全 文 ：第 18 卷
第 5 期

Vol. 18
No. 5
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2010 年
9 月

Sep.

2010
盐生植物小花碱茅 K+ 通道 PtAKT1
基因片段的克隆及序列分析
郭
强, 周向睿, 王
沛 , 张金林, 包爱科, 伍国强, 王锁民*
(兰州大学草地农业科技学院, 甘肃 兰州 730020)
摘要 : 为研究小花碱茅( Puainell ia tenuif lo ra ) K + / Na+ 选择吸收分子机制, 根据已报道的其他植物 A K T1 基因的
保守序列设计一对简并性引物,以小花碱茅根部总 RNA 为模板,采用 RT-PCR 方法克隆出 A K T1 基因, 以期为小
花碱茅 AK T1 全长基因的克隆、表达调控及其作物改良的研究奠定基础。序列分析结果表明:该基因长度大约为
1019 bp,编码 339 个氨基酸; 所得序列与 GenBank 中注册的高等植物 A K T1 基因序列的同源性均在 85%以上, 与
其他 AKT 1的氨基酸序列同源性达 73%以上。
关键词:小花碱茅; AK T1 基因;克隆; 序列分析
中图分类号: Q785; Q945. 12



文献标识码: A




文章编号: 1007-0435( 2010) 05-0683-06
Cloning and sequence analysis of K
+
channel PtAKT1
gene fragment from halophyte (Puccinellia tenuif lora)
GUO Qiang, ZHOU Xiang-rui, WANG Pei, ZHANG Jin- lin, BAO A-i ke, WU Guo-qiang, WANG Suo-min*
( School of Pastoral Ag riculture S cience and Techn ology, Lanzhou University, Lanzhou, Gansu Province 730000, China)
Abstract: Degenerate primers w ere designed based on the conser ved sequences of the A K T1 genes f rom
other plants for invest igat ing molecular mechanisms of K
+
/ Na
+
select ive absorpt ion in P. tenui f lora. To-
tal RNA was ext racted f rom the roots of Puccinel l ia tenui f lor a to obtain an AK T1 gene fr agment by re-
verse t ranscr ipt ion polymerase chain reaction ( RT-PCR) . The sequencing result show s that the A K T1
gene fragment ( about 1019 bp) fr om Puccinel l ia tenui f lor a encodes 339 am ino acids. Homology compar-i
son show that the A K T1 gene f ragment contains over 85% nucleot ide and 73% am ino acid homo logy w hen
compared w ith other plants in the GenBank having an AKT1 gene. T hese results of fer fur ther under stand-
ing fo r ful-l length A KT1 gene cloning, gene expression r egulat ion and crop improvement .
Key words: Puccinel l ia tenuif lor a; A KT1 gene; Cloning; Sequence analysis


