全 文 ：第 16 卷 第 4 期
Vo l. 16 No. 4
草 地 学 报
ACT A AGREST IA SIN ICA
2008年 7 月
Jul. 2008
草地早熟禾转 CMO-BADH双基因和
转 CMO基因耐盐性分析
徐 冰1 , 韩烈保1, 2* , 姚 娜1 , 王瑶瑶1 , 程晓霞1 , 曾会明1
( 1.北京林业大学草坪研究所 , 北京 100083; 2.长江大学园艺园林学院, 湖北省荆州市 430025)
摘要: 通过对非转基因草地早熟禾(P oa p ratens is L. )、转 CMO-BADH 双基因草地早熟禾、转 CMO 基因草地早熟
禾进行不同浓度的 NaCl胁迫试验, 测定其细胞膜的透性,丙二醛( MDA )含量、超氧化物歧化酶( SOD)活性、过氧化
物酶( POD) 活性、氧化氢酶( CAT )活性, 评定各株系耐盐能力的强弱,同时还验证并比较了CMO-BADH 双基因和
CMO 基因的耐盐性功能, 为耐盐新品种的选育提供了理论依据。结果表明: 所有株系的相对电导率、M DA 含量
均随盐浓度增加而增大, 在 NaCl胁迫下相对电导率和 MDA 含量的大小顺序为: 非转基因株系> 转 CM O 基因株
系> 转 CMO-BADH 双基因株系; 在 NaCl的胁迫下, 各个株系的 SOD 活性、POD 活性、CAT 活性都有明显的提
高, 此 3种指标的大小顺序为:转 CMO-BADH 双基因株系> 转 CM O 基因株系> 非转基因株系 ;综合考虑各个指
标, 各株系耐盐性强弱顺序为:转 CMO-BADH 双基因株系> 转 CMO 基因株系> 非转基因株系。
关键词: CMO-BADH 双基因; CM O基因; 草地早熟禾; 耐盐性
中图分类号: Q943 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2008) 04-0353-06
Salt Tolerance Analysis of Transgenic Kentucky Bluegrass with
CMO-BADH Double Gene and CMO Gene
XU Bing
1
, HAN Lie-bao
1, 2*
, YAO N a
1
, WANG Yao-yao
1
, CHENG Xiao-xia
1
, ZENG Hu-i ming
1
( 1. In st itute of Tu rfgrass S cien ce, Beijin g Forest ry U nivers ity, Bei jing 100083, China;
2. College of H ort iculture and Gardening, Yangtze U nivers ity, Jin gzhou, Hubei Province 430025, China)
Abstract: Kentucky blueg rass is one of the main coo-l season turfg rasses in No rth of China and the market
demand is huge. The seeds o f Kentucky blueg rass used in China are all from the overseas so far and their
adaptability is poor in view of plant diseases and pest damages. T herefore, the breeding of Kentucky blue-
grass is v er y important in China. In or der to test and compare the salt tolerance o f all lines and the func-
t ions o f CMO-BADH double gene and CMO gene and provide theoret ical evidence fo r salt- to lerant new va-
riety breeding, the ef fect o f NaCl st resses w as studied in this paper on the t issue culture o f t ransgenic Ken-
tucky blueg rass lines w ith CMO-BADH double gene and CMO gene. The r elat ive elect rical conduct ivity,
MDA content , SOD act ivity, CAT act iv ity, and POD act iv ity w ere measured. T he results show that the
relat iv e elect rical conduct ivity and MDA content of all lines w ere increased along w ith incr eased salt str ess
and the or der of all lines in those tw o physio logical t rait s w as CK > transgenic Kentucky blueg rass w ith
CMO gene> transgenic Kentucky blueg rass w ith CMO-BADH double gene. The SOD activ ity, CA T act iv-
ity, and POD act ivity of all lines w ere also increased under the salt st ress and the o rder of all lines in those
three physiolog ical tr ait s was t ransgenic Kentucky bluegrass w ith CMO-BADH double gene> transgenic
Kentucky bluegrass w ith CMO Gene> CK. In conclusion, the CMO gene and CMO-BADH double gene
收稿日期: 2007-09-27; 修回日期: 2007-11- 20
基金项目: 国家 863计划( 2006AA10Z132) ; 国家植物转基因产业化专项( J 2002-B- 006)
作者简介: 徐冰( 1982-) ,男,硕士研究生,研究方向为草地早熟禾转基因育种, E-mail: f oye866@ 163. com; * 通讯作者 Au th or for corr e-
spon dence, E-m ail: hanlb@ tom. com
草 地 学 报 第 16卷
could both enhance the salt to ler ance of t ransgenic Kentucky bluegr ass, but the CMO-BADH double gene
per formed bet ter than CMO gene. In summar y of all the physiolo gical t rait s, the salt tolerance order o f all
tested lines w as tr ansgenic Kentucky bluegr ass w ith CMO-BADH double gene> transgenic Kentucky blue-
grass w ith CMO gene> CK.
