全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2005) 02-0162-04
苜蓿菌核病生防菌及化学药剂的筛选
张　薇1 ,魏海雷2,张力群2,胡跃高1*
( 1. 中国农业大学草业工程研究中心, 北京 100094; 2. 中国农业大学植物病理系, 北京 100094)
摘要: 通过毒力测定法比较 11种化学药剂对苜蓿菌核病的抑菌效果, 其中 45%五氯·福、50%速克灵和 55%甲硫·菌
核净可湿性粉剂 3000 倍液均能抑制病原菌生长。温室生测表明 45%五氯·福防治苜蓿菌核病效果最好 , 500 倍液防效
达 73. 9%。从江苏省句容地区苜蓿根围土壤中分离到 415 株细菌,采用平皿对峙法从中筛选到 3 株对菌核病具有拮抗效
果的生防菌,代号 S1 和 S2 的菌株抑菌效果最好, 抑菌带超过 1. 5 cm。温室生测菌株 S2对苜蓿菌核病的生防效果最好,
接种病原菌 10 d 后防效达 67. 5% , 15 d 后为 61. 7%。
关键词: 苜蓿菌核病;三叶草核盘菌; 生物防治;化学防治
中图分类号: S 812. 6　　　文献标识码: A
Screening of Microbes and Fungicides for Controlling
Alfalfa Sclerotinia Stem Rot
ZHANG Wei
1 , WEI Hai-lei
2, ZHANG Li-qun
2, HU Yue-gao
1*
( 1. Forage Indus try Engin eering Research Center, C ol lege of Agronomy and Biotechnology , Chin a Agricu ltural
University, Beijin g 100094, China;
2. Department of Plan t Path ology, Ch ina Agricultural University, Beijing 100094, China)
Abstract: Sclerotinia trif olior um NJ1 is the pathogene causing scler ot inia stem r ot of alfalfa. T he tox icity o f 11
fungicides against NJ1 w ere measured to determine their eff iciency in inhibit ing the g row th of mycelium .
Thiophanate-methyl+ dimetachlone, sumelix or quintozene-thiram, w hen diluted 3 000 times, could completely
rest rain the germ inat ion of S. tr if ol iorum NJ1 on a PDA plate. Furthermore, it w as show n that quintozene-
thiram ( 500×) , the most ef fect ive agent , had an eff iciency of 73. 9% in controlling alfalfa sclerot inia stem r ot .
Three bacterial agents, screened from 415 st rains isolated fr om alfalfa sclerot inia stem ro t r hizo sphere so il in
Jurong , Jiangsu Province, w ere found to be able to inhibit NJ1 in the dual-cultur e test on PDA plates. Among
them strains S1 and S2 w er e the st rongest antagonists w ith suppr essive bands exceeding 1. 5 cm . In the
gr eenhouse, st rain S2 w as the best agent to control alfalfa sclero tinia stem rot , the eff iciency 10 d and 15 d
after pathogene inoculat ion reached 67. 5% and 61. 7% , respect ively.
Key words : Alfalfa scler ot inia stem rot ; Sclerotinia t rif ol ior um; Biological cont rol ; Chem ical cont rol
　　苜蓿菌核病是由三叶草核盘菌 ( Sclerotinia
trif oliorum)引起的一种世界性的苜蓿病害, 它严重影
响了苜蓿的产量和品质。近年来随着我国苜蓿引种和
种植面积的扩大,菌核病在我国南方许多地区时有发
生。笔者 2001年 8月对南京郊区苜蓿种植区的病害调
查结果显示, 菌核病在各类病害中发病率最高, 达
30%左右, 病情指数高达 75%, 给当地苜蓿生产带来
极大损失。
