全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2002) 03-0221-06
顿河红豆草凝集素 cDNA克隆与序列分析
赵素容1 , 陈大明2, 陈默君1, 杨茁萌3
( 1 中国农业大学草地科学研究所, 北京 100094; 2 浙江大学园艺系, 杭州 310029;
3 新疆农业大学畜牧学院草原系, 乌鲁木齐 830052)
摘要: 利用 RT-PCR技术从顿河红豆草含浓缩单宁的愈伤组织总 RNA 中分离克隆了凝集素 cDNA . 该 cNDA 包含
完整的编码区和 3’端非编码区,所编码的氨基酸序列与其它豆科植物凝集素具有较高的同源性。
关键词: 顿河红豆草; 凝集素; cDNA 克隆; 序列分析
中图分类号: Q785　　文献标识码: A
The Cloning and Sequencing of a Lectin Gene from Onobrychis tanaitica
ZHAO Su-r ong
1 , CHEN Da-m ing
2, , CHEN M o-jun
1 , YA NG ZHuo-meng
3
( 1 Ins ti tute of Grass land Science, China Ag ricul tu ral Un ivers ity , Beij ing 100094, Chin a;
2 Department of Hor ticulture, Zh ejiang Universit it y, Hangzhou 310029, Chin a;
3 Departm ent of Gras sland, Xinjing Agricu ltural U nivers ity, U rumq 830052,C hina)
Abstract: A cDNA fr agment w as iso lated and cloned from the total RNA of call i o f Onobry chis tanaitica
containing condensed tannin using RT -PCR technique. The cDNA is 919 bp in leng th and includes an open
reading f rame encoding pept ide of 251 amino acid residues and 163 bp o f 3 uncoding reg ion. The deduced
amino acid sequence show s high homolo gy to those of other legume leact ins.
Key words : Onobry chis tanait ica Spreng. ; Lect in; cDNA cloning ; Sequence analysis
　　王玉萍等 [ 1]从顿河红豆草( Onobry chis tanai tica
Spreng. )浓缩单宁生物合成中分离到一分子量约
28KD、可能与浓缩单宁生物合成相关的特异蛋白,
并对其 N 端部分氨基酸进行氨基酸序列分析 [ 1]。经
同源性分析,该蛋白 N 端氨基酸序列与红豆草凝集
素 ( Onobrychis viciif ol ia lect in, 简称 OVL ) N 端氨
基酸序列的同源性非常高[ 2] ,因而该蛋白与 OVL 可
能是同属不同植物种中的同一类物质,简称为 OT L
( Onobry chis tanai tica lect in)。
植物凝集素是非免疫来源的糖蛋白或能结合糖
的蛋白质,它们能凝集细胞和沉淀糖蛋白[ 3]。凝集素
在生物体内有着许多重要的生理功能,如细胞的识
别和粘着、植物对病原体入侵的防御、雌蕊受粉、豆
科植物根瘤菌共生固氮、介导胞饮、病原体感染宿
主、韧皮部物质运输、分子或离子的传递等[ 4, 5]。近年
来, 凝集素在防御植物病虫害方面的作用已引起国
内外学者的关注, 并深入到抗病虫植物基因工程研
究,至今已有多种凝集素基因被克隆 [ 6～8] , 有的已被
成功导入到植物细胞中, 转基因植株表现出明显的
抗体 [ 9～12]。然而, 凝集素与红豆草浓缩单宁生物合
成的关系尚未见报告,红豆草凝集素基因也未被克
隆, 为了从分子水平上探明凝集素与红豆草浓缩单
宁生物合成的相互关系, 本研究利用 RT -PCR技术
首次分离克隆了顿河红豆草凝集素 cDNA。
收稿日期: 2002-01-10; 修回日期: 2002-05-30
基金项目: 国家自然科学基金项目( C02030102)
作者简介: 赵素容, ( 1975-) ,女,中国农业大学草地科学研究所硕士生,主要从事牧草与草坪的研究
第 10卷　第 3期
　Vo l. 10　　No. 3
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　2002 年　9月
Sept . 　2002
1　材料与方法
1. 1　供试材料　
顿河红豆草( Onobry chis tanaiti ca Spreng . )种
子由新疆农业大学畜牧学院草原系牧草栽培育种教
研室提供。
1. 2　菌株、酶、试剂
转化受体菌为大肠杆菌 T G1菌株。pGEM-T
easy Vector 载体系统和 T 4 DNA 连接酶购自
Promega 公司, T aq DNA 聚合酶购自 MBI 公司,
Superscript
TMⅡ逆转录酶和 RNA 提取试剂盒购自
Life Technolog ies 公 司, 限 制 性内 切 酶 购 自
TaKaRa公司。