Key words: CMO-BADH double gene; CMO gene; Kentucky blueg rass; Salt tolerance
草地早熟禾( Poa p r atensis L. )喜光耐荫,抗寒
性强,绿期长, 颜色光亮鲜绿, 草质柔软,耐践踏,能
形成稠密的草皮, 常用于草坪或绿地的建植[ 1]。草
地早熟禾作为我国北方冷季型草坪的主要草种在我
国需求量很大,但迄今为止,我国草坪建植中所用的
草地早熟禾种子全是国外引进品种, 这些引进的品
种适应性差, 病虫害严重,因此草地早熟禾育种工作
在我国显得更为重要[ 2] 。
甜菜碱是一种非毒性的渗透调节剂, 甜菜碱的
积累使得许多代谢中的重要酶类在渗透胁迫下能保
持活性,这在植物抗逆生理中起到了非常重要的作
用[ 3] 。甜菜碱生物合成的前体为乙酰胆碱, 高等植
物中乙酰胆碱由胆碱单加氧酶( CMO)催化胆碱氧
化成甜菜碱醛,然后,甜菜碱醛脱氢酶( BA DH)催化
甜菜碱醛形成甜菜碱。现已分别在不同的植物中成
功克隆出 CMO基因和 BADH 基因,并已有实验室
成功地将 CMO或 BADH 基因转化其他作物,获得
的转基因植物的抗逆性具有了明显的提高[ 4~ 7] 。本
实验室也分别将 CMO 单基因表达载体和 CMO-
BADH 双基因表达载体转化到草地早熟禾愈伤组
织中,并获得了草地早熟禾的转基因植株[ 8, 9] 。
本实验以转 CMO-BADH 双基因和转 CMO基
因的阳性植株为材料, 通过测试相关的生理指标,对
各株系的耐盐能力进行评定, 同时还评价了两种基
因的转化在提高植株耐盐能力方面的差别,为最终
获得耐盐性状稳定的新品种提供了理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
转基因受体为商品种巴润 ( Baron)。以两个转
CMO-BADH 双基因株系( CB1, CB2)、两个转 CMO 基
因株系( C1, C2)和非转基因株系( CK)为实验材料。
1. 2 方法
将转基因草地早熟禾组培苗株系移栽至直径
25 cm, 高 35 cm 的花盆中, 于温室中培养, 并根据
生长情况进行扩繁, 基质为草炭土与沙子按照 3 1
体积比混合而成。分别选取生长状况基本一致的转
CMO-BADH 双基因株系 ( CB1, CB2)、转 CMO 基
因株系( C1, C2) 和非转基因株系( CK )进行 0% ,
1. 5% , 2%浓度的 N aCl盐胁迫试验, 每个处理 5个
重复, 每隔 1 d浇 1次 NaCl溶液。NaCl处理 6 d
后取功能叶片, 测定其细胞膜的透性, 丙二醛
( MDA)含量、超氧化物歧化酶( SOD)活性、过氧化
物酶( POD)活性、氧化氢酶 ( CAT )活性。细胞膜
透性的测试采用质膜差别透性法[ 1 0]。MDA 含量
的测定硫代巴比妥酸显色法 [ 11]。SOD活性的测定
采用核黄素-NBT 法, 以抑制氯化硝基氮蓝四唑
( NBT ) 光化还原 50% 为 1 个酶活性单位 [ 12] 。
CAT 活性的测定采用紫外吸收法测定 [ 13] 。POD
活性测定采用愈创木酚比色法 [ 14] 。利用 SPSS
13. 0软件对试验数据进行方差分析, 用 LSD法进
行多重比较。
2 结果与分析
2. 1 NaCl胁迫下各株系相对电导率变化
相对电导率越低,表明细胞质电解液外渗的越
少,细胞膜受到破坏的程度越低,细胞受到的伤害越
小[ 10]。在未进行 NaCl胁迫下, 各转基因株系和对
照草地早熟禾的相对电导率均较低,差异不显著; 但
随着 NaCl胁迫浓度的增加, 各株系的相对电导率
均呈上升趋势。方差分析结果表明,在 1. 5%和 2%
浓度的 NaCl的胁迫下, 各个株系间的相对电导率
的差异达到了显著水平。进一步多重比较结果表
明,在 1. 5%和 2%浓度的 NaCl的胁迫下,非转基因
株系的相对电导率最大, 说明其细胞受到盐胁迫的
伤害最大;转 CMO 基因株系相对电导率次之, 细胞
受到盐胁迫的伤害较小;转 CMO-BADH 双基因株
系相对电导率最小, 细胞受到盐胁迫的伤害最小(图
1、表 1)。
354
