全 文 ：第 17 卷
第 2 期

Vol. 17
No . 2
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2009 年
3 月

Mar .

2009
红三叶根际溶磷菌分离及其溶磷机制初探
朱
颖1, 2 , 姚
拓1, 2, 3* , 李玉娥1, 2, 孙红阳1, 2
( 1. 甘肃农业大学草业学院, 兰州
730070; 2. 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室, 兰州
730070;
3.中
美草地畜牧业可持续发展研究中心, 兰州
730070)
摘要 :利用 PKO 培养基从兰州地区红三叶( T r if o lium p ratense L. )根际分离、筛选出 21株菌株 ,其中 10株具有溶
解无机磷能力,其 D/ d 值(溶磷圈直径与菌落直径比值)在 1. 13~ 1. 62 之间; 5 株在蒙金娜有机磷培养基上形成明
显透明圈,其 D/ d 值在1. 07~ 1. 83 之间; 3 株菌株既能溶解有机磷又可溶解无机磷。对其中 D/ d 值较高的 6 株溶
解无机磷菌株和 5 株溶解有机磷菌株进行液体培养,用钼蓝比色法测定有效磷增量分别为 5. 0~ 596. 3 和- 0. 03
~ 58. 34 mg/ L。lhs6和 lhs8溶解无机磷能力较其他菌株强, lhs11 溶解有机磷能力较其他菌株强。菌株中 lhs6、
lhs8和 lhs11 在后续微生物菌肥研制中具有较大潜力。
关键词:根际; 溶磷菌;溶磷能力; 红三叶
中图分类号: S812; Q939. 96




文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2009) 02
0259
05
Screening of Phosphate
solubilizing Bacteria and Their Acting
Mechanisms in the Rhizosphere of Red Clover
ZHU Ying1, 2 , YAO T uo1, 2, 3* , LI Yu
e1, 2 , SUN Hong
yang1, 2
( 1. Prataculture College, Gansu Agricul tu ral Un iversity, Lanzhou, Gansu Province 730070, Chin a; 2. Gansu Key Laboratory
of Crop Genet ic and Germplasm Enhan cem ent , Lanzhou, Gansu Province 730070, China; 3. Th e Sino
U. S. Centers for
Grazingland Ecosy stem Sus tainabilit y, Gansu Agricultural University, Lanzh ou, Gansu Province 730070, China)
Abstract: Pho sphate
so lubilizing bacteria are impo rtant fo r agriculture, especially for legume plants, be

cause they increase the available phosphorus in soils and improve the nodulat ion and nit ro gen fix at ion of
rhizobia. In the present paper, phosphate
solubilizing bacteria in the rhizosphere of red clov er ( Tr i f olium
p r atense L. ) w ere screened based on PKO culture medium and molybdenum blue method. Total 21 st rains
w ere obtained, among which, 10 st rains had the ability to so lubilize ino rganic pho sphate, the ratio of D/ d
( diameter of phosphate
dissolving zone / diameter of bacter ial clone) varied from 1. 13 to 1. 62. And there
w ere 5 strains had the ability to solubilize o rganic phosphate on M eng jinna or ganic culture medium, the ra

t io of D/ d changed from 1. 07 to 1. 83. St rains lhs3, lhs11, and lhs15 could solubilize both inor ganic phos

phate and org anic phosphate. In liquid culture, the available phosphate increment by inorg anic phosphate

solubilizing bacter ia changed from 5. 0 mg/ L to 596. 3 mg/ L and organic phosphate
solubilizing bacteria
- 0. 03 mg/ L to 58. 34 mg/ L using molybdenum blue method. St rains lhs6 and lhs8 had signif icant ly high

er ability in inorg anic pho sphate
so lubilizing than other st rains and str ain lhs11 had the highest ability in
org anic phosphate dissolving. The ability o f phosphate disso lving by bacteria w as corr elated to pH and or

ganic acid, but no t signif icant ly. St rains lhs6, lhs8, and lhs11 show ed g reat po tential fo r ag ricultural use
in microbiolo gical fert ilizer and deserved further study .
Key words: Rhizo sphere; Phosphate
solubilizing bacteria; Phosphate solubilizing ability; Tr if olium p r at

ense L.
收稿日期: 2008
08
04; 修回日期: 2008
12
12
基金项目:甘肃省教育厅科研基地重点项目 ( 08zx
08 ) ,甘肃省科技厅中青基金 ( 3YS061
A25
021 ) , 甘肃农业大学创新基金 ( GAU