钾是植物生长和发育所需的大量元素之一, 在
细胞的生命活动中, K + 在渗透调节、中和阴离子的
负电荷、调节膜压以及糖的共转运等过程中起着重
要作用[ 1]。然而, 在盐胁迫下, 由于 Na+ , K + 的离
子半径和水合能( Ion hydration energ ies)相似, Na+
对于细胞 K+ 的吸收呈现出明显的竞争抑制作
用[ 2] , 胞外过多的 Na+ 不仅限制 K+ 的吸收,而且还
会引起 Na+ 在细胞质中积累, 引起盐害, 从而对农
业生产构成威胁 [ 3, 4]。植物要在盐渍环境中存活,
胞质中必须保持一个高的 K+ / Na+ 比 [ 5]。因此, 理
解 K + 吸收和转运机制, 对优良牧草抗盐性的遗传
改良具有重要的指导意义。
钾离子通道是植物吸收 K + 的重要途径之一。
Schro eder 等[ 6] 利用膜片钳技术, 首先在蚕豆( Vicia
f aba)的保卫细胞中证实了钾离子通道的存在。与
其他阳离子相比, 植物内整流 K + 通道对 K+ 有较高
的选择性,其选择性大小依次是 K + > Rb+ > N a+ >
Li+ [ 7]。Gierth和 M
ser [ 8]通过测定拟南芥( Ar abi-
dop si s thaliana)突变体 akt1 86Rb+ 吸收动力学参数
发现,当 Rb+ 浓度为 0. 2~ 40 mmol
L - 1时, AKT 1
通道主要介导低亲和 K + 吸收。进一步研究发现,
AKT 1通道不仅能促进植物根系对土壤中
收稿日期: 2010-05-20;修回日期: 2010- 09-17
基金项目:国家 973项目( 2007CB108901) ; 863计划项目( 2006AA10Z126) ;国家自然科学基金( 30770347) ( 30700562)资助
作者简介:郭强( 1981- ) ,男, 甘肃天水人,博士研究生,研究方向为植物逆境生理与分子生物学, E-m ail : guoyanbai@ 163. com; * 通讯作者
Auth or for correspon dence, E-mail: smw an g@ lzu. edu. cn
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K+ 的吸收,而且还能影响根细胞的生长发育 [ 9]。当
外界 K + 浓度为 10
mol
L- 1时, 缺乏 AKT 1活性
的拟南芥突变体 akt1 , K + 通透性和植株生长速率均
受 NH +4 的抑制, 而野生型则对 NH +4 的存在不敏
感[ 10, 11]。因此, 在拟南芥根中, AKT1 介导了一个
对 NH +4 不敏感的 K + 吸收系统的组分,并且在外界
K+ 浓度为微摩尔级时, AKT 1通道也介导高亲和
K
+ 吸收。
Ander son和 Sentenac等[ 12, 13]通过酵母钾亏缺
突变体功能互补法, 首次从拟南芥中克隆出 2 个编
码 K + 通道的基因 ( A K T1 和 KA T1 )。随后, 相继
从其他高等植物中也克隆到了 A KT1 类基因 [ 14, 15]。
然而,这些基因大部分来自模式植物或者作物,此类
基因在双子叶盐生植物的报道仅见于冰叶日中花
(M esembryanthemum cry stal linum )
[ 16]
, 而在单子
叶盐生植物中尚未报道。小花碱茅 ( Puccinel lia
tenuif lor a)是禾本科碱茅属多年生优良牧草, 耐盐
碱、抗寒、耐旱性极强, 广泛分布于我国东北和西北
地区的盐碱地。本研究已用 RT-PCR 方法克隆得
到小花碱茅 A ct in 基因片段, 以此基因为内标参
照[ 17] , 为小花碱茅 A KT1 基因表达调控奠定了基
础。前期研究表明,在 N aCl处理下, 盐生植物小花
碱茅根部具有较强的 K + , Na+ 选择吸收能力约是
高等植物小麦的 2倍, 并且通过限制其根部 Na+ 单
向内流速率来减少 Na+ 的净积累, 以维持胞质中正
常的 K + / N a+ 比值[ 18, 19] ,推测 AKT1类通道在小花
碱茅的耐盐性中可能起着重要作用。本试验利用
RT-PCR方法克隆小花碱茅 A KT1 基因并分析其
序列特征,以期为小花碱茅 A K T1 全长基因的克隆
及其作物遗传改良的研究奠定基础。
1
材料和方法
1. 1
材料
供试材料为小花碱茅, 种子采自甘肃省张掖市
临泽县。
1. 2
研究方法
1. 2. 1
材料培养
将籽粒饱满的小花碱茅种子播
种在铺有吸水纸的筛网架上, 放置在瓷盘中暗培养
7 d,温度为 25
,约 7 d后浇灌 Hoag land营养液并
给予光照营养液 5 d更换 1次。培养室昼夜温度为
( 28
2)
/ ( 23
2)
,光照周期 16 h
d- 1 , 光强
约为 600
moL
m - 2
s- 1 , 空气相对湿度为 60%
~ 80%。将培养至4周龄的小花碱茅在 150 mM 的
NaCl中处理 48 h,以诱导小花碱茅 AK T1 基因的
表达。
1. 2. 2
总 RNA 的提取
将采集的鲜根经无菌水
冲洗后,置于消毒滤纸上吸干水分,于液氮中快速冷
冻并保存于- 70
低温冰箱或直接用于 RNA 的提
取,提取方法参考伍国强等 [ 20]的方法。
1. 2. 3
引物的设计与合成
通过对已经克隆出的
植物 AK T1 基因核苷酸序列进行同源性比较,找出
高度保守的区段; 根据同源性高和简并性低的原则,
利用 DNAMAN 和 Primer 5. 0引物设计 1对简并
性引物 P1和 P2。引物由上海生工生物工程有限公
司合成。
P1: 5
-T GGG ( C/ T ) ( T / C/ G) TC ( T / C/ G) CC
( A/ T / G) T T( C/ T ) GA( A/ G) TT T GG-3
;
P2: 5
-AAGT C( A/ T ) GT ( T / C/ G) GGT GCT-
TC( A/ G) TT ( C/ T ) T GC-3
;
1. 2. 4
RT-PCR扩增
PCR扩增反应体系: 在 200

L PCR管中依次加入 10
PCR Buffer 5
L, 25
mmol
L - 1 MgCl2 3
L, 2 mmol
L - 1 dNTP
5
L, 10
mol
L- 1 P1 1
L, 10
mol
L - 1 P2
1
L, Taq DNA polymer ase( 5 U