曾对苜蓿生产造成严重危害的苜蓿褐斑病( Comm-
on leaf spot )、根和根颈腐烂病 ( Cr ow n and root rot )
收稿日期: 2004-02-26;修回日期: 2004-06-05
基金项目:农业部跨越计划项目“青刈黑麦、苜蓿产业化生产技术集成试验示范”( 2000-24)
作者简介:张　薇 ( 1979-) , 女,博士研究生, 主要从事农业系统工程及牧草病虫害研究; * 通讯作者 Author for cor respondence　E-mail:
h uyuegao@ cau. ed u. cn
第 13卷　第 2期
　Vo l. 13　　No. 2
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　　2005年　 6 月
　June 　　2005
已得到较多研究 [ 1～4] , 而苜蓿菌核病的研究却鲜有报
道,目前有关菌核病的研究主要集中于重要经济和油
料作物如大豆、向日葵、花生、油菜等[ 5～8]。本研究从众
多化学药剂中筛选防治苜蓿菌核病的低毒、高效杀菌
剂,并从苜蓿菌核病区土壤中分离拮抗菌, 以期对该病
的防治提供依据。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
1. 1. 1　病原菌 S . tr if oliorum N J1来自中国农业大学
草业工程研究中心;生防细菌 B130、B908, 木霉菌 T 4、
T 10、XW2来自中国农业大学植物病害生物防治实验
室;生防细菌 S1、S2、S3分离自江苏省句容市磨盘乡
潘冲村苜蓿菌核病土。
1. 1. 2　苜蓿(M edicago sativ a)种子( Dur ango, Cana-
da)购自中国种子集团公司。
1. 1. 3　11种杀菌剂: 25%多·酮可湿性粉剂( Carbe-
ndazim-T riadimefon,江苏省绿盾植保农药实验有限
公司)、50%速克灵可湿性粉剂( Sumilex ,日本住友化
学工业株式会社)、55%甲硫·菌核净可湿性粉剂
( T hiophanate-Methy l + Dimetachlone, 山东神星农
药 )、75%百菌清可湿性粉剂 ( Chlorothalonil , 日本
SDS Biotech K . K)、50%福美双可湿性粉剂( T hir am ,
天津市捷康化学品有限公司)、45%五氯·福可湿性粉
剂 ( Quintozene-T hiram , 山东绿丰农药有限公司 )、
20%乙酸铜可湿性粉剂( Copper Acet ic Acid, 山东绿
丰农药有限公司)、77%氢氧化铜可湿性粉剂( Copper
Hydrox ide, 美国固信公司)、50%多菌灵可湿性粉剂
( Carbendazim ,石家庄市华星农药厂)、55%敌磺纳可
湿性粉剂( Fenaminosulf , 辽宁省丹东市农药总厂)、
60%琥·乙膦铝可湿性粉剂( Fosetyl-Aluminium , 齐
齐哈尔四友化工实业有限公司)。
1. 2　药剂抑菌试验
各化学药剂设 500、1000、1500倍浓度进行初筛。
方法如下: 将称量好的药剂与熔化的 PDA 15 ml 混
合,倒平板。以不添加药剂的 PDA 为对照( CK ) ,每处
理设 4个重复。平皿(直径 9 cm )中央接种培养 2 d 的
病原菌菌丝边缘打孔的菌饼 (直径 0. 7 cm) , 23℃培
养。至对照菌丝长至培养皿边缘时测量处理菌落直径,
计算菌丝净生长量和抑制百分率[ 9] , 差异显著性用
Duncan 测验法( P= 0. 05) 分析 。
对初筛中能够显著抑制病原菌生长的药剂进行复
筛,浓度梯度为 2000倍、2500和 3000倍,方法同上。
抑制率= ( CK 净生长量- 处理净生长量) / CK 净
生长量×100%
净生长量= 菌落直径- 菌饼直径
1. 3　杀菌剂温室生测
苜蓿种子经 70%酒精 30 s, 1% NaClO 3～5 min
表面消毒后, 用蒸馏水冲洗 5次, 置于培养皿中, 加少
量水, 28℃催芽 20 h 后播种于灭菌土,每处理设 3 次
重复, 各 5个苗钵( 10 cm×9. 7 cm×6. 4 cm ) ,每钵播
20粒种子, 待长至五叶期时按土重的 0. 1%接种病原
菌麦麸培养物,上层覆盖 1 cm 灭菌土。接种 5 d 后分
别喷洒化学药剂, 各药剂设 500、1000和 2000倍浓度。
以不接病原菌( CK + )和不喷洒药剂( CK - )为对照。依
据文献[ 10]所述分级标准计算病情指数和防效, 差异
显著性用Duncan 测验法( P= 0. 05) 分析。
1. 4　拮抗菌的分离和筛选
采用梯度稀释法从句容苜蓿菌核病土中分离细
菌。取1 g 土样溶于9 m l灭菌水,以 10倍为基数,系列
稀释至 105 倍, 各取 100
l均匀涂布于 LB 平板上,
28℃培养 72 h, 挑取形态有明显差异的菌落保存备
用。采用平皿对峙法筛选拮抗 S . trif oliorum NJ1的细
菌,挑取新鲜活化的生防菌接种于 PDA 平板近边缘
1. 5 cm 处, 28℃培养 24 h 后于平板中央接种病原菌
菌饼, 23℃培养约 3～4 d,病原菌菌丝长至培养皿边缘
时测定抑菌带大小,每处理重复 3次。应用同样方法检
测生防细菌 B130、B908, 木霉菌 T 1、T 4、T 10 对 S .
