blanc S -
梅鹿特 Merlot S -
佳利酿 Carignane S -
粉红玫瑰 Muscat Rose S -
五月紫 Mariky Noin S -
雷司令 Riesling S -
巴库斯 Bacchus S -
詹娜生玫瑰 Muscat Zana S -
红地球 Red Globe S -
　　注 : R , 抗病 ; S , 感病 ; + , 有 ; - , 无。
Note : R , Resistant ; S , Susceptible ; + , Present ; - , Absent .
2 　结果与分析
2. 1 　中国野生葡萄抗白腐病基因 RAPD 标记的筛选
从白玉霓 ×塘尾组合 F1 代和塘尾自交一代中分别取 10 株抗病单株 (142621、142625、142629、142
7211、152721、152722、152723、152724、152725、152726) 的 DNA 和 10 株感病单株 (142622、142623、142
624、142627、142628、142722、142723、142724、142725、142729) 的 DNA 构成抗病与感病的两组 DNA 基
因池 , 采用BSA 法〔11〕, 使用Operon 公司生产的A、B、C、D、G、H、J 、O、P、Q、R、S、U、V、W
共 15 个引物系列的 155 个引物进行扩增 , 从中筛选出大小一致、重复性好、扩增条带清晰可辨具多
态性的特异引物 OPP092 (5′GTGGTCCGCA 3′) 。特异引物 OPP09 在种间杂交组合白玉霓 ×塘尾 F1 代及
塘尾自交一代的 33 个单株中 , 抗病的 20 个单株均拥有 760 bp 的多态性片段 , 而感病的 13 个单株则
没有约 760 bp 的多态性片段 (图 1 , 表 2) 。
同时 , 我们用中国野生葡萄 8 个种 32 个株系的基因组 DNA 及 16 个欧洲葡萄品种的基因组 DNA
71 期 　　　　　　　　　　　徐 　炎等 : 中国野生葡萄果实抗白腐病基因的分子标记 　　　　　　　　　　　
为模板 , 用特异引物 OPP09 进行 PCR 扩增。研究表明 , 在田间表现为抗病的 22 个中国野生葡萄株系
中 , 除平利 - 2 , 白河 - 13 - 1 , 留坝 - 8 和留坝 - 7 没有 760 bp 的特异条带外 , 其余的 18 个株系均拥
有约 760 bp 的特异 DNA 片段 ; 而在 10 个感病的中国野生葡萄株系及 16 个感病的欧洲品种中均没有
760 bp 的特异条带 (图 1 ,b , 表 1) 。这进一步表明了 OPP092760 来自刺葡萄塘尾 , 是中国野生葡萄特
有的抗白腐病基因的分子遗传标记之一 , 并遗传。
表 2 　OPP09 对种间杂交组合白玉霓×塘尾 F1 代和塘尾自交一代单株的分析结果
Table 2 　RAPD analysis of interspecific cross F1 hybrids of Ugni Blanc ×Tangwei and of self2pollination F1 Plants of Tangwei by primer OPP09
亲本及 F1 代
Parents and F1
R or S OPP092760
塘尾 Tangwei R +
白玉霓 Ugni Blanc S -
142621 R +
142622 S -
142623 S -
142624 S -
142625 R +
142627 S -
142628 S - 亲本及 F1 代Parents and F1 R or S OPP092760142629 R +142722 S -142723 S -142724 S -142725 S -142727 S -142729 S -1427211 R +1427212 S - F1 代F1 plants R or S OPP0927601427213 S -152821 R +152822 R +152824 R +152825 R +152826 R +152827 R +152721 R +152722 R + F1 代F1 plants R or S OPP092760152723 R +152724 R +152725 R +152726 R +152727 R +152728 R +152729 R +152921 R +
　　注 : R. 抗病 ; S. 感病 ; + . 有 ; - . 无。
Note : R. Resistant ; S. Susceptible ; + . Present ; - . Absent .
图 1 　中国野生葡萄抗白腐病基因相连锁的 RAPD 标记
a : 1. PCR markers ; 2. 塘尾 ; 3. 142621 ; 4. 142625 ;
5. 142629 ; 6. 1427211 ; 7. 152821 ; 8. 152822 ; 9. 152826 ;
10. 152722 ; 11. 152728 ; 12. 152729。
b : 1. PCR markers ; 2. 塘尾 ; 3. 白玉霓 ; 4. 抗病基因池 ;
5. 感病基因池 ; 6. 略阳 - 4 ; 7. 雪峰 ; 8. 宁强 - 6 ;
9. 济南 - 1 ; 10. 福建 - 4 ; 11. 留坝 - 8 ; 12. 留坝 - 7。
Fig. 1 　The RAPD Marker OPP092760 linked to the disease
resistance white2rot genes in grape samples using primer OPP09
a : 1. PCR markers ; 2. Tangwei ; 3. 142621 ; 4. 142625 ;
5. 142629 ; 6. 1427211 ; 7. 152821 ; 8. 152822 ; 9. 152826 ;
10. 152722 ; 11. 152728 ; 12. 152729.
