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Vol.24 No.1
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ACTA AGRESTIA SINICA
2016$ 1%
Jan. 2016
犱狅犻:10.11733/j.issn.10070435.2016.01.017
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LIZhenyi,LONGRuicai,ZHANGTiejun,YANGQingchuan,KANGJunmei
(InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:Heatshockprotein(HSP)isakindofubiquitousprotectiveproteinthatplaysanimportantrole
inplantdevelopmentandstressadaption.Inordertolearnmoreaboutexpressioncharacteristicsandfunc
tionofsmalHSPgene,犕狊犎犛犘17.7genewasclonedfromalfalfa(犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪L.)throughhomolo
gy-basedcloning.犕狊犎犛犘17.7containsanopenreadingframeof477-bpencodingaproteinof17.67-
kDa.Theaminoacidsequenceshares93.38%and83.13%identitywithsHSPsin犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪
andin犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿.QuantitativeRT-PCRresultsshowedthatthemaximum mRNAexpressionof
犕狊犎犛犘17.7wasinstems,folowedbyleavesandflowers,andtheleastwasinroot.犕狊犎犛犘17.7wasin
ducedbyhightemperatureandhighsalinitystress,buttheexpressiondidnotchangobviouslyunderper
oxidestress.ThenthequantitativeRT-PCRindicatedthat犕狊犎犛犘17.7wasabundantlyexpressedunder
highsalinitystressandperoxidestressinT3transgenic犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊.Insummary,resultsimpliedthat
犕狊犎犛犘17.7mightinvolveintheregulationofhighsalinitystressandperoxidestressresponse.
犓犲狔狑狅狉犱狊:犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪;Heatshockprotein;QuantitativeRTPCR;Abioticstress;Genetictransfor
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dence,Email:kangjmei@126.com
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Table1 Primerssequences
ÊKPrimername ljSequence(5'-------3') dï Usage
MsHSPF CCTCCCATAATCTTCCAACCAC 犕狊犎犛犘17.7®5d
MsHSPR CAAAAAACCATTGCCACACACG Geneamplificationof犕狊犎犛犘17.7
actinF CAAAAGATGGCAGATGCTGAGGAT _xìíβ犪犮狋犻狀2®5ií
actinR CATGACACCAGTATGACGAGGTCG β犪犮狋犻狀PCRamplificationinalfalfa
qHSPF CACCACATAATGGACCTCACAGAT ^2Z©`=
qHSPR TGATGTCACCTGATTTCAACCCTG RTqPCR
pBIF TGCTCTAGAATGGATTTCAGGCTAATGGGT 犕狊犎犛犘17.7QgW
pBIR CGGGATCCAGCAACCTTAACCTCAATAGTC Overexpressionof犕狊犎犛犘17.7
35SF GAGCACGACACACTTGTCTACTCCA ämð©
35SR CCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCA Identificationofrecombinantplasmid
AtactF GAAGTCTTGTTCCAGCCCTCGTTTG &ZA2®5ií
AtactR GAACCACCGATCCAGACACTGTACT PCRamplificationinArabidopsis
ü:³fú=og½
Note:Theunderlinesindicatedthesitesforrestriction
2 pq>r
2.1 0ðñò犕狊犎犛犘17.7Nø2ÌÍW>r
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(18.3%)6Ú6ep(10.6%);pepwindow
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1jSÃ MsHSP17.7Ú5SÃ
,MsHSP17.7ó¦ïÔ{5。
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=1 犕狊犎犛犘17.7犮犇犖犃Ð>ÑYfg¯NqÑY
Fig.1 FragmentofcDNAsequenceof犕狊犎犛犘17.7anditsdeducedaminoacidsequence
lj¸Def
,MsHSP17.7MYm
XJKpMó¦QAts
,
òf*JKQAs
éXKG
(
ë2),j7GJKTQA=¾n:
åñìí
(犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪)93.38%、f(犘犻狊狌犿
狊犪狋犻狏狌犿)83.13%、Yf(犌犪犾狔犮犻狀犲犿犪狓)74.10%、&Z
A56.63%、ÿ!(犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪)72.89%、»z(犣犲犪
犿犪狔狊)65.66%、-(犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿)74.70%。}
ÏJKH.FClassIIpMó¦ljLã,LN?»