CX0501)和草业科学国家级重点学科学术骨干科研项目( Cy
GG
2006
02)
作者简介:朱颖( 1984
) ,女,辽宁省铁岭县人, 硕士研究生,研究方向为草地应用微生物及其多样性, E
mail: zh uy1984@ yahoo. com. cn ,
* 通讯作者 Author for corr espondence, E
mail : yaotu o@g sau . edu. cn
草
地
学
报 第 17卷


土壤中许多微生物具有不同程度的溶磷能力
(这类微生物称溶磷微生物) , 它们能够依靠自身的
代谢产物或与其他生物协同溶解土壤中的难溶性磷
素,提高土壤中磷素的利用效率,减少化学肥料的施
用量,降低农业投入成本, 对环境进行微生物修复,
提高作物产量, 是解决土壤磷素缺乏的重要途径之
一[ 1]。目前,投入工业应用并取得较好田间效果的
溶磷微生物不多, 主要有巨大芽孢杆菌 ( Bacil lus
megater ium ) 及其变种、荧光假单胞菌 ( P seudo

monas f luor escens )等 [ 2~ 4]。溶磷微生物在土壤中存
活及溶磷特性受到土壤环境和牧草生长等诸多因素
影响[ 5] ,且自身也存在退化问题, 因此, 需要从土壤
及植物根际不断筛选高活性菌株,并对其溶磷特性
和机制进行研究。
豆科作物根际溶磷菌可以提高植物对土壤磷素
的利用率, 促进根瘤菌的结瘤和固氮作用 [ 6] ,因而对
豆科作物的营养供给和生产性能提高具有重要意
义。目前,对红三叶( Tr i f olium p r atense L. )根际
溶磷菌资源的研究多集中在菌根真菌方面, 如根外
菌丝对红三叶的磷素营养起重要作用[ 7] ,菌根侵染
可以提高植物对土壤磷的有效利用率[ 8]。有关其根
际溶磷细菌研究尚未见报道。本研究从红三叶根际
筛选出具有较强溶磷活性的细菌菌株, 并对其溶磷
特性及机理进行测定和探索, 以期为后续研制红三
叶根际溶磷菌肥提供菌种及基础资料。
1
材料与方法
1. 1
样品采集及菌株分离
在兰州市及其周边地区栽培 2或 2年以上红三
叶田(前作为撂荒地)采集样品。采样时按 5点法取
样,割去地上部分, 取直径 10 cm、深 20 cm 的土柱
(包括根系) ,装入保鲜袋内,放入标签, 封口, 置于冰
壶中立刻带回实验室进行溶磷菌分离筛选。为便于
研究,将根际区分为远根土壤 ( NRS)、根际土壤
( RS)、根系表面( RP)和根内( HP)四部分[ 9] 。
1. 2. 1
远根土壤溶磷菌分离筛选
在实验室无菌
条件下,抖去土柱的大部分土壤后随机选取 10个根
系,抖落并收集根系表面虚土(即远根土壤样品)。
按文献[ 9]方法分离筛选溶磷菌株。
1. 2. 2
根际土壤溶磷菌分离筛选
将 1. 2. 1中抖
掉表面虚土的根系放入盛有 0. 85%灭菌 N aCl离心
管中, 250 r/ min离心 2 m in,静置 30 min后取上清
液,按 1. 2. 1方法分离筛选溶磷菌株。
1. 2. 3
根系表面溶磷菌分离筛选
将 1. 2. 2中经
离心清洗的根系放入 0. 85%灭菌 NaCl离心管中,
同时放入灭菌小石子, 500 r / min 离心 30 min后取
上清液,按 1. 2. 1方法分离筛选溶磷菌株。
1. 2. 4
根内溶磷菌分离筛选
将 1. 2. 2 中经离心
清洗的根系用溶化的石蜡密封根系两端后放入
0. 1% HgCl2 溶液表面消毒 1 m in,再用无菌水冲洗
4~ 5 次, 剪去根系两端石蜡段, 放入灭菌研钵中加
少量无菌水研磨, 转入 0. 85% 灭菌 NaCl离心管,
1000 r/ min下离心 3~ 5 m in, 取上清液, 按1. 2. 1方
法分离筛选溶磷菌株。
以上分离溶磷菌的培养基均为 PKO 无机磷培
养基[ 10]。挑取上述分离到的不同形态特征单菌落
转至 LB [ 11]斜面培养基培养至形成明显菌落后置于
4
冰箱中保存备用。
1. 2
菌株溶磷能力测定
1. 2. 1
定性测定
将 LB斜面培养基中保存的菌
株点接种于 PKO 及蒙金娜有机磷平板上, 28
恒
温培养 5、10和 15 d时观察、测量各菌株形成的溶
磷圈大小。根据溶磷圈直径( D)和菌落直径( d)比
值( D/ d)初步确定菌株溶磷能力。
1. 2. 2
定量测定
将 50 mL 液体 PKO(或蒙金娜
有机磷)培养基装入 150 mL 三角瓶, 121
灭菌 20
m in,冷却后, 分别将 500
L 各待测菌株的菌悬液
( 10
8
cfu/ mL)接种至三角瓶中。每菌株设 3 个重
复,以基础培养基(不接种菌株)为对照。将上述三
角瓶置于 28
、160 r/ min 摇床培养 10 d 后在
10000 r/ min、4
离心 15 min,取上清液,用钼锑抗比
色法测定有效磷增量(扣除对照后的值( mg / L ) ) [12] ,
计算公式如下[ 13] :
P= K
V
V 1


