全 文 ：第 8卷　第 2期　　　　　　　　　　　　草地学报　　　　　　　　　　2000年　6月
Vo l. 8　No. 2　　　　　　　　　　ACT A AGREST IA SINICA　　　　　　June　2000
顿河红豆草浓缩单宁生物合成相关蛋白鉴定
王玉萍　杨茁萌　张　博
(新疆农业大学畜牧学院草原系,乌鲁木齐 830052)
摘要: 以二倍体顿河红豆草为实验材料, 运用组织培养法和香草醛-盐酸法筛选优良浓缩
单宁高表达的细胞系。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE)技术,对同一细胞
系不含浓缩单宁( CT - )愈伤组织和含有浓缩单宁( CT + )愈伤组织蛋白质进行鉴定。用制备型
SDS-双向电泳对目标蛋白进行纯度分析,以及用 SDS-PAGE 法和 IEF(等电聚焦)法测定该目
标蛋白质分子量和等电点。最后经电印渍技术, 将目标蛋白质转移至固相膜上进行氮端氨基酸
序列分析。结果表明,筛先出 10 个优良浓缩单宁合成细胞系和相同基因型愈伤组织增殖细胞
系。同一细胞系含有浓缩单宁愈伤组织比不含者多一条蛋白带, 该蛋白分子量为 28kD, 等电点
为 5. 7。该电印渍法将蛋白印渍至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上的效率较高。并测定了氮端部分氨
基酸序列。
关键词: 顿河红豆草; SDS-双向电泳; 蛋白质; 浓缩单宁; 氮端氨基酸序列
中图分类号: S 541. 4　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1007-0435( 2000) 02-0126-06
紫花苜蓿(M edicago sativa L. )是干旱、半干旱地区改土固氮不可缺少的重要豆科牧草
之一。但由于反刍家畜短时间内超量采食鲜嫩苜蓿会发生臌胀病,而造成家畜快速死亡,从
而限制其在放牧方面的利用。因此,培育不致膨胀病苜蓿品种课题早已成为国际重要的苜蓿
育种攻关课题。Kendall ( 1968)认为不致膨胀病的豆科牧草中的单宁能防止膨胀。该结论同
时被其他几个实验所证实( Gutak, 1974; Jones, 1971)。但是,苜蓿叶片中不含有浓缩单宁,仅
在种皮中含有少量( Goplen, 1980)。普通红豆草( Onobry chis v iciif ol ia)在生长的各个时期,
叶片中均含有较高浓度的浓缩单宁。顿河红豆草( Onobrychis tanait ica Spreng . )叶片中单宁
细胞排列比普通红豆草更为紧密(吴自立, 1993)。因此, 笔者认为顿河红豆草是浓缩单宁生
物合成相关蛋白基因的理想供体。本实验研究浓缩单宁相关蛋白理化性质及氮端氨基酸序
列分析。
1　材料与方法
1. 1　顿河红豆草 2n= 14,二倍体,由新疆农业大学畜牧学院草原系牧草栽培育种教研室提
供,采于伊犁昭苏县。
1. 2　顿河红豆草种子去荚后, 破除硬实,建立无菌苗。6～7d内取无菌苗子叶, 切成 4～6
块,接种于 MS 基础培养基附加 1 mg/ L 的 2, 4-D( 2, 4-二氯苯氧乙酸) , 0. 7%琼脂, pH5. 8,
在 27℃下暗培养, 诱导愈伤。21d后, 选出愈率好的细胞系,其中一半继续在诱导培养基上培
养, 另一半转入浓缩单宁合成培养基( MS + 2mg/ L BAP( 6-苄氨基嘌呤) + 0. 7%琼脂) ,
