全 文 ：第20卷 第5期
Vol.20 No.5
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 9月
Sep. 2012
产萱草根素内生真菌的分离与鉴定
梁 洁1,杨 凯1,李勤凡1*,姜振国1,2,孔祥雅1,杨国栋1,金意敏1
(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西 杨凌712100;2.西安市长安区动物疾病预防控制中心,陕西 长安710100)
摘要:为探讨萱草(Hemerocallis)根中是否存在产生萱草根素的内生真菌,从北萱草(H.esculenta)根中分离得到4
株内生真菌,在马铃薯(Solanumtuberosum)葡萄糖琼脂培养基(PDA)上培养20d后收集菌丝,应用薄层色谱法和
紫外分光光度法分别检测菌丝提取液中的萱草根素,筛选可产生萱草根素的内生真菌。结果表明:菌株XC-1A为
产萱草根素内生真菌,含量达359.88μg·g-1,根据形态学观察和5.8SrDNA-ITS序列分析结果,确定XC-1A为
Zalerionvarium。北萱草中存在可产生萱草根素的内生真菌。
关键词:北萱草;萱草根素;内生真菌
中图分类号:Q948.122.3;Q93-331 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)05-0935-05
IsolationandIdentificationofHemerocalin-ProducingFungalEndophyte
LIANGJie1,YANGKai1,LIQin-fan1*,JIANGZhen-guo1,2,
KONGXiang-ya1,YANGGuo-dong1,JINYi-min1
(1.ColageofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,ShaanxiProvince712100,China;
2.Chang′anCentreforAnimalDiseaseControl&Prevention,Chang′an,ShaanxiProvince710100)
Abstract:Thestudywastoexplorewhetherthehemerocalin-secretfungalendophyteexistinrootsof
Hemerocallis.FourstrainsofendophyticfungiwereisolatedandobtainedfromtheH.esculenta.Fouri-
solatesweredetectedbythin-layerchromatographyandUVspectrophotometryaftercultureinpotatodex-
troseagar(PDA)for20days.ResultsshowedthatXC-1A,astrainofendophyticfungusproducing
hemerocalinwasisolatedandobtainedfrom H.esculenta,andhemerocalinyieldis359.88μg·g-1.
MorphologicalevidenceandrDNA-ITSsequenceanalsisindicatedthattheendophytewascloselyrelatedto
Zalerionvarium.Thehemerocalin-producingfungalendophytesexistintherootofH.esculenta.
Keywords:H.esculenta;Hemerocalin;Fungalendophyte
萱草属(Hemerocallis)植物系百合科(Liliace-
ae)多年生草本,又称黄花菜、金针菜[1]。萱草属中
某些品种的根具有毒性,动物采食后会中毒,出现精
神沉郁、食欲下降、行动迟缓、双目失明等症状,甚至
死亡。羊萱草根中毒在我国已有100多年的历史,
在陕西、甘肃等地区常年流行,危害当地畜牧业,造
成巨大的经济损失[2]。目前,在流行病学、毒理学等
方面的研究已经取得了重要进展,并确定其主要毒
性成分是蒽醌类化合物-萱草根素(Hemerocal-
in),结构鉴定为2,2,-双-[1,5-二羟基-7-甲基-萘甲
酮-8][3],但对动物萱草根素中毒机理还不清楚,动
物中毒后无法采取有效的治疗措施[4]。
植物内生真菌(endophyticfungi)一般是指在
某一时期生活在植物体内,但对宿主植物组织不引
起明显病害症状的、并与宿主植物建立和谐关系的
