全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2002) 01-0024-04
苏丹草与拟高粱远缘杂交初报*
钟小仙1 , 顾洪如1 , 丁成龙1, 白淑娟1, 向阳海2 , 刘朝晖2
( 1.江苏省农业科学院土壤肥料研究所, 南京 210014; 2.江苏省农业科学院遗传生理研究所, 南京 210014)
摘要: 通过苏丹草与拟高梁杂交, 获得了远缘杂种 F1 代,远缘杂交成功率 1%左右, F 1种子的发芽率约 20%。F 1花
粉母细胞减数分裂中期染色体镜检为 10 个二价体,染色体配对正常。采用 RAPD 分子标记技术对 F1 真假杂交种
进行快速鉴定, 提高了育种效率。杂种 F1 代大田表现对叶斑病轻感, F 2代田间表现明显的抗/感分离, 为苏丹草抗
病育种提供了可能。
关键词: 苏丹草; 远缘杂交; 抗叶斑病育种
中图分类号: Q321. 3 文献标识码: A
Study on Sorghum sudanese×S. propinguum interspecies hybridization
ZHONG Xiao-x ian
1 , GU Hong-ru
1, DING Cheng-long
1,
BAI Su-juan
1 , XIA NG Yang-hai
2, L IU Zhao-hui
2
( 1. Ins titute of Soil an d Ferti lizer Ins ti tu te, J ian gsu Academ y of Agr icul tur al S cien ce, Nanjing 210014, C hina;
2. Ins ti tu te of Agrobiological Genet ics and Physiology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences , Nanjing 210014, Ch ina)
Abstract: Interspecies hybrids( F1 ) w er e obtained by distant crossing betw een S . sudangrass ( P iper) Stapf .
and S . p r op inguum ( Kunth ) Hifehe. T he successful pr obability of hybridizat ion is about 1% and
germ inat ion of seed is 20% or so . It w as obser ved ten biv alents chromosomes accor ding to a micr ospore
mother cell of F 1 at metaphase I during meiosis. T he chromosome comparison of F 1 is normal . It w ill be
increased the ef ficiency of breeding by using PAPD technique, which is applied to ident ified true or false of
F 1. Interspecies F1 plant is low-infected leaf spo t disease and r esistant plant presented in F 2 . It w as
supplied a pr obability for leaf-spot r esistant breeding.
Key words : Sudan g rass; Distant crossing; Leaf spot resistant breeding
苏丹草( S orghum sud anese L. )易于种植, 苗期