第 2期 徐冰等:草地早熟禾转 CM O-BADH 双基因和转 CMO基因耐盐性分析
2. 2 NaCl胁迫下各株系MDA含量的变化
植物器官衰老时, 或在逆境条件下,往往发生膜
脂过氧化作用, M DA 是其产物之一, 通常利用它作
为脂质过氧化指标, 表示细胞膜脂过氧化程度和植
物对逆境条件反应的强弱 [ 11]。在未进行胁迫时,各
转基因株系和非转基因株系的 MDA 含量均比较
低,差异不显著; 但随着 N aCl胁迫浓度的增加, 各
株系的 MDA 含量均呈上升趋势。方差分析结果表
明,在 1. 5%和 2%浓度的 N aCl胁迫下,各个株系间
的 MDA含量的差异均达到了显著水平。进一步的
多重比较结果表明, 1. 5%和 2%浓度的 NaCl的胁迫
下,非转基因株系的 MDA 含量最大, 说明其膜脂过
氧化作用的水平最高,盐胁迫对其细胞膜系统的伤害
最大;转 CMO基因株系的 MDA含量次之,说明其膜
脂过氧化作用的水平较低,盐胁迫对其细胞膜系统的
伤害较低;转 CMO-BADH 双基因株系的 MDA 含量
最小,说明其膜脂过氧化作用的水平最低, NaCl胁迫
对其细胞膜系统的伤害最低(图 2、表 2)。
图 1 不同浓度 NaCl下各株系相对电导率变化
Fig . 1 Relative elect rical conduct ivit y of a ll lines under
different NaCl concentrat ion treatments
表 1 不同浓度 NaCl下株系间相对电导率多重比较
T able 1 Multiple comparisons o f the relat ive electr ical conductivity of all lines under different NaCl concentrat ion treatments
株系
Line
相对电导率( % )
Relat ive elect rical
conduct ivity
NaCl浓度( 0. 0% )
NaCl
concent rat ion
株系
Line
相对电导率( % )
Relat ive elect rical
conduct ivity
NaCl浓度( 1. 5% )
NaCl
concent rat ion
株系
Line
相对电导率( % )
Relat ive elect rical
conduct ivity
NaCl浓度( 2. 0% )
NaCl
concent rat ion
CB2 5. 098711 a CK 34. 66455 a CK 78. 51033 a
C2 4. 553717 a C1 26. 38937 b C2 40. 65593 b
C1 4. 381223 a C2 24. 01806 b C1 37. 69574 b
CB1 3. 945186 a CB1 18. 10505 c CB1 32. 79756 c
CK 3. 708431 a CB2 17. 5275 c CB2 26. 46738 d
注:多重比较采用 LSD法,同列中不同小写字母间差异显著( P< 0. 05) ,下表同
Note: Means follow ed by the dif feren t small let ters w ithin the same NaC l concent rat ion are s ignif ican tly dif ferent at 0. 05 level according to
the LSD mult iple comparison; sam e as the follow ing tab les
图 2 不同浓度 NaCl下各株系丙二醛含量变化
Fig . 2 MDA contents o f all lines under different NaCl
concentr at ion tr eat ments
2. 3 NaCl胁迫下各株系 SOD活性的变化
SOD普遍存在于动、植物体内, 是一种清除超
氧阴离子自由基的酶,反应产物 H 2O 2 由过氧化氢
酶进一步分解或被过氧化物酶利用 [ 12] 。在未进行
胁迫时,各转基因株系和非转基因株系的 SOD活