trif oliorum NJ1的拮抗能力。
1. 5　生防菌生物测定
将筛选到的拮抗细菌接种于 LB培养液中 28℃培
养 48 h。苜蓿种子催芽后分别浸于浓度为 108 CFU/ m l
的各生防菌液中 20 min, 无菌水作对照。播种后到五
叶期时接种病原菌,方法同 1. 3。
2　结果与分析
2. 1　杀菌剂对菌核病的杀菌毒力
供试 11种杀菌剂中, 45%五氯·福、50%速克灵、
25%多·酮、75%百菌清、50%福美双和 55%甲硫·
菌核净的 1500倍液能够完全抑制病原菌生长(数据未
列出)。对以上6种药剂降低浓度进行复筛。结果表明,
45%五氯·福、50%速克灵和 55%甲硫·菌核净 3种
药剂的抑菌效果最好, 3000倍液的抑菌率均为 100%
(表 1)。福美双次之,其 2000倍液的抑菌率为 100% ,
163第 2期 张薇等:苜蓿菌核病生防菌及化学药剂的筛选
2500和 3000倍液的抑菌效果均达 98. 8%。供试药剂
中, 25%多·酮的抑菌效果最差, 但抑菌率也能达到
80%以上。结果表明,供试的6种杀菌剂在平板检测中
都表现出较强的抑菌效果。
表 1　不同杀菌剂的室内抑菌作用
Table 1　I nhibition o f different fungicides on the mycelium g row th
处理
T reatmen ts
2000× 2500× 3000×
菌丝净生长量
Amoun t of net
grow th( cm )
抑制率
Inh ibit ing
ratio( % )
菌丝净生长量
Amount of net
growth (cm)
抑制率
In hibit ing
ratio ( % )
菌丝净生长量
Amount of net
grow th( cm )
抑制率
Inhibi tin g
rat io ( % )
对照( CK) 8. 30a - 8. 30a - 8. 30a -
50%福美双 WP thir am 0d 100. 0a 0. 10d 98. 8a 0. 10d 98. 8a
75%百菌清 WP chlorothalonil 0. 90c 89. 0b 0. 50c 92. 0b 0. 96c 88. 0b
25%多·酮 WP carb endazim-t riadimefon 1. 57b 81. 0c 1. 43b 83. 0c 1. 40b 83. 0c
50%速克灵 WP sumilex 0d 100. 0a 0d 100. 0a 0d 100. 0a
55%甲硫·菌核净 WP thioph anate-
meth yl+ dimetachlone
0d 100. 0a 0d 100. 0a 0d 100. 0a
45%五氯·福 WP quin tozene-th iram 0d 100. 0a 0d 100. 0a 0d 100. 0a
　　注: WP 表示可湿性粉剂,表中数据为 4次重复平均值;同列中不同字母间差异显著( P = 0. 05)
Note: WP means w etable pow der. Data in the table are th e averag es of 4 repeats. Data follow ed by dif ferent let ter s in th e same column m ean
sign ifican t dif f erences at a 0. 05 level
2. 2　杀菌剂防病试验
为进一步筛选防治苜蓿菌核病的高效化学药剂,
对平板抑菌效果最好的 55%甲硫·菌核净、50%速克
灵和 45%五氯·福进行室内生物测定。喷药 7 d后调
查病情指数, 阳性对照均未发病, 阴性对照发病严重,
病情指数为 77. 6。从表 2可以看出, 各药剂不同浓度
处理的病情指数均显著低于对照,且同一浓度不同药
剂间差异显著( P< 0. 05)。45%五氯·福各个浓度的
病情指数都显著低于另外两种药剂和对照,其 2000倍
液防效超过 50% ,防效最高的 500倍液达到 73. 9%。
三种药剂不同浓度的防效均表现为: 45%五氯·福>
50%速克灵> 55%甲硫·菌核净。结果表明, 45%五氯
·福是防治苜蓿菌核病的高效化学药剂。
表 2　化学药剂对苜蓿菌核病的防治效果
Table 2　Efficiency of each fung icide for contr olling alfalfa sclero tinia st em ro t
处理
T reatmen ts
病情指数 Diseas e index
500× 1000× 2000×
防效( % ) Cont rol eff iciency
500× 1000× 2000×
对照( CK) 77. 6a -
55% 甲硫·菌核净 WP
thiophanate-meth yl+ dimetachlone
42. 3b 49. 8b 54. 3b 45. 4 35. 8 30. 0