pH5. 8, 在2 7℃下暗培养。2周后, 从同一愈伤组织的不同部位取样 , 滴加Vanillin -HCl
　　收稿日期: 1999-11-25; 修回日期: 2000-02-17
(香草醛-盐酸) ,压片后,在倒置显微镜下检测浓缩单宁合成的强弱。浓缩单宁遇到 Vanillin-
HCl呈不扩散樱桃红色,颜色越红,呈红色细胞数越多,表明浓缩单宁合成强度越大。以该法
检测浓缩单宁合成的强弱, 筛选优良浓缩单宁合成细胞系( Lees, 1998、1996)。
1. 3　蛋白质分析
从含浓缩单宁( CT + )和不含者( CT - )的同一细胞系所产生的愈伤组织中各取 0. 3g 样
品,加入 300
L Tr is-HCl( pH6. 8)提取液,提取蛋白质用于蛋白质分析鉴定。
1. 3. 1　蛋白质粗分离采用 SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 )法
( Laemmli, 1970)
1. 3. 1. 1　试剂　丙烯酰胺(电泳级) ,甲叉双丙烯酰胺,四-甲基乙二胺,过硫酸铵, 三羟甲基
胺基甲烷( T ris)甘氨酸, 低分子量标准蛋白,考马斯亮蓝 R-250, 冰乙酸,甲醇,
-巯基乙醇,
SDS(十二烷基硫酸钠) ,溴酚蓝,甘油。
1. 3. 1. 2　方法　分离胶浓度为 12%,浓缩胶浓度为4%,凝胶厚度 1mm, 在室温下电泳。分
子量标准蛋白为免磷酸化酶( 97. 4kD) ,牛血清白蛋白( 66. 2kD) , 兔肌动蛋白( 43kD) , 牛碳
酸酐酶( 31kD) ,胰蛋白酶抑制剂( 20. 1kD)和鸡蛋清溶菌酶( 14. 4kD)。采用考马斯亮蓝 R-
250凝胶染色液( 0. 05%考马斯亮蓝 R-250, 45%的甲醇, 9%醋酸)和脱色液( 5%甲醇, 7%
醋酸)。电泳结束后,凝胶经染色液染色 20m in, 用去离子水冲洗,切下所需蛋白带,分析蛋白
质纯度。
1. 3. 2　蛋白质纯化
1. 3. 2. 1　试剂　两性电解质( Ampholine) ,瑞典 Pharmacia公司产品,正极缓冲液磷酸,负
极缓冲液氢氧化钠,其它试剂同 1. 3. 1。
1. 3. 2. 2　方法　用制备型双向电泳纯化蛋白质( Farrell, 1975)。第一向电泳( IEF) ,胶长
15cm, 直径 5mm ,胶浓度为 4% ,其中含 2%两性电解质( pH3. 5～10, pH5～7) , 每个样品槽
2～3个小胶片。第二向电泳( SDS-PAGE) , 浓缩胶浓度 4%,分离胶浓度 12% ,电泳结束后,
凝胶经考马斯亮蓝 R-250染色 15min,用去离子水冲洗,切下所需蛋白质斑点, 即得到纯化
蛋白质。
1. 3. 3　蛋白质分子量测定
用板状 SDS-PAGE 法测定蛋白质分子量, 分子量标准蛋白同 1. 3. 2。将 1. 3. 2制备蛋
白质斑点胶片放入 T ris-HCl( pH 6. 8)缓冲液中平衡 20min,取出后按样品槽宽度切成条,放
入另一新凝胶的样品槽进行电泳。将电泳凝胶用考马斯亮蓝 R-250染色,脱色后,按蛋白质
相对迁移率公式和已知标准分子量蛋白测定蛋白质分子量(李如亮, 1998)。
1. 3. 4　蛋白质等电点测定
用板状 IEF 法测定蛋白质等电点。将 1. 3. 2制备蛋白质斑点胶片放入T ris-HCl( pH6.