生长快,可青饲、青贮或调制干草, 为各类草食畜禽
及草食性鱼类所喜食, 是我国南方养殖业生产中重
要的夏季草种之一 [ 1]。叶斑病是国内外苏丹草种植
区普遍发生的病害 [ 2] , 我国江苏、浙江、安徽、江西等
南方省区, 由于高温高湿气候的影响, 特别是 7～9
月养殖业需草高峰期, 叶斑病发生严重,致使供青期
缩短,饲草品质下降和产草量减少, 家畜适口性下
降。叶斑病目前尚无特效药物防治, 即使施用农药,
也会因残留农药在食物链中的富集作用,对人、畜和
环境不利,因而筛选叶斑病抗原,选育高抗叶斑病的
种质具有十分重要的意义。
“八五”期间,江苏省农科院土肥所曾对收集的
高粱属草种资源作过评价, 结果表明高粱属牧草中
的拟高粱高具有抗叶斑病特性[ 3]。拟高粱染色体数
与苏丹草相同, 均为 2n= 20,理论上可以杂交[ 4]。本
研究通过苏丹草严格人工去雄,并与拟高粱杂交, 获
得了苏丹草与拟高梁的远缘杂交后代, F1 代大田表
现叶斑病发生比母本苏丹草轻,但仍感染叶斑病, F 2
代表明明显的抗/感分离。通过对杂种 F 1代细胞学
和 RAPD分子标记辅助育种研究,为苏丹草与拟高
粱远缘杂交的育种策略的制订提供依据。
收稿日期: 2001-09-06; 修回日期: 2001-11-15
基金项目:江苏省自然科学基金项目( BK2001176)
作者简介: 钟小仙( 1968-) ,女,浙江余姚人,在读博士,助理研究员,主要从事牧草种质资源收集及分子示记辅助育种研究
第 10卷 第 1期
Vo l. 10 No. 1
草 地 学 报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
2002 年 3月
March 2002
1 材料与方法
1. 1 试验区自然概况
试验于 1999、2000年在江苏省农业科学院试验
田进行。地处N32°32′、E118°48′。年均最高最低气温
分别为 39℃和-12℃,年均降水量 1000mm ,无霜期
220～240d。土壤为粘性马肝土, 有机质含量
1. 427%、全氮含量 0. 089%、有效磷含量 6. 618g/
kg、有效钾含量 79. 400g/ kg , pH 为 6. 7。
1. 2 试验材料
1. 2. 1 苏丹草自交系 2098,于 1996年引自日本,
1998- 1999年在田间扩繁, 经抗叶斑病筛选后, 作
母本(♀)用。
1. 2. 2 拟高粱( S orghum p rop inquum ) , 系野生种
质, 1998年从福建农学院引进。
1. 3 苏丹草与拟高梁远缘杂交试验
1. 3. 1 播种 将苏丹草自交系 2098 和拟高梁于
1994年 4月 20日同期播种于盆钵( 50cm×80cm) ,
每盆 2株,各 10盆。
1. 3. 2 暗处理 1996年 6月 22日对 10盆拟高粱
植株进行 15h 暗室处理(即从下午 17: 00至翌日上
午 8: 00) ,至小穗原基分化时,停止暗处理,促使迟
熟的拟高粱提早抽穗。
1. 3. 3 人工杂交 1999 年 8月上中旬至 9月初,
拟高粱与苏丹草花期相遇, 经人工去雄、套袋后进行
授粉杂交试验,观察授粉后小花的灌浆、结实情况。
1. 3. 4 种子收获 1999 年 11 月上旬收获人工杂
交的种子, 2000年 3月种子经组织培养( M S 培养
基)成苗后, 4 月下旬移栽至田间, 观察其生物学特
性。收获 F1 植株的 F2 代种子,对 F 1植株冬季进行
无性繁殖, 2001 年 4月移栽 F 1植株, 同期播种苏丹
草和F 2的种子,初步进行大田抗病性观察。
1. 4 杂种 F1的 RAPD鉴定
1. 4. 1 DNA 提取 取苏丹草、拟高梁和 3个 F 1植
株共 5份材料, 刈割其 3～5d 的叶片各 5g, 参照
Gustine[ 5]的方法粗提 DNA, 再参照 Gunter [ 6]再提