JÐ=ljRDAKAMAATPADV(Ð=I),C?³
´90M
®W®TÐ=(alphacrystalindo
main,ACD),~ë1Ð=II、Ð=III,C?+
L`
WÐ=ljPPPEPKKP[1213]。
=2 犕狊犎犛犘17.7¯NqaÑY$>r
Fig.2 MultiplesequencealignmentofMsHSP17.7withotherplantsHSPs
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:
pg100%T
®W@;Ápg75%@;rpg50%@;³fú=gÐ=lj,Òù2g`
WÐ=lj
Note:Blackrepresentsalaminoacidsarethesame;pinkindicatesthat75%ofthesequencesareconserved;blueindicates
that50%ofthesequencesareconserved.Underlineindicatesconservativemotif,polyprolinemotifsareboxedatthecarboxylendofproteins
~ë31,MsSHP17.7åñìí、fT
sHSP@ts,YmXJKYf、-、ÿ!
sHSP@sé÷mXJK»z、u^、Q§
sHSP(ë3)。
421
!1# ¶\ø?:_xìí犕狊犎犛犘17.7®5Td|¦§=
=3 犕狊犎犛犘17.7)*ÒQÓ>r
Fig.3 Neighborjoiningphylogenetictreefor
犕狊犎犛犘17.7andsHSPsfromotherplantspecies
ü
(Note):MsHSP17.7(_xìí,犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪,A0A060CW40);
MtHSP(åñìí,犕犲犱犻犮犪犵狅狋狉狌狀犮犪狋狌犾犪,G7J8C7);
PsHSP17.1(f,犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿,P19242);
GmHSP17.9(Yf,犌犪犾狔犮犻狀犲犿犪狓,P05477);
Nthsp17.6(-,犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿,A0A077DBK4);
VvHSP(ÿ!,犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪,A5B8Y3);
ZmHSP17.8(»z,犣犲犪犿犪狔狊,P24632);
OsHSP18.0(Q§,犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪,Q5VRY12);
AtHAP17.7(&ZA,犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪,O81822);
TaHSP16.9(u^,犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿,Q41560)
2.2 犕狊犎犛犘17.7Nø`ÔhÏ>r
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Fig.4 Expressionanalysisof犕狊犎犛犘17.7indifferenttissues
ü
:og犕狊犎犛犘17.7®5gWQRX
ä¸Øºú
(犘<0.01)
Note:indicatessignificatediferenceatthe0.01levelcomparedwithothers
<=RTqPCR=¡犕狊犎犛犘17.7®5cs
Ûú5
、
)ú5=Áðú5TgW8
,
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(25℃),sÛ(37℃)ú5,犕狊犎犛犘17.7®5
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=5 犕狊犎犛犘17.7{·z{、z{、¥¦Qz{P2`ÔÖ_
Fig.5 QuantitativeRTPCRanalysisof犕狊犎犛犘17.7inalfalfaunderhightemperature,saltandperoxidestress
ü
:A37℃sÛú5;B200mMNaClú5;C15mM H2O2ú5,6@uU;Çgغ
(犘<0.05)
Note:Aunderhightemperaturestress;Bunder200mMNaClstress;Cunder15mM H2O2stress.
Differentlowercaselettersindicatesignificantdifferenceatthe0.05level
521
! " # $ !24"
2.3 ×NøØÙ2Ú³
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=6 狆犅犐121犕狊犎犛犘17.7ÌÛ2HÜÚ³
Fig.6 EnzymeanalysisofpBI121犕狊犎犛犘17.7
ü
:M:DNAmarkertrans2000plusII;
1:plasmidofpBI121犕狊犎犛犘17.7;
2:Y½pBI121犕狊犎犛犘17.7F]
Note:M:DNAmarkertrans2000plusII;
1:plasmidofpBI121犕狊犎犛犘17.7;
2:DoubledigestionofpBI121犕狊犎犛犘17.7
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。
2.4 犕狊犎犛犘17.7×NøØÙ<2`Ô>r
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犛犘17.7Ls)ú5<ðh
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。
=7 ×NøØÙ2Ú³
Fig.7 Identificationoftransgenic犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪
ü
:AnPCR×Ã;BnTRPCR×Ã,
M:DNAmarkertrans2000plusII;
WT:¾9F&ZA;CK+:pBI121犕狊犎犛犘17.7F];
1~4:Ú®5&ZA
Note:A:PCRanalysis;B:RTPCRanalysis;
M:DNAmarkertrans2000plusII;
WT:Wildtype犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪;
CK+:PlasmidofpBI121犕狊犎犛犘17.7;
1~4:Transgenic犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊
3 Wp
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[16],
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II、Ð=III6
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[13]。
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=8 {W¥¦Qz{P犕狊犎犛犘17.7×NøØÙ<2`Ô>r
Fig.8 QuantitativeRTPCRanalysisoftransgenic犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊with犕狊犎犛犘17.7underhighsalinityandperoxidestress
ü
:ALs)ú5;BL=Áðú5,6@uU;Çgغ
(犘<0.05)
Note:Ahighsalinitystress;Bperoxidestress.Differentlowercaselettersindicatesignificantdifferenceatthe0.05level
LsÛú5,>x 犖狀犎犛犘17.5[12],u^
狊犎犛犘26[18],u?@犘狆犎狊狆16.4[20]?®5gW
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、
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whichconfersheat,saltanddroughttoleranceintransgenic
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