L - 1 ) 0. 5
L,
cDNA 4
L,加纯水至 50
L。反应条件: 94
预变
性 2 min; 94
变性 30 s, 56
退火 50 s, 72
延伸
70 s, 30个循环; 最后 72
延伸 10 m in。PCR扩增
产物用 1. 2%琼脂糖凝胶检测, 目的片段回收和纯
化按照 UNIQ-10柱式 DNA 胶回收试剂盒操作说
明进行。
1. 2. 5
阳性克隆的筛选与鉴定
回收的 PCR 产物
连接到 PUCm-T 载体, 转化感受态大肠杆菌, 用含
有 50
g
mL - 1氨苄青霉素的 LB固体培养基进行
蓝白斑筛选,转化白斑菌株经质粒 PCR鉴定确认阳
性克隆后, 送至北京华大基因科技股份有限公司
测序。
1. 2. 6
序列分析
序列的比较、翻译等在 DNA-
MAN生物软件上进行, Blast 搜索在 NCBI( www.
ncbi. nlm. nih. gov / BLAST)网站上进行。
2
结果与分析
2. 1
总 RNA的纯度检测
以小花碱茅根系为材料提取的总 RNA 经过甲
醛变性凝胶电泳检 测结果显示, 28sRNA 和
18sRNA 条带清晰 (图 1) , 前者亮度约是后者的
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第 5期 郭强等:盐生植物小花碱茅 K+ 通道 P tAK T1 基因片段的克隆及序列分析
2倍,说明所提取的 RNA 完整性较好; 经 N ano-
Drop 1000核酸蛋白检测仪测得 OD280/ OD260 平
均值为 2. 02,表明 RNA 纯度较高, 可用于 RT-PCR
扩增。
图 1
小花碱茅总 RNA的甲醛变性凝胶电泳
F ig . 1
Formaldehyde-agaro se gel elect rophor esis
of to tal RNA fr om Puccinel lia tenuif lora
2. 2
RT-PCR扩增
以总 RNA 反转录所得到的第 1链 cDNA 为模
板, 用 AK T1 基因的简并性引物 P1 和 P2 进行
PCR扩增。扩增产物经凝胶电泳检测发现约在
1000 bp处有一条亮带,且上下无杂带, 与目的片段
的大小一致(图 2) ,推测可能是 A KT1 基因片段。
图 2
RT-PCR产物凝胶电泳图
Fig. 2
Aga rose gel electr opho resis of RT-PCR products
注: M : DNA mark er; 1: A KT1 基因片段 RT-PCR 产物
Note: M : DNA mar ker; 1: RT-PCR products of A KT1 gen e fragment
2. 3
阳性克隆的鉴定
将回收纯化的目的片段连接到 PUCm-T 克隆
载体上, 转化 E. col i. DH5
。从转化的平板上随机
挑取 8个阳性克隆。随后从这些克隆中任选 4个提
取质粒,进行 PCR扩增, 得到的扩增片段大小约为
1000 bp(图 3) , 与 RT-PCR结果一致,表明这些克
隆为阳性克隆。
图 3
阳性克隆的 PCR鉴定
Fig. 3
PCR Identificat ion of Positive clones
注: M : DNA marker; 1: 阳性克隆
Note: M : DNA mar ker; 1: Posit ive clones
2. 4
AKT1基因片段序列分析
测序分析发现, 该阳性克隆序列长度为 1019
bp, 编码 339 个氨基酸 (图 4)。Blast 比较结果显
示: 该片段与其他植物, 如大麦 ( H or deum vul-
gar e )、小麦( Tr it i cum aesti vum )、水稻( Or y z a sati-
va)以及高粱( Sor ghum bicolor )的 A K T1 基因核苷
酸序列的同源性均在 85%以上; 其中与大麦 A K T1
基因( DQ465992)核苷酸序列的同源性高达 91%。
此外,该片段含有 K + 通道所特有的 K + 选择区域,
表明所克隆到的片段为 A KT1 基因片段。将该基
因命名为 PtAKT 1, 并在 GenBank 注册, 登录号为
GU296229。将推测的小花碱茅 PtA KT1的氨基酸
序列和其它植物 AKT1 的氨基酸序列进行多重比
较(图 5) , 发现保守氨基酸多达 308个,而非保守氨
基酸仅有 31个, 这表明我们克隆的片段为 A K T1
基因的高度保守区域。
3
讨论与结论
众所周知,植物在盐胁迫下,为了阻止细胞中的
K + 的损失, 关键是要维持一个高的 K + / Na+
比[ 2 1, 22]。高等植物的 AKT 1类 K+ 通道具有 6个跨
膜结构域( S1~ S6)和 1个位于 S5和 S6之间高度保
守的呈
发夹状的 P 环结构, 该 P 环结构为离子介
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图 4
小花碱茅 PtAKT1 核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Fig. 4