50% 速克灵 WP sumilex 29. 8c 38. 8c 45. 2c 61. 6 49. 9 41. 7
45% 五氯·福 WP quintozene-thiram 20. 3d 28. 4d 36. 9d 73. 9 63. 6 52. 4
　　注: WP 表示可湿性粉剂,表中数据为 3次重复平均值。同列中不同字母间差异显著( P= 0. 05)
Note: WP means w etable p ow der. The data in the table are averages of 3 r epeats . Data follow ed by d iffer ent letters in the s ame colum n m ean
sign ifican t dif f erences at a 0. 05 level
2. 3　生防菌对菌核病的拮抗能力
利用平板对峙法,对从江苏句容地区苜蓿菌核病
土中分离到的 415株细菌中, 筛选出 3种对病原菌有
明显拮抗作用的细菌, 代号分别为 S1、S2、S3。比较各
生防菌株的抑菌带, 供试细菌比木霉属真菌抑菌效果
好,其中 S1、S2、B130和B908较为显著(表 3) , 而木霉
菌 T 4对 S. tr if ol iorum N J1几乎没有拮抗作用。
2. 4　生防菌生物测定
对主要拮抗细菌进行温室防病试验。结果阳性对
照未发病,阴性对照接种病原菌 10 d后病情指数迅速
升高, 15 d后达 86. 6%(表4)。各处理病情指数随着时
间延长而增加,不同时间各生防菌处理病指均显著低
于阴性对照, 各处理之间差异显著。其中以 S2防效最
好,病情指数显著低于其它处理, 10 d 时达到最高防
效 67. 5% ,而且在对照发病接近 90%时防效仍维持在
60%以上,防效持续时间长且效果稳定。此外S1、B908
和 B130也对苜蓿菌核病表现出较好的防效( 40%～
50%) , 病情指数间差异不显著,但效果不如 S2 稳定,
S3在 10 d、15 d 病情指数与其他菌株差异显著, 对苜
蓿菌核病的防效较差,最高防效不及 50%。结果表明,
164 草　地　学　报 第 13卷
从苜蓿菌核病土分离的 S2是防治苜蓿菌核病的较好
菌株。
表 3　生防菌对菌株 NJ1的拮抗效果
Table 3　Antagonistic abilit y of ea ch bio contr ol agent to
S . trif oliorum NJ1 on PDA plates
菌株 S t rains
抑菌带宽 Width
of supp res sive
b and ( cm )
菌株 St rains
抑菌带宽 Width
of suppres sive
ban d ( cm)
S1 1. 6 B908 1. 4
S2 1. 8 木霉 T 4 0
S3 0. 4 木霉 T 10 0. 5
B130 1. 3 木霉 XW2 0. 7
　　注:表中数据为 3次重复平均值; Note: Data in the table are the
averages of 3 repeats
表 4　生防菌对菌核病的防治效果
T able 4　Effect of bio contro l bacter ia on suppression of NJ1
处理
T reatments
病情指数 Disease in dex
7 d 10 d 15 d
防效( % ) Con trol ef ficiency
7 d 10 d 15 d
对照( CK) 41. 7a 67. 3a 86. 6a - - -
S1 21. 4bc 32. 8c 51. 4c 48. 7 51. 3 40. 6
S2 17. 7c 21. 9d 33. 2d 57. 6 67. 5 61. 7
S3 27. 9b 53. 4b 74. 7b 32. 0 20. 7 14. 1
B130 19. 9bc 31. 3c 48. 5c 52. 4 53. 5 44. 0
B908 18. 5c 30. 9c 46. 1c 55. 7 54. 1 46. 8
　　注: 表中数据为 3 次重复平均值; 同列中字母间差异显著
( P = 0. 05)
Note: Data in the table are th e averages of 3 repeats ; Data
follow ed b y d ifferent let ters in th e s ame column mean s ignif icant
dif ferences at a 0. 05 level
3　讨论与结论
3. 1　近年来在江南丘陵地区发生的苜蓿菌核病给当
地畜牧业生产带来了巨大损失。据调查,该病每年在 3
月初至 4月中旬、10月至 11月间出现两次发病高峰,
形成的菌核遗落于田间并越冬, 次年形成初侵染。由于
不能有效清除田间菌核,为防治带来困难, 且有逐年加
重的趋势。张薇等已对当地苜蓿菌核病的病原进行了
分 离鉴 定, 确定 病 原菌 为三 叶草 核 盘菌 ( S .