性均较低, 差异不显著; 但随着 NaCl胁迫浓度的
增加, 各株系的 SOD活性均呈上升趋势,但非转基
因株系的 SOD活性增幅相对不大。方差分析结果
表明, 在 1. 5%和 2%浓度的 NaCl的胁迫下, 各个
株系间的 SOD活性的差异达到了显著水平。进一
步多重比较结果表明, 1. 5% NaCl的胁迫下, 株系
间的 SOD活性的大小顺序为: CB2 大于 CB1、C1、
C2大于非转基因株系; 2. 0% NaCl的胁迫下, 株
系 SOD活性大小的顺序为: CB2、CB1大于 C1、C2
大于非转基因株系。1. 5% NaCl的胁迫下, CB1与
355
草 地 学 报 第 16卷
转 CMO基因两个株系间的 SOD 活性差异不显
著;而在2. 0% NaCl的胁迫下, CB1 的 SOD活性
却显著高于转 CMO 基因两个株系的 SOD 活性
(图 3、表 3)。
表 2 不同浓度 NaCl下株系间MDA含量多重比较
Table 2 Multiple compar isons of the MDA content o f all lines under differ ent NaCl concent ration t reatments
株系
Line
丙二醛含量
( umol/ g)
MDA content
NaCl浓度( 0. 0% )
NaCl
concent rat ion
株系
Line
丙二醛含量
( umol/ g)
MDA content
NaCl浓度( 1. 5% )
NaCl
concent rat ion
株系
Line
丙二醛含量
( umol/ g)
MDA con tent
NaCl浓度( 2. 0% )
NaCl
concent rat ion
CB1 6. 475272 a CK 20. 70414 a CK 45. 9345 a
CK 5. 999405 a C2 15. 46478 b C2 26. 68843 b
CB2 5. 848251 a C1 14. 97445 b C1 25. 23606 b
C1 5. 518619 a CB1 11. 23556 c CB1 21. 77753 c
C2 5. 100059 a CB2 10. 83958 c CB2 17. 17472 d
图 3 不同浓度 NaCl下各株系 SOD 活性变化
F ig . 3 SOD activ ity of all lines under differ ent
NaCl concentrat ion tr eatments
2. 4 NaCl胁迫下各株系 CAT活性的变化
植物在代谢过程中所产生的H2O2可导致细胞进
行破坏性的氧化作用,而植物体内的 CAT 与 POD则
可以清除 H2O2 ,是植物体内重要的活性氧清除系统
之一[ 13]。在未进行胁迫时, 各转基因株系和非转基
因株系的 CAT 活性均较低, 差异不显著。在进行
NaCl胁迫的情况下,各株系的 CAT 活性均呈上升趋
势;但非转基因株系的 CAT 活性增幅相对较小。当
NaCl胁迫强度由 1. 5%提高到 2%时, 非转基因株系
的CAT 活性有所下降, C1、C2和 CB1的 CAT 活性增
幅较小; CB2的 CAT 活性有明显的增加。方差分析结
果表明,在1. 5%和 2%浓度的 NaCl的胁迫下,各株系
的CAT 活性的差异达到了显著水平。进一步多重比
较结果表明,在1. 5%和2%浓度的 NaCl的胁迫下,各
株系 CAT 活性大小顺序为:转 CMO-BADH 双基因株
系> 转 CMO基因株系> 非转基因株系(图4、表4)。
表 3 不同浓度 NaCl下株系间 SOD活性多重比较
Table 3 M ultiple com par isons of the SOD activ ity of all lines under differ ent NaCl concentration treatments
株系
Line
SOD活性
(U / g)
SOD act ivity
NaCl浓度( 0. 0% )
NaCl
concent rat ion
株系
Line
SOD活性
( U/ g)