b : 1. PCR markers ; 2. Tangwei ; 3. Ugni Blanc ;
4. The resistant gene pool ; 5. The susceptible gene pool ;
6. Lüeyang24 ; 7. Xuefeng ; 8. Ningqiang26 ; 9. Jinan21 ;
10. Fujian24 ; 11. Liuba28 ; 12. Liuba27. 图 2 　中国野生葡萄抗白腐病基因连锁的 SCAR标记a : 1. PCR Markers ; 2. 塘尾 ; 3. 白玉霓 ; 4 , 6 , 9 , 11. 抗病单株 ; 5 , 7 , 8 , 10 , 12. 感病单株。b : 1. PCR Markers ; 2. 塘尾 ; 3. 白玉霓 ; 4. 留坝 - 9 ;5. 安林 - 3 ; 6. 左山 75097 ; 7. 左山 1 号 ; 8. 通化三号 ;9. 双优 ; 10. 白河 - 35 - 1 ; 11. 留坝 - 7。Fig. 2 　The SCAR marker link to the disease resistance white2rotgenes of the Chinese wild grapes using primer 1 and primer 2a : 1. PCR Markers ; 2. Tangwei ; 3. Ugni Blanc ;4 , 6 , 9 , 11. The resistant progenies ;5 , 7 , 8 , 10 , 12. The Susceptible progenies.b : 1. PCR Markers ; 2. Tangwei ; 3. Ugni Blanc ; 4. Liuba29 ;5. Anlin23 ; 6. Zuoshan 75097 ; 7. Zuo shan21 ; 8. Tonghua23 ;9. Shuangyou ; 10. Baihe23521 ; 11. Liuba27.
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2. 2 　中国野生葡萄果实抗白腐病基因 SCAR分子标记
为了获得中国野生葡萄抗白腐病基因的特异片段 RAPD 标记的遗传信息 , 并将该 RAPD 分子标记
转化为特异性高、重复性好的 SCAR 分子标记 , 以酶切及 PCR 鉴定为阳性克隆的外源插入片段测序
后 , 用 PC2gene 软件进行了序列分析。约 760 bp 的特异片段的序列含有多个终止子 , 属非编码序列 ,
按照其特定的序列 , 实际全长为 769 bp。为将中国野生葡萄抗白腐病基因的 RAPD 分子标记转化为
SCAR 分子标记 , 根据用 10 个碱基的随机引物 OPP09 扩增得到的抗病特异性片段的序列分析结果 , 分
别合成具有 26 个碱基的两个引物 , 用这两个引物进行 PCR 扩增 , 结果在抗病的中国野生葡萄种内的
多数株系及其杂种单株中能够扩增出一条相应于约 760 bp 的特异性 DNA 片段的抗病特异带 (图 2) ,
这说明用引物 OPP09 扩增得到的 RAPD 分子标记可以转化为重复性和特异性更好的 SCAR 分子标记。
3 　讨论
葡萄果实抗白腐病的田间鉴定代表了不同种和株系及品种对白腐病的田间抗病性表现 ; 室内离体
鉴定结果也可说明葡萄材料的抗病表现 , 但这两种鉴定结果均受环境条件和栽培管理水平的影响 , 特
别是果实对葡萄白腐病的抗性在早期鉴定十分困难 , 甚至在结果前不可能鉴定。此外葡萄为多年生果
树 , 育种周期长 , 常规的抗白腐病鉴定又需要更长的时期。因此对葡萄这种基因组高度杂合的果树 ,
如何获得与目的基因连锁的分子标记 , 在幼苗期进行结果前抗病基因标记辅助育种选择显得尤为重
要。
关于葡萄特别是中国野生葡萄抗白腐病基因标记的研究尚未见到报道。Michelmore 等〔11〕建立的
BSA 法 , 用 RAPD 技术对果树杂交分离群体快速获得 DNA 分子标记是可行的。前人用此方法在研究
其他性状标记方面取得了成功的结果。Wang 等〔8〕用 BSA 法对葡萄 B722216 ×B452187进行 RAPD 分析 , 获
得的 UBC2692500 片段与葡萄无核基因有一定的连锁关系 , 并认为葡萄无核性状是多基因控制的 , 该
片段与主效基因之一有连锁关系。Lahogue 等〔12〕用 140 个随机引物对葡萄无核性状进行 RAPD 分析得
到了 RAPD 标记与主效的显性基因紧密连锁 , 遗传距离分别为 0. 7 cM 和 3. 5 cM。这些成功的方法与
结果为本研究提供了借鉴和应用的依据。因此 , 我们在多年抗白腐病鉴定的基础上 , 对中国野生种的
株系与欧洲葡萄品种的杂交后代采用BSA 法和 RAPD 分析 , 获得了与中国野生葡萄抗白腐病基因连锁
的 RAPD 标记 OPP092760 , 进一步将其转化为更快速、且容易检测的 SCAR 标记 , 可以用于葡萄杂种
幼苗期抗白腐病基因的 DNA 分子标记鉴定。
关于葡萄对白腐病的抗性遗传 , 国内外尚未见有报道。本研究根据刺葡萄塘尾果实对白腐病表现
出高度抗性及其自交一代也表现出全部抗病 , 而塘尾与欧洲葡萄品种白玉霓种间杂交 F1 代的抗性表
现分离的事实 , 又根据获得的抗白腐病基因的 RAPD 标记 OPP092760 在这些材料中的分离情况 , 从遗