其中, P :有效磷增量; K:从标准曲线查得显色
液的磷含量 ( mg/ L ) ; V: 显色时溶液定容的体积
( mL) ; V1:显色时吸取上清液的体积( mL)。
1. 3
菌株培养液 pH值变化测定
用酸度计测定 1. 2. 2 培养 10 d后的各菌株培
养液 pH 值变化情况。
1. 4
菌株分泌总有机酸量测定
取 1. 2. 2中离心后上清液, 并分别加入酚酞指
260
第 2期 朱颖等:红三叶根际溶磷菌分离及其溶磷机制初探
示剂,用 0. 1 mo l/ L NaOH 滴定, 通过所耗 NaOH
量求得总有机酸含量(用 mmol/ L 表示)。
1. 5
数据统计分析
数据处理采用 Excel和 SPSS 16. 0 软件, 利用
LSD法进行多重比较。
2
结果与分析
2. 1
根际不同部位溶磷菌株分布
分离筛选到的 21株菌株, 其中 12株具有溶磷
能力,其在根际的分布为:根内 1株( lhs12) ,根系表
面 2株( lhs8 和 lhs15) , 根际土壤 7 株( lhs2、lhs3、
lhs5、lhs6、lhs9、lhs11和 lhs16) ,远根土壤2株( lhs1
和 lhs14)。大多数菌株分布在根际土壤中, 占分离
总溶磷菌株数的 58. 33%, 说明溶磷菌株在根际空
间不同部位的分布情况不同。
2. 2
溶磷菌株的溶磷能力
2. 2. 1
菌株溶解无机磷(磷酸三钙)能力
将 D/ d
值> 1. 13 的 10株菌株 D/ d 值进行显著性分析发
现,第 5 d,菌株 lhs9的 D/ d值最大( 1. 57) , 且与其
他菌株 D/ d 值差异显著, 其他各菌株的 D/ d 值除
lhs5外均无差异。在第 10 d和 15 d,各菌株 D/ d值
差异不显著。在菌株生长过程中, lhs9随天数的增
加 D/ d值呈减小趋势, 菌株 lhs3、lhs11和 lhs15 的
D/ d值在第 10 d 达到最大, 随后三者的 D/ d 减小。
而 lhs1、lhs6和 lhs2 D/ d值则随天数减小而后又增
大并大于第 5 d 的值(表 1)。说明各菌株的溶磷动
态并不相同, 有的 (如 lhs3)溶磷较快, 而有的 (如
lhs5)则比较慢。
进一步对 D/ d 值较大的 6 株菌株进行溶磷量
测定,其结果见表 2。不同菌株溶解 Ca3 ( PO4 ) 2 的
能力有较大差异。各菌株有效磷增量为 5. 0 ~
596. 3 mg/ L , 其中有效磷增量高于 500 mg/ L 的 2
株为 lhs8( 596. 3 mg / L )和 lhs6( 569. 8 mg / L ) ,两者
间差异不显著, 但与其他菌株差异极显著。其他各
菌株间及与对照有效磷增量无显著差异(表 2)。此
外,在菌株溶磷能力测定中发现,菌株溶磷能力与采
用溶磷圈观察法测定的结果不完全相同, 如有些菌
株( lhs5和 lhs3)在固体培养基上溶磷圈较大, 但其
有效磷增量却并不高,反之, lhs8(表 1)却最高。
表 1
溶磷菌在 PKO无机磷培养基上 D/ d值
T able 1
D/ d value of pho sphate
solubilizing bacteria
on PKO culture medium
菌株号
St rain
D/ d值 D/ d value
5 d 10 d 15 d
lhs1 1. 23cdB 1. 22cdC 1. 30aA
lhs3 1. 40bAB 1. 49abAB 1. 45aA
lhs5 1. 00eC 1. 26cdBC 1. 35aA
lhs6 1. 32bcdB 1. 13dC 1. 46aA
lhs8 1. 19dBC 1. 29cdBC 1. 29aA
lhs2 1. 25bcdB 1. 20cdC 1. 32aA
lhs9 1. 57aA 1. 30bcdBC 1. 31aA
lhs11 1. 26bcdB 1. 35bcBC 1. 29aA
lhs14 1. 26bcdB 1. 28cdBC 1. 31aA
lhs15 1. 37bcAB 1. 62aA 1. 48aA