一类真菌。研究发现,有的内生真菌具有合成和宿
主植物相同或相似活性成分的能力。如2003年
Braun等[5]从美国疯草中分离到能产生苦马豆素的
内生真菌埃里格孢属(Embellisia),通过控制植物
中的这些微生物可以防止动物中毒[6]。这一发现为
解决动物有毒牧草中毒问题提供了新思路。
目前,缺乏萱草根中分离内生真菌的报道。本
试验旨在寻找能产生萱草根素的内生真菌,为动物
萱草根中毒的研究提供资料和依据。
收稿日期:2012-03-20;修回日期:2012-05-18
基金项目:国家自然科学基金项目(30871901);陕西省科技攻关项目(2008k02-06-2)资助
作者简介:梁洁(1987-),女,陕西西安人,硕士,主要从事动物中毒性疾病的研究,E-mail:liangjie1963@163.com;*通信作者 Authorfor
correspondence,E-mail:liqinfan@yahoo.com.cn
草 地 学 报 第20卷
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 北萱草根(Hemerocallisescu-
lenta)于2011年8月采于陕西长安县五台新农村。
采集的样品密封包装,运回实验室,经西北农林科技
大学动医学院王建华教授鉴定后,洗去泥土,60℃烘
干至恒重,粉碎后置阴凉干燥处备用[7]。
1.1.2 主要仪器与试剂 紫外分光光度计Analy-
tikjenaSPECORD50(德国产品);高速冷冻离心机
Labofuge400R(德国 Heraeus公司产品);PTC-
150PCR扩增仪;FR-200紫外可见成像分析系统
(上海复日科技公司);EPS604稳压稳流电泳仪(南
京科宝仪器研究所);DYY-Ⅲ型电泳槽(北京六一仪
器厂)。萱草根素标准品(由西北农林科技大学动物
医学院营养代谢病与中毒病学实验室提供);DNA
聚合酶等分子生物学试剂(TaKaRa公司产品);通
用引物ITS1和ITS4(南京金斯瑞生物科技有限公
司);有机试剂均为分析纯。
1.2 产萱草根素内生真菌的分离
1.2.1 植物材料表面的消毒 将采集的萱草根材
料表面洗净,晾干水分后进行如下消毒:在无菌操作
台中用75%乙醇漂洗20~30s,无菌水冲洗4次,
5%次氯酸钠溶液漂洗5min,无菌水冲洗4次,
75%乙醇漂洗20~30s,无菌水冲洗4次。
1.2.2 内生真菌的分离、纯化与保存 用无菌滤纸
片吸干经表面消毒植物组织上的水分,再将其切成
5mm×5mm×1mm大小的组织块,接种于培养基
上,切口与培养基接触,将平板置于20℃恒温培养
箱连续培养10~15d。将上述经表面灭菌处理的材
料不作切割置于同样条件下培养,检查表面消毒是
否彻底,辨别该真菌是否为萱草根素内生真菌[8-9]。
待组织块的边缘有菌丝长出,挑取菌丝前端接于新
的PDA培养基上继续培养。经过2~3次纯化后,
得到纯化菌株,纯化后的菌株转接到PDA斜面上
4℃保存。
1.3 产萱草根素内生真菌的筛选
1.3.1 菌丝的收集 将分离纯化的菌株接种于
PDA培养基上,置20℃下培养20d,然后将菌丝刮
下,50℃烘干,称量菌丝1g。
1.3.2 植物材料及内生真菌中萱草根素的薄层色
谱法检测 参照文献报道的方法[7],将北萱草样品
和从萱草样品中收集的真菌菌丝分别放入索氏提取
器中,用氯仿(分析纯)50~60℃热回流提取3次,每
次2h。将提取液于60℃以下水浴浓缩挥干[7],然
后用甲醇溶解,制成待检液。将萱草根素标准品、萱
草根待检液、内生真菌菌丝待检液分别点样于硅胶
薄层板上,采用薄层层析法初步筛选产生萱草根素
的内生真菌。
1.3.3 植物材料及内生真菌中萱草根素的紫外分
光光度法检测 将萱草根素标准样品溶于甲醇中,
进行紫外全波段扫描,找出最大吸收波长。准确称
取一定量的萱草根素标准品,用甲醇配制成0,
0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12,0.14mg·L-1
浓度梯度的标准品溶液(重复3次),在最大吸收波
长处测定各标准溶液的吸光度,建立吸光度(y)和
萱草根素质量浓度(x)之间的标准曲线方程。
将1.3.2中制备的植物样品待检液和内生真菌
待检液,进行紫外光谱扫描,与萱草根素标准品在相
同的波长处出现吸收峰,即可确定样品溶液中含有
萱草根素,然后根据标准曲线方程,计算样品溶液中
萱草根素的含量。
1.4 产萱草根素内生真菌的鉴定
1.4.1 形态学鉴定 采用点植培养法[10],用接种
针挑取少量菌丝点植在PDA平板上,然后于20℃
下培养10~15d后,观察菌落大小、颜色、表面纹