纯方法对 DNA 进行纯化,在提取过程中对有些处
理时间作了改进。
1. 4. 2 DNA 浓度定量 用 T ko fluokometer 仪,
以标准浓度 DNA( -DNA ) 500ng/ L 为对照, 进行
5价材料的 DNA 浓度测定,根据测定结果, 用 TE
把 5份材料的 DNA 分别稀释至 20ng / L。
1. 4. 3 PCR扩增 Gene Amp PCR System 扩增
仪(美国 PE 公司生产) ,随机引物和反应试剂(加拿
大 Sangon 公司产品) ,反应液总体积为 25L, 其中
ddH2O12. 9L、2. 5mol/ L 10 × buffer 2. 5L、
2. 0mo l/ L M gCl2 0. 5L、0. 2mo l/ L dNTP 1. 9L、
甘油 1. 0L、T MACL 1. 0L、T aq Enzyme 1U
0. 2L primer 3L、DNA template 2L。PCR反应
程序为: 94℃, 2′→37℃, 30″→72℃, 50″, 2次循环;
94℃变性 45′→37℃退火 30″→72℃延伸 50″, 共 25
个循环; →72℃, 5′, 反应完毕扩增产物在 1×T AE
缓冲系统中用“复日 FR-980电泳图像分析系统”成
像输出进行分析。
1. 5 杂交种细胞学观察
对经过 RAPD鉴定的杂交种, 冬季温室无性繁
殖的 F1 植株,在孕穗期, 挑取花粉母细胞减数分裂
中期 I 分裂相的花药,用卡诺氏固定液( 3份 95%酒
精: 1份冰醋酸)固定, 于冰箱中保存备用, 制片时,
取出花药, 置于 60℃1mo l/ L HCl 中解离心 15min,
席夫试剂染色至花药呈紫红色, 在 45%醋酸中压
片,醋酸地衣红复染,镜检,观察染色体配对构型。
2 结果与分析
2. 1 花期调节
苏丹草和拟高粱为同属不同种, 杂交结实率极
低。由于拟高粱在南京正常开花期在 10 月中下
旬[ 6] ,而苏丹草的开花期在 7月下旬至 9月中下旬,
因此促使拟高梁提早开花,并能与苏丹草花期相遇,
是远缘杂交成功必须解决的关键技术之一。通过
1999- 2000两年的试验,结果表明在 4月 22日至 5
月 10 日将苏丹草与拟高梁同期播种,在 6 月中下
旬,对拟高粱进行每天 15h 左右的暗处理 25～30d,
至拟高粱开始幼穗分化时停止暗处理, 可使苏丹草
与拟高粱花期成功相遇。
2. 2 1999年, 以苏丹草为母本, 对近 1500 朵小花
进行人工去雄、套袋、授粉杂交,最后收到 16粒杂交
25第 1期 钟小仙等:苏丹草与拟高粱远缘杂交初报
种,获得的杂交种籽粒明显小于母本苏丹草。2000
年 3月, 将 16粒种子经 MS 培养基培养, 其中有 3
粒种子成苗后于四月下旬, 移栽到田间并长成植株,
并观察其生物学性状。3株植株的许多性状表现倾
向母本,如叶宽、茎粗和分蘖性、穗型与母本苏丹草
接近, 并略优于母本,但叶脉颜色偏黄,种子成熟时
易于落粒等性状同父本拟高粱相似。
2. 3 抗叶斑病性状
2. 3. 1 杂交种对叶斑病的抗性接近于父本拟高粱。
在苏丹草 2000年 7～8月叶斑病大发生时, 3株杂
交后代植株叶片感染叶斑病较轻,与苏丹草相比,对
叶斑病的抗性明显增强,这可能由于 F 1杂种优势的
表现。
2. 3. 2 3株杂种后代的成熟期明显迟于同期播种
的苏丹草,于 9月中下旬抽穗, 10月下旬～11月初
成熟,比同期播种的拟高粱略早。种子千粒重约 7g,
接近中亲值。3株杂种后代生根能力极强, 同父本拟
高粱一样, 易于进行无性繁殖。2001年 8月叶斑病
发生期, F 1植株对叶斑病的抗性表现为中感, F 1植
株表现明显的抗/感分离,为苏丹草抗叶斑病育种提
供了可能。
2. 4 RAPD鉴定
随机选取 20个引物对母本苏丹草、父本拟高粱
和 3株杂种 F 1代进行 PCR反应,经电泳检测显示,
母本苏丹草、父本拟高粱和 3个杂种 F 1代表现出多