注: 同列不同大写字母表示差异达 1%显著水平,不同小写字母
表示差异达 5%显著水平。下同
Note: Means with diff erent capital let ters in the sam e column
are signif icant ly diff erent at the 0. 01 level and differ ent smal l let ters
signi ficant ly dif ferent at the 0. 05 level; sam e as b elow
表2
溶磷菌在PKO培养液中有效磷增量、pH值及总有机酸量
Table 2
Increment of available phosphorus, pH, and total organic
acid in PKO culture liquid by pho sphate
solubilizing bact eria
菌株号
St rain
有效磷增量
In crem ent of Available P
mg
L- 1
pH 值
pH
有机酸总量
Total organic acid
mmol
L- 1
lh s5 140. 2bcBC 4. 43cCD 13. 8bB
lh s11 179. 1bBC 4. 20dD 22. 0aA
lh s15 215. 5bB 4. 52cC 11. 0bBC
lh s3 5. 0cBC 6. 53bB 2. 2cD
lh s6 569. 8aA 6. 50bB 6. 2cCD
lh s8 596. 3aA 4. 42cCD 12. 8bB
CK 0. 00cC 7. 00aA 1. 6cD
2. 2. 2
菌株溶解有机磷能力
利用溶磷圈法对 21
株菌株进行溶解有机磷(卵磷脂)能力测定, 发现 5
株菌株周围出现了明显的透明圈, 说明这些细菌能
够转化卵磷脂中的磷素。在第 5 d各菌株 D/ d值较
lhs15均有显著差异。菌株 lhs11在第 10 d和第 15
d的 D/ d值与其他菌株差异显著。在培养过程中,
菌株 lhs3 和 lhs16 D/ d值先随天数减小而后又增
大,但小于第 5 d 的值。菌株 D/ d 值在第 5 d大于
1. 3的有 3个( lhs3、lhs11和 lhs16) , lhs12和 lhs15
对有机磷的利用能力较差 (表 3)。lhs3、lhs11 和
lhs15既能利用无机磷又能利用有机磷,这可能与菌
株的生长特性和分泌的酶活力有关。