8)缓冲液中平衡 20min,迅速移入缓冲液( 8mol / L 尿素, 1. 2% SDS, 两性电解质 2% )中浸
10m in, 进行 IEF 电泳,胶厚度 1mm,浓度和成分同 1. 3. 2,电流几乎为零时停止聚焦。电泳
结束后, 将凝胶切成两半,其中一半用 12%的三氯乙酸固定液固定过夜,用考马斯亮蓝 R-
250染色, 脱色后鉴定聚焦情况。另一半按样品槽宽度切成 1cm 的小段, 将每小段胶片放入
2ml 去离子水中, 置于 4℃下 3h或过夜。当溶液温度平衡至室温时, 用 pH 计结合精密 pH
试纸测定溶液 pH 值, 该pH 值即为蛋白质的等电点。
127第 2期 王玉萍等:顿河红豆草浓缩单宁生物合成相关蛋白鉴定
1. 4　电转移
1. 4. 1　试剂　CAPS ( 3-环乙氨基-1-丙磺酸, Sigma 公司) ,丙烯酰胺(测序级 Promega) ,
PVDF(聚偏二氟乙烯)膜( Gelman)
1. 4. 2　程序　采用 Bio-Rad 公司的 Trans-Blot Cell (转移槽) , 电泳结束后, 将凝胶置于
CAPS缓冲液中( 0. 01 mo l/ L CAPS, 10%甲醇, pH11) , 浸泡 2～5min。同时将测序级的
PVDF 膜在无水甲醇中浸泡 15 s, 再移至CAPS缓冲液中浸泡。然后按常规电转移法(王台
等, 1994; Sambr ovk, 1989)进行电转, 转膜夹的阳极板上依次放入海绵 1块、滤纸 2张、适当
大小的 PVDF 膜、电泳后的凝胶、滤纸 2张、海绵 1块,特别要注意排除滤纸、PVDF 膜和凝
胶之间的气泡,然后合上转膜夹。转膜夹的正负极一定要安放正确,接通电源,稳压 50V, 转
膜 1. 5 h。
1. 5　Western blot t ing (蛋白质印渍)
转膜结束后, 取出凝胶,置于考马斯亮蓝 R-250染色液中染色 2h, 脱色后鉴定电转移效
率。同时取出 PVDF 膜(陈丽蓉, 1998) , 将有蛋白的一面向上,用去离子水冲洗 3次,置于专
用染色液中( 0. 1%考马斯亮蓝 R-250、1%醋酸、40%甲醇) ,在室温下染色 2～3min,待目标
蛋白刚刚显现即终止染色, 将染色过的 PVDF 膜置于 50%甲醇中脱色 1min,并不断更换脱
色液,待目标带一旦清晰可见,背景满意即可终止脱色。将膜稍稍晾干后,用新刀片切下目标
带,放入 1. 5mL 的 Eppendo rf管密封保存于 4℃。
1. 6　氮端氨基酸序列分析
用 PROCISE 氨基酸自动测序仪测定氮末端部分氨基酸残基序列, 便于以后开展分子
生物学方面的工作。
2　结果与分析
2. 1　浓缩单宁合成细胞系筛选
以顿河红豆草 6～7日龄无菌苗子叶( CT - )为外植体,根据浓缩单宁与 Vanillin-HCl的
显色反应,当含有浓缩单宁的细胞遇到Vanillin-HCl即出现颜色深浅不一的红色,颜色较深
者表明浓缩单宁含量较高。用该法筛选出10个优良浓缩单宁合成细胞系和相同基因型愈伤
组织增殖细胞系。
2. 2　浓缩单宁相关蛋白鉴定
为了准确获得未知蛋白的分子量,本实验采用不同浓度的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺
凝胶电泳对浓缩单宁相关蛋进行鉴定, 其中 10%和 12%浓度的胶经两种染色法鉴定后,
CT + 的愈伤组织均多一条分子量为 28kD蛋白带(见图 1)。通过对 10个不同细胞系进行鉴
定,均出现这条多出的条带。而且结果专一, 重复性好,而这条特异带又出现在含有 CT 的愈
伤组织中。初步推测该特异蛋白与浓缩单宁的合成和代谢调控有关,是基因表达的低分子量
蛋白。
2. 3　蛋白纯度鉴定
运用 SDS-PAGE 技术粗分离后的蛋白质, 进一步采用 SDS-聚丙烯酰胺双向电泳技术
分析目标蛋白纯度。在等电聚焦图谱上只有 1个蛋白带,测定后等电点为 5. 7,分子量仍为
28KD,双向电泳结果与单向SDS-PAGE结果相同。结果充分证明该目标蛋白带为一单一蛋
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白,见图( 2)。由于分子量相同的蛋白等电点间或许存在差异, 为了增加以后测序的精确度和
准确性,因此对目标蛋白的纯度做了更加具体的分析。
图 1　不同细胞系愈伤组织第 2 向电泳图谱
F ig . 1　SDS-PAGE figure o f the different cell lines calli
Lan e 4. 5. 6 CT - : Lane M M olecular weight standard : 4′5′6′. CT +
图 2　用制备型双向电泳纯化后目标蛋白的第 1 向(A)与第 2 向电泳(B)
F ig . 2　SDS-PAGE ( A ) and IEF( B) figur e of purified pr ot ein-aim
by prepar ative tw o dimensiona l electropho resis
129第 2期 王玉萍等:顿河红豆草浓缩单宁生物合成相关蛋白鉴定
2. 4　电印渍效率评价
采用电转移法将凝胶上的目标蛋白质转移至 PVDF 膜上,染色后的膜目标蛋白清晰可
见。实验的关键在于蛋白质SDS-PAGE的结果,要求电泳所得目标蛋白带清晰,目标带与邻