SOD act ivity
NaCl浓度( 1. 5% )
NaCl
concent rat ion
株系
Line
SOD 活性
( U/ g)
SOD act ivity
NaCl浓度( 2. 0% )
NaCl
concent rat ion
C1 161. 8001 a CB2 297. 1992 a CB2 315. 885 a
C2 154. 7066 a CB1 270. 6919 b CB1 297. 794 a
CK 151. 6989 a C2 261. 608 b C1 271. 341 b
CB1 149. 7309 a C1 256. 7285 b C2 269. 004 b
CB2 146. 4388 a CK 206. 2184 c CK 227. 893 c
表 4 不同浓度 NaCl下株系间 CAT活性多重比较
Table 4 Multiple compa risons of the CAT activity o f all lines under different NaCl concentr ation tr eatments
株系
Line
CAT 活性
( U/ g. min - 1)
CAT act ivity
NaCl浓度( 0. 0% )
NaCl
concent rat ion
株系
Line
CAT 活性
( U/ g. min - 1)
CAT act ivity
NaCl浓度( 1. 5% )
NaCl
concent rat ion
株系
Line
CAT 活性
( U/ g. m in- 1 )
CAT act ivity
NaCl浓度( 2. 0% )
NaCl
concent rat ion
CB2 59 a CB2 324 a CB2 364 a
CB1 54 a CB1 310 a CB1 326 b
C1 53 a C1 276 b C1 292 c
CK 52 a C2 272 b C2 277 c
C2 51 a CK 184 c CK 161 d
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第 2期 徐冰等:草地早熟禾转 CM O-BADH 双基因和转 CMO基因耐盐性分析
图 4 不同浓度 NaCl下各株系 CAT活性变化
Fig . 4 CAT act ivity o f all lines under different
NaCl concentrat ion tr eatments
2. 5 NaCl胁迫下各株系 POD活性的变化
植物在代谢过程中所产生的 H2O2 可导致细胞
进行破坏性的氧化作用, 而植物体内的 CAT 与
POD则可以清除 H 2O 2 , 是植物体内重要的活性氧
清除系统之一 [ 14]。在未进行胁迫时,各转基因株系
和非转基因株系的 POD活性均较低,而且差异不显
著;但随着 NaCl胁迫浓度的增加,各株系的 POD
活性均呈上升趋势, 但非转基因株系的 POD活性增
幅相对不大。方差分析结果表明, 在 1. 5%和 2%浓
度的 NaCl的胁迫下, 各株系间的 POD 活性的差异
达到了显著水平。进一步多重比较结果表明, 1. 5%
和 2%浓度的 N aCl的胁迫下,各株系 POD 活性大
小顺序为: 转 CMO-BADH 双基因株系> 转 CMO
基因株系> 非转基因株系(图 5、表 5)。
图 5 不同浓度 NaCl下各株系 POD 活性变化
Fig . 5 POD activ ity o f all lines under different
NaCl concent ration t reatments
表 5 不同浓度 NaCl下株系间 POD活性多重比较
T able 5 Multiple comparisons o f the POD activit y of all lines under different NaCl concentrat ion treatments
株系
Line
POD 活性
( U g- 1 .min- 1 )
POD activity
NaCl浓度( 0. 0% )
NaCl
concent rat ion
株系