进一步定量测定发现, 培养 10 d后, 5株溶磷菌
溶解有机磷能力差异较大, 有效磷增量范围为-
0. 46~ 58. 34 mg / L (表 4)。主要是溶磷菌溶解有机
磷和无机磷的机制不同, 使得最大有机磷增量仅为
261
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报 第 17卷
无机磷增量最大值的十分之一。菌株 lhs11在固体
培养基上表现出较强溶磷能力, 其有效磷增量也显
著高于其他菌株(表 3、4)。菌株 lhs15和 lhs3在固
体培养基上虽然形成透明圈, 表现出一定的溶磷能
力,但定量测定发现有效磷增量却为负值,这可能是
菌株在溶解磷素的过程中也吸收转化了一部分有机
磷。对于微生物自身会吸收同化的磷, 就实际生产
的意义而言,可以不予考虑,因为在自然环境下, 微
生物死亡后,菌体内所贮存的磷会以有机形态存在
而且也不能直接被植物所吸收。
表 3
溶磷菌在蒙金娜有机培养基上 D/ d大小
Table 3
D/ d value of phosphat e
so lubilizing bacter ia
on M eng jinna or ganic culture medium
菌株号
S t rain
D/ d值 D/ d value
5 d 10 d 15 d
lhs3 1. 31 aA 1. 15bB 1. 27bcB
lhs12 1. 22 aAB 1. 10bB 1. 07cB
lhs11 1. 36 aA 1. 62aA 1. 83aA
lhs15 1. 00 bB 1. 14bB 1. 20bcB
lhs16 1. 42 aA 1. 29bAB 1. 38bB
表 4
红三叶根际溶磷菌在蒙金娜有机培
养基上有效磷增量及 pH值
Table 4
Increment of available phosphorus and pH on Mengjinna
o rg anic cultur e medium by pho sphate
solubilizing bacteria
菌株号
S t rain
有效磷增量
Incremen t of available P, mg
L- 1
pH 值
pH
lhs12 35. 08 bB 6. 84aA
lhs11 58. 34 aA 6. 70aA
lhs15 - 0. 46 cC 7. 23aA
lhs16 1. 24 cC 7. 15aA
lhs3 - 0. 03 cC 7. 79aA
CK 0. 00 cC 7. 00aA
2. 3
溶磷量与 pH值的关系
菌株培养液 pH 值变化测定结果显示, 接种溶
磷菌 10 d后, PKO 液体培养基的 pH 值均降低, 且
较对照差异显著。溶磷量大于 100 mg/ L 的 5株菌
株 pH 值集中于 4. 42~ 6. 50之间(表 2) ,表明这些
细菌在培养过程中能够分泌一些酸类物质使 pH 值
下降。对有效磷增量与培养液 pH 值之间相关性研
究发现: Y有效磷增量 = 3. 1788X pH + 268. 1 ( R2 =
0. 0002) , 有效磷增量与 pH 之间无相关性, 说明培
养液 pH 值降低对菌株溶磷作用影响微弱。对于相
近的 pH 值, 不同菌株的溶磷量差异较大, 如菌株
lhs5和 lhs8的培养液 pH 值分别为 4. 43 和 4. 42,
而其溶磷量却为 140. 2 和 596. 3 mg/ L , 差异极显
著。菌株 lhs6 pH 值较对照稍有下降( 6. 50) , 却表
现出强烈的溶解磷酸三钙活力, 这说明溶磷菌溶磷
能力不只与 pH 有关。
在蒙金娜有机磷培养液中,各菌株培养 10 d后
的 pH 值范围在 6. 70 ~ 7. 79 之间, 与对照 pH 值
( 7. 00)无显著差异(表 4)。除 lhs3 外, 各菌株有效
磷增量表现为随 pH 值的增加呈明显减小趋势。两
株 pH 值大于对照的菌株表现出有效磷的负增长,