传上推测刺葡萄塘尾是一个抗白腐病的隐性纯合体 , 而欧洲葡萄品种白玉霓为一个杂合体。另外 , 本
研究所获得的抗白腐病基因的 RAPD 标记 OPP092760 在供试的 8 个中国野生葡萄种的 22 个抗病株系中
的分析结果 , 除秋葡萄平利 - 2、复叶葡萄留坝 - 7、留坝 - 8 和华东葡萄白河 - 13 - 1 共 4 个抗病株
系外 , 其余 18 个不同种的抗病株系均携带这一 RAPD 标记 , 即该标记与抗白腐病基因存在着连锁关
系 , 但并非完全连锁。这也表明中国野生葡萄抗白腐病不是单基因控制的 , 很可能属于多基因控制的
抗白腐病。关于中国野生葡萄种的抗白腐病基因的更多的 RAPD 标记及 SCAR 分子标记 , 我们正在研
究中。
现在获得的抗白腐病基因的 DNA 分子标记来自抗白腐病的中国野生葡萄刺葡萄塘尾且能向后代
遗传 , 并且存在于中国野生葡萄的其它种及株系中 , 这为葡萄抗白腐病育种的杂种早期抗病性鉴定提
供了 DNA 依据。我们获得的刺葡萄塘尾抗白腐病基因 RAPD 标记 OPP092760 , 仅为研究抗白腐病基因
提供了一个突破点 , 更多的 RAPD 标记及其与抗白腐病基因位点的距离及定位作图是我们正在研究的
内容。
91 期 　　　　　　　　　　　徐 　炎等 : 中国野生葡萄果实抗白腐病基因的分子标记 　　　　　　　　　　　
参考文献 :
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Identif ication of Molecular Genetic Markers Tightly Linked to White Rot
Resistant Genes in Chinese Wild Grape
Xu Yan1 , Wang Yuejin1 , Zhou Peng2 , and Zhang Jianxia1
(1 College of Horticulture , Northwest Sci2Tech university of Agriculture and Forestry , Yangling 712100 , China ;　2 National Key biotech2
nology laboratory for tropical cropes , Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences , Haikou 571101 , China)
Abstract : Bulk segregant analysis (BSA) , randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) and sequnence
characterized amplified region (SCAR) methords were used to tag the white rot2resistant genes of grape with 17
individuals of F1 progeny between Tangwei ( Vitis davidii) , white rot2resistant and Ugni Blanc ( V . vinifera) ,
White rot2sensitive and 16 individuals self2pollinated of Tangwei . Among 155 random primers gave distinct band
Patterns , One RAPD marker OPP092760 was tightly linked to a major gene resistant to Coniothyrium diplodiella.
Marker OPP092760 was cloned and sequenced. According to the Sequence , two specific primers were designed to
amplify all plant materials. RAPD marker was converted into SCAR marker. One distinct single band only in
resistant plants was amplified and its size was the same as that of the RAPD marker. The SCAR marker’s
popularity was confirmed. And it could be used for the identification of hybrid resistant to Coniothyrium
diplodiella.
Key words : Grape ; Chinese wild grape ; White rot ; RAPD ; SCAR ; Resistant genes
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01 　　　　　　　　　　　　　　　　　园 　　艺 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　30 卷