饰、质地、高度、菌落边缘形状等[8];采用插片法,将
菌种在20℃培养皿上进行插片培养,在光学显微镜
下观察并记录菌株形态特征[10-11]。
1.4.2 分子生物学鉴定 ①真菌基因组DNA的提
取:采用改良CTAB法提取真菌基因组DNA[12]。取
DNA样品稀释50倍后,测定DNA的OD值及浓度。
取6μLDNA点样于1%的琼脂糖凝胶,电泳检测,分
别判别DNA分子的纯度。②5.8SrDNA-ITS片段
的PCR扩增[13]:采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCG-
TAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCT-
TATTGATATGC-3′)。PCR采用50μL反应体系:引
物各2μL,模板2μL,ExTaq25μL,加双蒸水至50
μL。反应条件为:94℃预热5min;98℃变性15s;
55℃退火30s;72.0℃延伸1min;反应30循环,
72℃再延伸5min。③PCR 产物的检测及测序:
PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,再进行双向
测序,测序委托测序公司进行。④系统发育树的构
建:将测得ITS-5.8SrRNAFASTA格式的序列用
NCBI网站提供的BLAST服务,在数据库中搜索高
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第5期 梁洁等:产萱草根素内生真菌的分离与鉴定
度相似序列,调取同源性高的相关序列组成序列集;
然后用CLUSTALX软件包中的 Alignment程序
进行多重序列比对,用Tree程序计算序列间的相似
性;用BioEdit软件进行序列剪辑;系统进化矩阵根
据Kimura模型估算;用 MEGA5.1软件包中相关
程序采用邻接法进行聚类分析并构建系统进化
树[14]。⑤产萱草根素内生真菌的分类:根据内生真
菌的形态学观察结果和ITS序列构建的系统发育
树,并结合文献报道,对该内生真菌进行种属分类。
2 结果与分析
2.1 产萱草根素内生真菌的分离
萱草根样品通过真菌分离培养,共得到4株真
菌,分别命名为XC-1A,XC-1B,XC-3A和XC-3B。
2.2 产萱草根素内生真菌的筛选
2.2.1 薄层色谱检测 应用薄层色谱法对菌丝中
萱草根素进行定性检测,结果XC-1A的菌丝提取物
出现与萱草根素标准品颜色和Rf值相同的斑点,初
步确定该株真菌可产生萱草根素。
2.2.2 紫外分光光度法检测 经紫外扫描检测后,
萱草根素标准品的最大吸收波长为280nm。测定
梯度浓度萱草根素标准品在280nm处的吸光度,
直线回归,得到吸光度(y)和萱草根素质量浓度(x)
之间的标准曲线方程:y=0.154x+0.1053(R2=
0.9836),当萱草根素浓度在0.02~0.12mg·L-1
时,萱草根素的质量浓度与萱草根素吸光度的比值
呈良好的线性关系。
内生真菌菌丝待检液经紫外扫描后,XC-1A菌
丝提取物与标准品在相同的波长处出现最大吸收峰
(图1,2),结合薄层色谱检测结果,说明XC-1A的
菌丝中含有萱草根素。测定菌丝提取物在280nm
处的吸光度,根据标准曲线方程计算出XC-1A菌丝
中萱草根素的含量为359.88μg·g-1。
2.3 产萱草根素内生真菌的鉴定
2.3.1 形态学鉴定 XC-1A在PDA 培养基上平
均生长速度为1.3mm·d-1,20d以后停止生长,
随着培养时间的延长,菌落逐渐由白色变为黑色、黑
褐色,菌落圆形、扁平、呈毡状,中央凸起,气生菌丝
较密集。菌丝呈树枝状,边缘光滑,有横膈膜,横膈
膜数较少,未发现有性或无性孢子(图3)。
图1 萱草根素标准品紫外扫描图
Fig.1 UVscanningofhemerocalinstandard
图2 萱草根素内生真菌XC-1A提取物的紫外扫描图
Fig.2 UVscanningofextractionfromendophyteXC-1A
2.3.2 分子生物学鉴定 核苷酸序列测定结果显
示,XC-1A菌株的ITS片段长度为558bp(图4),该
片段包括ITS1,5.8SrDNA和ITS2的全部序列,以
及18SrDNA和28SrDNA的部分序列。BLAST比
对的结果显示,与 GenBank编号 AJ608987.1的
Zalerionvarium 相似度达到97%。对 XC-1A 与
Tricladium,Cudoniella和Lambertella等属14个
序列制作系统发育树(图5)。系统发育分析表明,