Line
POD 活性
( U g- 1 . min- 1 )
POD activity
NaCl浓度( 1. 5% )
NaCl
concent rat ion
株系
Line
POD 活性
( U g- 1 . min- 1 )
POD act ivity
NaCl浓度( 2. 0% )
NaCl
concent rat ion
CK 440 a CB2 810 a CB1 925 a
C1 430 a CB1 780 a CB2 920 a
CB1 420 a C1 675 b C2 725 b
CB2 410 a C2 625 b C1 715 b
C2 400 a CK 505 c CK 560 c
3 讨论与结论
甜菜碱生物合成的前体为乙酰胆碱, 高等植物
中乙酰胆碱由胆碱单加氧酶( CMO )催化胆碱氧化
成甜菜碱醛, 然后,甜菜碱醛脱氢酶( BADH)催化甜
菜碱醛形成甜菜碱。甜菜碱是一种非毒性的渗透调
节剂,有较大的水溶性, 能调节渗透势, 但又不进人
蛋白质的水化膜内, 由于被排斥在膜的外表而有益
于保护和稳定细胞蛋白质结构,防止酶变性失活[ 3]。
将 CMO 或BADH 基因转化其他植物, 导致植物体
中甜菜碱含量的增加, 可以获得抗逆性明显提高的
转基因植物[ 4~ 7] 。本实验通过测定各株系电导率的
变化和 MDA的含量, 反映出逆境胁迫下质膜的伤
害程度和所测材料抗逆性的大小; 通过测定 SOD、
CA T 和 POD的活性, 反映转基因株系中增加的甜
菜碱在防止酶变性失活中起到的作用。综合以上指
标,间接的评价出各株系耐盐性的强弱和目的基因
的表达效果。
通过对转 CMO-BADH 双基因草地早熟禾、转
CMO基因草地早熟禾、非转基因草地早熟禾进行
1. 5%和 2. 0%浓度 NaCl的胁迫试验, 测定其细胞
膜的透性, MDA 含量、SOD 活性、POD 活性、CAT
活性的变化。结果显示, 各个株系的相对电导率、
MDA 含量均随盐浓度的增加而增大, 在 NaCl胁迫
357
草 地 学 报 第 16卷
下各株系相对电导率、MDA 含量的大小顺序为:非
转基因株系> 转 CMO 基因株系> 转 CMO-BADH
双基因株系。表明按此顺序, 细胞膜脂过氧化程度
依次降低,植物遭受逆境伤害的程度依次降低。各
个株系的 SOD、POD、CAT 活性在 NaCl的胁迫下
都有明显的提高; 在 NaCl的胁迫下, 各株系此 3种
酶活性的大小顺序为: 转 CMO-BADH 双基因株系
> 转 CMO基因株系> 非转基因株系。表明按此顺
序, 3种酶的活性依次降低,清除超氧阴离子自由基
的能力和清除植物体内的 H 2O 2 的能力依次降低。
但也有例外的情况,如:在 1. 5% NaCl胁迫下,
CB1与转 CMO 基因两个株系间的 SOD 活性差异
并不显著, 而 CB1和 CB2之间 SOD活性的差异却
达到显著水平(见表 3) ;在 2. 0% NaCl胁迫下, CB1
和 CB2的相对电导率、丙二醛含量和 CA T 活性的
差异也达到了显著水平(表 1、表 2和表 4)。两个转
CMO-BADH 双基因草地早熟禾株系在以上指标上
存在明显的差异。这可能是两个转 CMO-BADH
双基因株系外源基因插入染色体位点不同,独立转
化体间出现显著差异而造成的。这与李艳霞等的研
究结论是相同的[ 15~ 18] 。
由实验结果可以看出, CMO 基因和 CMO-
BADH 双基因的转化均能提高草地早熟禾的清除
超氧阴离子自由基的能力和清除过氧化氢的能力,
降低细胞膜在渗透胁迫下受到伤害的程度,增强植
物的耐盐能力; 但是两者的效果却有明显的不同。
综合考虑所有的指标, 各株系耐盐性的大小顺序为:
转 CMO-BADH 双基因株系> 转 CMO基因株系>
非转基因株系。由此也可看出, 对于提高草地早熟
禾的耐盐能力而言, CMO-BADH 双基因的效果要
好于 CMO基因。
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(责任编辑 梁艳萍)
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