这说明培养液 pH 影响菌株溶解有机磷。进一步对
pH 值与有效磷增量相关性研究发现: Y有效磷增量= -
51. 003X pH+ 383. 1( R2= 0. 6491)。可以看出,尽管
pH 值不是溶解有机磷的决定因素, 但也起到一定
的作用。
2. 4
溶磷能力与总有机酸含量的关系
分泌有机酸是许多微生物代谢活动常见的现
象。总有机酸量测定结果表明: 菌株在 PKO 培养
液中生长 10 d 后均能分泌有机酸, 但数量差别较
大。菌株 lhs11总有机酸量最高, 为 22 mmo l/ L ,与
其他菌株差异显著(表 2)。菌株 lhs3分泌的总有机
酸量最低( 2. 2 mmol/ L )。总有机酸量最大的菌株
其有效磷增量并不是最大, 反之亦然。对两者之间
相关性研究发现它们之间并无相关性。说明总有机
酸量并不能完全反映菌株的溶磷效果。本研究中还
发现,有机酸总量的增加与 pH 值的降低对有效磷
增量的影响基本一致。
3
讨论
3. 1
本研究利用溶磷圈法和钼锑抗比色法对兰州
地区红三叶根际溶磷细菌溶磷特性进行了测定, 发
现具有溶解无机磷能力的 10株菌株形成的透明圈
较李娟[ 14] 测定的溶磷菌 D/ d值小( 1. 24~ 5. 4)。这
可能与一般认为的菌株 D/ d 值变化与菌株代谢物
种类、释放快慢以及代谢产物在培养基上的蔓延程
度等有关[ 15]。此外, 有些菌株既可溶解无机磷, 又
可溶解有机磷,说明一种菌株同时存在多种溶磷机
理,即溶磷菌的溶磷作用是几种溶磷机制共同作用
的结果。此外, 本研究中 lhs8 最大有效磷增量
( 596. 3 mg / L )是冯瑞章[ 16] 测定溶磷菌株( Dm84)
8 d后培养液中最大有效磷增量( 227. 1 mg / L )的 2
倍多。另外,有机磷培养液经 10 d培养后发现各菌
株的溶磷效果不尽相同, 其中有效磷增量出现负值
的两菌株表现为不转化有机磷,这与林启美 [ 17]研究
一致,即菌体可以利用大量分解的磷并将其转化为
262
第 2期 朱颖等:红三叶根际溶磷菌分离及其溶磷机制初探
有机形态,使实验结果显示该菌株不表现或仅表现
微量分解卵磷脂的能力。对比溶磷菌定性与定量研
究发现: D/ d值大小仅能反映细菌是否具有溶磷能
力,若要能较准确地反映溶磷菌溶磷能力的大小, 需
要进行定量测定。
3. 2
研究发现,无机磷培养液中有效磷增量与 pH
值有微弱相关性。这与 Illmer 等[ 18]研究结果一致。
但是,本研究发现有效磷增量与有机磷培养液 pH
值关系较为密切。这说明培养介质的酸度对溶解有
机磷比较重要。此外, 也有报道认为微生物对有机
磷的溶解主要通过酶促作用实现[ 19] 。总有机酸量
与有效磷增量之间关系与林启美 [ 20]的研究基本一
致,即细菌有效磷增量与分泌的总有机酸量之间相
关性很低,这可能是因为不同种类的有机酸与金属
离子的结合能力不同。
3. 3
筛选出的 3株菌株( lhs6、lhs8和 lhs11)较其
他菌株具有较高的溶磷能力, 且生长较快,可作为微
生物肥料生产的潜在优良菌株作一步研究, 目前菌
株鉴定和相关研究工作正在展开,验证这些菌株在
大田土壤中的定殖、生长和生存能力及实际溶磷效
果将成为进一步工作的重点。
4
结论
4. 1
在兰州地区红三叶根际筛选分离出 21株溶磷
细菌, 其中 12株具有溶磷能力,包括 3株既能溶解
有机磷又能溶解无机磷。
4. 2
菌株溶解无机磷 D/ d值为 1. 13~ 1. 62, 有机
磷为 1. 07~ 1. 83; 有效磷增量分别为 5. 0~ 596. 3
mg/ L 和- 0. 03~ 58. 34 mg/ L。
4. 3
筛选出的 3株( lhs6、lhs8和 lhs11)优良菌株
有望成为红三叶溶磷菌肥研制的菌种。
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张蕴薇)
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