Nucleotide and deduced amino acid sequence of P tA K T1 fr agment f r om Puccinel lia tenuif lora
注:加框表示引物 P1, P2序列。黄色阴影为 K+ 通道高度保守的 K+ 选择区域
Note: Nucleot ides in f rame in dicate primer s P1 and P2, resp ect ively. Amino acids in
yellow shade show a h ighly conserved K+ selective dom ain of K+ ch ann el
导中心的部分选择性过滤区域,其 T xxT xGYGD的
保守序列正是 K + 通道的标志性序列[ 23] , 而这一 P
环结构是 AKT 1通道负责吸收 K + 主要结构域, 尤
其在 K + , Na+ 选择性方面扮演着重要的角色, 从而
使其在维持 K+ / Na+ 比方面发挥着重要作用。例
如,在水稻中超表达拟南芥 K+ 通道基因( AK T1 和
KA T1 ) ,发现转基因植株在低钾和高钾水平下其钾
的累积能力都有明显提高[ 24]。另外, Xu等 [ 25] 研究
发现,促进植物 K + 吸收的主要过程,是由 LK S1 基
因编码的蛋白激酶 CIPK23对细胞 K+ 通道 AKT 1
的磷酸化来实现的,而 CIPK23 的上游受 2 种钙信
号感受器 CBL1 和 CBL9 的正向调控,在拟南芥中
超表达 LK S1、CBL1 和 CBL9 基因能显著增强
AKT1的活性, 进而提高植株对低钾胁迫的耐受性。
本研究得到的小花碱茅 A KT1 基因片段与其
他植物AK T1 基因同源性均在 85%以上,而与氨基
酸序列的同源性则在 73% 以上, 特别是和小麦
AKT 1氨基酸的同源性最高(图 6)。研究表明, 小
麦 AKT 1通道的 P 环结构在其 K + , Na+ 选择性方
面也起到重要作用[ 14]。而图 4 所示小花碱茅
AKT 1的 P 环结构中也存在 T TLT TVGYGD的片
段, 这可能暗示着该结构在小花碱茅 K + , Na+ 选择
性方面起到重要的作用。试验前期的研究表明: 与
小麦相比,小花碱茅具有较强的 K+ , Na+ 选择性能
力[ 1 8, 19] ,但在分子机制上, 小花碱茅 AKT 1通道是
否在 K + / Na+ 选择性方面起到至关重要的作用依
然不清楚。为此, 将来的研究主要从以下几点开展:
首先,通过 RA CE 手段, 获得小花碱茅 AKT 1的全
长 cDNA,分析该基因在不同 K + / Na+ 比下的基因
表达模式变化。再者, 通过亚细胞定位、异源表达、
电生理以及 RNA i手段,以明确小花碱茅 AKT1在
K + , Na+ 选择性中的作用。最后, 通过分子聚合手
段,将该基因导入农作物中,以期培育出优良的抗逆
品系。
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第 5期 郭强等:盐生植物小花碱茅 K+ 通道 P tAK T1 基因片段的克隆及序列分析
图 5
PtAKT1 氨基酸序列与其他植物 AKT1 氨基酸序列的多重比较
F ig . 5
Amino acid sequence alignment of P tAKT 1 w ith those from other plants
注:多重比较采用DNAMAN 程序进行。K+ 通道( AKT1)氨基酸序列的来源和基因库登录号分别为:小花碱茅 PtAKT1( GU296229) ,
大麦 H vAKT1( DQ465992) ,小麦 T aAKT 1( AF207745) ,高粱 SbAKT1( XM002458189) ,水稻 OsAKT1( AY065970) ,
拟南芥 AtAKT1( AK317729)。灰色方框表示高度保守的 K+ 选择区域
Note: T he mul t iple alignments w ere generated usin g DNAMAN program. T he sour ces and GenBank acces sion n umbers of AKT1 are as
follow s: PtAK T1 ( GU 296229) , H vAKT1 ( DQ465992) , TaAKT1 ( AF207745) , S bAKT1 ( XM 002458189) , OsAKT 1
( AY065970) , and AtAKT1 ( AK317729) . Th e conservat ive K+ selective d omain w as f ramed w ith g ray line
图 6
PtAKT1 与其他植物 AKT1 的系统进化树
Fig. 6
Phylogenetic tree of PtAKT1and AKT1 from other plants
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