trif oliorum ) , 并对其生物学特性进行了深入研究(待
发表)。本文结合病原菌的特点,从化学防治和生物防
治入手,筛选对苜蓿菌核病有效的化学药剂和生防菌。
3. 2　本研究通过室内毒力测定从 45%五氯·福等 11
种药剂中筛选出 6种效果较好的药剂, 利用同样方法
对这 6种药剂的低浓度毒力进行了测定。结果显示, 当
浓度稀释到 3000 倍时 45%五氯·福、50%速克灵和
55%甲硫·菌核净对病原菌的抑制率仍达到 100%。
温室生测中, 45%五氯·福 500～2000 倍液对苜蓿菌
核病都有较好的防治效果。随药剂浓度降低,各药剂的
病情指数均有所上升而防效降低,说明浓度是影响防
治效果的重要因素。这三种药剂中 45%五氯·福市场
价最低,综合考虑毒性残留和药剂成本问题,可对其继
续开展田间实验,根据生产需要确定最佳浓度和最佳
喷施时间。45%五氯·福、50%速克灵、55%甲硫·菌
核净 3种药剂均属保护性杀菌剂,可以通过抑制病菌
细胞呼吸作用或改变细胞膜透性病菌来抑制生长, 因
此提倡在病害发生之前施用药剂。
3. 3　生物防治以其独特的优势越来越受到植保工作
者的重视,已有实验表明,某些细菌和真菌对油菜菌核
病有生防效果 [ 11～12]。本试验通过平板对峙法筛选到几
株有效抑制 S . tr if ol iorum NJ1的生防菌,温室生测表
明 S2生防效果较好。平板对峙实验中发现菌株 S2的
抑菌带中出现透明晶亮的晕带, 这可能是S2产生的次
生抗菌物质, 对其种类的鉴定和抑菌机理正在研究之
中。本实验中生防菌的抑菌效果虽不及杀菌剂, 但其稳
定的防效以及良好的生态效应仍值得深入研究, 可继
续开展田间防效实验, 以期明确其生防潜力。
参考文献
[ 1]　袁庆华, 张文淑, 李　敏. 苜蓿褐斑病的离体叶接种研究[ J ] .草
地学报, 2001, 9( 1) : 21-24
[ 2]　袁庆华, 张文淑. 苜蓿抗褐斑病遗传资源离体叶筛选及田间评价
[ J ] .草地学报, 2003, 11( 3) : 205-209
[ 3]　李敏权, 杨宝生, 侯　军, 等. 四种杀菌剂对苜蓿根和根颈腐烂
病菌的室内毒力测定[ J] .草地学报, 2002, 10( 4) : 270-273
[ 4] 　李敏权, 柴兆祥, 李金花, 等.定西地区苜蓿根和根颈腐烂病病
原研究[ J ] .草地学报, 2003, 11( 1) : 83-86
[ 5]　马汇泉, 郑　雯, 靳学慧, 等.大豆菌核病的药剂防治[ J ] .农药,
2001, 40( 1) : 29-32
[ 6]　徐秀娟, 赵志强, 宋文武, 等.花生菌核病及其防治研究[ J] .山东
农业大学学报(自然科学版) , 2003, 34( 1) : 33-36
[ 7 ]　梁长城, 周文华, 赵爱民.油菜菌核病的发生规律及其防治 [ J ] .
作物研究, 2002, ( 3) : 134-135
[ 8] 　刘　秋, 于基成, 房德纯, 等.向日葵菌核病的生物学特性研究
[ J ] .辽宁农业科学, 2000, ( 4) : 1-4
[ 9]　操海群, 岳永德, 彭镇华, 等.竹提取物的抗真菌作用[ J] .植物保
护学报, 2003, 30( 1) : 35-39
[ 10] 郑　雯, 郭永霞, 辛惠普, 等.春油菜菌核病药剂防治试验[ J] .农
药, 2000, 39( 10) : 29-30
[ 11] 廖晓兰, 罗　宽.油菜花上细菌的分离及其对菌核菌的拮抗作用
[ J ] .湖南农业大学学报, 2000 , 26 ( 4) : 296-298
[ 12] 黄拔山, 陈建生, 李允章. 油菜菌核病生物防治研究[ J ] .上海农
业科技, 1995, 1: 27-28
165第 2期 张薇等:苜蓿菌核病生防菌及化学药剂的筛选