态 性 条 带, 其 中 以 引 物 S1425( GTTAGTGCGG) 和
S1428( TTTGGGTGCC) 扩增的结果尤为突出, 不仅条带清
晰,而且 3次重复均表现稳定(图 1)。引物S1425扩增
结果表明, 3 个杂种 F 1 不仅具有母本特有的条带
A,而且还有父本拟高粱特有的条带 B。引物 S1428扩
增结果也表明, 3个 F1 不仅具有母本苏丹草特异条
带 C, 而且具有父本拟高粱的特异条带 D(图 1)。
RAPD检测结果表明,该 F 1代为苏丹草与拟高粱的
杂交种。
2. 5 远缘杂种细胞学观察
对经 RAPD 鉴定为真杂交种的 F 1 植株, 观察
花粉母细胞减数分裂中期染色体配对情况(见图
2) ,结果为 10个环状二价体, 苏丹草与拟高粱的染
色体数均为 2n= 20,说明 F1染色体配对完全正常。
图 1 引物 S1425、S1428扩增的 RAPD 谱带
F ig . 1 Profile o f the amplified products
w ith primer S1425 and S1428
3 讨论
3. 1 提高苏丹草与拟高粱远缘杂交育种效率的方法
苏丹草与拟高粱远缘杂交的成功率很低。本试
验 1999 年的结果表明, 杂交成功率仅为 16/ 1500
(约 1% )。1999年人工去雄, 授粉后观察结果,约有
20%～30%的小花授粉后 7d左右, 外观上很饱满,
似乎正在灌浆, 但 10～15d后很多“饱满”的种子开
图 2 苏丹草×拟高粱 F1 花粉母细胞
减数分裂中期染色体
Fig. 2 ( S. s udang rass×S . p r op inguum)
F1 chr omosome o f micro spo re mo ther cell
a t metaphase I dur ing meiosis
始萎缩并最终自动脱落, 这种现象在其它作物的远
缘杂交时也经常出现,其原因可能是远缘杂交不亲
和引起的杂种夭亡。1999年收获的 16粒苏丹草与
拟高粱的杂交种子。明显小于苏丹草的种子, 接近拟
高粱的种子大小通过组织培养发芽率仍较低, 为
3/ 16( 18. 75%) ,说明杂种发育不良。杂种幼胚组织
26 草 地 学 报 第 10卷
培养是克服远缘杂种夭亡和发育不良的有效方
法[ 7, 8] ,该方法能否提高苏丹草与拟高粱远缘杂交的
效果,尚待进一步探讨。
3. 2 苏丹草抗叶斑病育种策略
由于远缘杂交能把不同种、属植物的特征特性
综合在一起, 创造出广泛的变异,出现一些新的对生
产有益的性状,从而可能培育出一些优良的植物新
品种。拟高粱高抗叶斑病, 并可与苏丹草进行杂交,
因此通过苏丹草恢复系与远缘种(如拟高粱)杂交,
选育新的高抗叶斑病的恢复系, 将大大提高苏丹草
抗叶斑病育种的效率, 并有望育成高抗叶斑病的苏
丹草杂交种。通过本研究获知,苏丹草与拟高粱不仅
染色体数目相等,而且染色体属于相同的染色体组
型, F1植株能正常发育、受精结实。因此在制定苏丹
草抗叶斑病育种策略时,要将重点放在如何获得大
量的 F1 ,克服苏丹草与拟高粱杂交不亲和性的难题
上,由于 F 2开始表现抗/感分离,并且发病情况与气
候有关, 因此后代选择应结合人工接种抗性鉴定
进行。
4 结语
4. 1 同期播种苏丹草与拟高粱, 对拟高粱进行
15h、25～30d 的暗室处理,可促使拟高粱提早开花
并与苏丹草花期相遇。
4. 2 苏丹草与拟高粱远缘杂交成功率较低(约
1%) , F 1花粉母细胞染色体配对正常, F 1种子发芽
率约为 20%。
4. 3 RAPD分子标记可快速有效地进行 F 1真假杂
交种鉴定,提高育种效率。
4. 4 苏丹草与拟高粱的杂种 F 1代对叶斑病表现轻
感, F 2抗/感分离, 为苏丹草抗叶斑病育种提供了
可能。
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