菌株XC-1A与Zalerionvarium 同源性达100%,
因此鉴定该菌为Zalerionvarium。
3 讨论
萱草是一种很有价值的经济作物,全球约15
种,其中原产于我国的约有11种,在我国分布极广,
南至福建、湖南,北至内蒙古,西至甘肃均有栽培,其
某些品种的根具有毒性,可引起放牧牲畜中毒,严重
危害畜牧业的发展。陈昌等[15]首次从江苏镇江高
丽山产的童氏萱草(H.thunbergh)根中提取并分
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草 地 学 报 第20卷
图3 产萱草根素内生真菌XC-1A的形态特征(标尺长度为20μm)
Fig.3 Morphologicalcharacteristicsofhemerocalin-producingfungalendophyeXZ-1A(Bar=20μm)
注:A.XC-1A的菌落;B.XC-1A的菌丝
Note:A.ThecolonyofXC-1A;B.TheconidiophoresofXC-1A
图4 萱草根素内生真菌XC-1A5.8SrDNA-ITS序列扩增片段的凝胶电泳分析
Fig.4 Agaroseelectrophoresisofamplified5.8SrDNA-ITSregionfromfungalendophyteXC-1A
图5 由NJ方法构建的5.8SrDNA-ITS序列系统发育树
Fig.5 PhylogenetictreeobtainedfromtheprogramNJbasedon5.8SrDNA-ITS
离了萱草根致使实验动物中毒的有毒成分,并定名
为萱草根素;王建华等[16]从陕西吴旗县刘渠子野黄
花菜(H.citrina)根和长安县南五台北黄花菜根中
分离出萱草根素,但对萱草根素的合成机理仍未阐
明。近年来,随着植物内生菌的深入研究,人们发现
有些植物毒素是由内生菌产生的,如:从黑麦草
(Loliumperenne)中分离出能产生麦角生物碱的麦
角菌;Braun等[5]从疯草中分离出可以产生疯草毒
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第5期 梁洁等:产萱草根素内生真菌的分离与鉴定
素-苦马豆素的内生真菌Embellisiaoxytropis,并
普遍认为苦马豆素是由内生真菌产生,彻底改变了
苦马豆素是由疯草产生的观点。目前尚未见到萱草
内生菌有关的报道,本研究对北萱草根的内生真菌
进行了分离和筛选,首次证实萱草根中存在可以产
生萱草根素的内生真菌XC-1A,其菌丝中萱草根素
含量为359.88μg·g-1,表明XC-1A承担着北萱草
中萱草根素的生物合成,对于植物本身是否产生萱
草根素有待进一步研究。
分离的菌株XC-1A采用ITS序列分析,构建系
统发育树比对的结果显示,XC-1A与Zalerionvar-
ium 的同源性达100%。结合分离方法,最终确定
该菌属于半知菌类,暗梗孢科(Dematiaceae)的
Zalerionvarium。目前,关于Zalerionvarium 的
形态学特征尚未见报道,因此本试验只能根据分离
方法和系统发育分析来确定该菌的归属,同时本试
验中对分离的菌株XC-1A进行了形态学特征的观
察,为该菌的研究提供了资料和依据。
近年来,关于内生真菌产生的生物活性物质的
筛选是目前内生真菌研究领域的一个热点[4,17]。植
物内生真菌在长期的自然选择下能够产生与寄主植
物相同或相似的次级代谢产物,这为发现新的化合
物、降低有毒植物的毒性以及新药的研发提供了重
要的开发和利用途径[18]。相关研究提示,若抑制萱
草根中合成萱草根素的内生真菌的生长,就可以降
低萱草根素的含量,为防止动物萱草中毒病提供借
鉴,将对萱草的生物学控制利用和草原生态学研究
起到积极作用,具有很好的经济效益和社会效益[6]。
另外,除了北萱草,其他萱草中是否也存在能产生萱
草根素的内生真菌? 萱草根内生真菌与萱草中萱草
根素含量之间存在何种联系? 这些问题都有待进一
步研究。
4 结论
本试验从北萱草根中分离得到4株内生真菌,
应用薄层色谱法和紫外分光光度法对真菌菌丝提取
物进行检测,确定XC-1A菌株的菌丝中含有萱草根
素,其含量为359.88μg·g-1,经5.8SrDNA-ITS
序列分析,确定菌株XC-1A为Zalerionvarium,表
明萱草根中存在产生萱草根素的内生真菌。
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(责任编辑 李美娟)
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