近条带要分开。为了确定电泳结果的效果, 笔者同时做两片凝胶模,其中一片用于电转移,另
一片电泳后直接染色, 以便于发现实验中的问题。为了验证电印渍效率的高低,电转后的凝
胶用考马斯亮蓝 R- 250染色,染出的蛋白带谱非常模糊。表明该印渍法印渍效率高, 同时
也可以稍微延长电转移时间,以取得更高的转移效率。
2. 5　氨基酸序列分析
用 PV DF 作印渍膜,用考马斯亮蓝染色后切下蛋白带,用 Applied-biosystems Procise-
PROCISE 蛋白质序列分析仪测定蛋白质氨基酸组成, 结果测出了 N 末端 23个氨基酸残
基。为今后利用 PCR技术,合成寡聚核苷酸探针,建立 cDNA 文库, 克隆该蛋白基因, 调控
CT 基因在苜蓿叶片中的表达提供依据。
3　结论与讨论
3. 1　用 V anillin-HCl法筛选出 10个优良浓缩单宁合成细胞系, 为红豆草浓缩单宁生物合
成相关的研究提供好的实验材料。
3. 2　同一细胞系含浓缩单宁愈伤组织比不含者多一条蛋白带, 10个细胞系结果相同。
3. 3　该电印渍法将蛋白质印渍至 PVDF 膜上的效率较高,适用于蛋白质 N-末端氨基酸序
列分析,效果十分理想。
3. 4　N 末端23个氨基酸残基由 12种氨基酸组成, AEN-LQ G。分别为L、E、G、Q、N、A、V、
I、D、K、S、F。
参 考 文 献
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Identif ication of Protein Related to Biosynthesis of
Condensed Tannin in Onobrychis tanaitica Spreng.
Wang Yuping　Yang Zhuomeng　Zhang Bo
( Departmen t of Grass lan d, Xinj iang Agicultural University, Urum q 830052)
　 　 Abstract 　 Onobry chis tanaitica ( diplo id ) wa s used a s mater ial t o identify pr ot ein r elated to
biosynt hesis o f condensed tannin. Bett er cell lines of calli w hich express best condensed tannin w ere
scr eened by means of t issur e culture and Vanillin-HCl. The calli o f the same cell line containing condensed
tannin and uncontaining condensed tannin w ere ident ified thr ough SDS-PAGE. T he pro tein-aim w as
pur ified and analysized with prepar ativ e tw o dimensional g el electr opho resis, the mo lecular w eight and
isoelectr ic po int wer e checked by SDS-PAGE and iso electr ic fo cusing ( IFE) respectiv ely . The protein w as
electr ic tr ansferr ed to so lid-phase membrance and the sequence o f N-terminal amino acids w ere analy sized.
The r esults show ed: ten bet ter cell lines o f calli synthesis and ten same cell lines o f calli pr olifer ation
w ere scr eened. Ther e w as one mo re special pr otein in calli cont aining condensed tannin t han the calli
uncont aining CT der ived fr om the same cell line, the molecular w eight and isoelectric point o f the pro tein is
28kD and 5. 7 respect ively . The method of elect ric blo tting has mo re efficiency . The sequence o f some
amino acids at N-terminal w as analy sized.
　　 Key words 　 Onobry chis tanaitica; SDS-tw o dimensional gel electr ophresis; Pr otein; Condensed
tannin; N-t erminal amino acid sequence
131第 2期 王玉萍等:顿河红豆草浓缩单宁生物合成相关蛋白鉴定