1. 3　愈伤组织诱导
红豆草种子去荚后,以 98%硫酸处理 3～5m in,
10%次氯酸钠表面消毒 15～20min,无菌水清洗数
遍,接种于 1/ 2M S 固体培养基上, 在 27℃下暗培养
发芽。取 7日龄内的无菌苗子叶切成小块, 接种于
MS附加 1mg/ L 2, 4-D 固定培养基上,在 27℃下暗
培养诱导愈伤组织。筛选出愈率高的细胞系,将其愈
伤组织一半转入浓缩单宁合成培养基( M S+ 2mg / L
BA )中,另一半继续在诱导培养基( M S+ 1mg/ L 2,
4-D)中培养以保持细胞系。
1. 4　RNA制备
取在浓缩单宁合成培养基中诱导 3周的愈伤组
织 100mg 左右, 采用 Life T echno logies公司的 T ri-
zol一步法制备总RNA,操作步骤按厂商说明进行。
1. 5　RT-PCR
1. 5. 1　逆转录　15ug / mL olig o( dT ) 12-18引物与大
约 3ug 总 RNA 退火, 在 SuperscriptTMⅡ逆转录酶
作用下合成单链 cDNA。
1. 5. 2　OT L 基因中间部分分离　根据红豆草凝集
素氨基酸序列,设计了简并核苷酸引物P1、P2, 扩增
OTL 基因的中间部分。义务序列如下。
P15’——AT ( ATC) ( CT ) T ( AGCT ) CA ( AG)
GG( AGCT) GA( CT ) AC( AGCT ) GT——3’
P25’——C ( AGCT ) G G( CT ) T T ( AG) T T
( AGCT ) C ( GT ) ( AG) T A( AG) A A——3’
1
L 逆转录反应混合物用于 PCR反应。40
L
PCR 反 应体 系 ( 10mmol/ L T ris-HCI, pH8. 3,
50mmol/ L KCI, 1. 5mmol/ L M gCl2 )中, 4种 dNT P
浓度各为 200umol/ L . 引物 P1、P2 的浓度各为
0. 5umol / L , 2. 0个单位 Taq DNA 聚合酶。热循环
条件为 94℃预变性 5m in 后, 94℃变性 60s, 52℃退
火 60s, 72℃延伸 90s, 30 轮循环, 循环结束后 72℃
继续延伸 10min。PCR 产物在 1. 0%琼脂糖凝胶中
电泳检测。
1. 5. 3　3’RACE 法扩增 OT L 基因的 3’端　采用
Life T echnolog ies公司的 3’RACE系统引物AP 和
AUAP,先以 AP 为引物, 进行逆转录反应, 操作方
法同上。再以引物 P1和 AUAP 扩增基因 3’端, 除
退火温度调整为 60℃外,其余条件同上。
AP5’——GGCCA CGCGT CGACT AGTAC
( T) 17——3
AU AP5’——GGCCA CGCGT CGACT AG-
T AC——3’
1. 5. 4　扩增 OT L 基因的 5’端编码区　根据已测
得 OTL 的 N 端氨基酸序列, 设计简并核苷酸引物
P3;由 3’RACE 克隆的核苷酸序列设计特异核苷酸
引物 P4、P5。
P35’——T T A T GG C( ATCG) G A( AG) A A
( CT) A T ( AT C) G T ( AGCT ) ( AT ) ( GC) ( AGCT )
T T ( CT ) G A——3’
P45’—— TAG CGT AGC TT T CT T T CT
T A——3’
P55 ’—— GAT CGA GAC AT G AGG
GT A——3’
以 P3和 P4作引物进行第一轮 PCR 反应, 再
以 0. 5
L 的第一轮 PCR 反应混合液为模板,用 P3
和 P5作引物进行第二轮 PCR 扩增。
1. 6　PCR 产物克隆
PCR产物在 1. 0%琼脂糖凝胶中电泳分离后,
切下含目的片段的胶块, 用玻璃奶 DNA 回收试剂
盒进行回收和纯化。取适量经纯化的 PCR 产物与
222 草　地　学　报 第 10卷
50ng pGEM-T easy Vector 载体在 T 4 DNA 连接
酶作用下连接。连接产物转化大肠杆菌TG1菌株感
受态细胞, 在 IB/ Amp/ IPT G/ X-gal 平板上筛选重
组子。挑取白色菌落,经 LB 液体培养后,碱裂解法
抽提质粒 DNA ,经限制性内切酶酶切、PCR 鉴定。
1. 7　序列分析
委托北京赛百盛生物工程公司测序。
2　结果与分析
2. 1　OTL基因扩增及克隆
2. 1. 1　OTL 基因中间部分的扩增及克隆　以 P1、
P2为引物进行 PCR 反应, PCR 产物在 1. 0%琼脂
糖凝胶中检测到一条约 500bp 的特异条带(图 1
A )。PCR 产物回收纯化后直接与 pGEM-T easy
Vecto r 载体连接, 限制性内切酶酶切鉴定重组
DNA 如图 1B 所示,命名为 pGEMOT L-M。
图 1　RT-PCR 法扩增 OTL基因的中间部分
Fig. 1　Amplification and cloning o f the middle pa rt o f OT L cDNA by RT-PCR
1　DL -2, 000　2　RT -PCR 产物　3　Lam bda DNA/ EcoR1+ HindIII　4　100bpDNA Ladder
5～6　pGEMOT L-M　7～8　pGEMOTL -M/ EcoR1
2. 1. 2　OT L 基因的 3’端的扩增及克隆　3’RACE
系统用于快速扩增 cDNA 的 3’末端。P1和 AUAP
为引物的 PCR 反应扩增出 650bp 和 900bp 两条
cDNA 片段(图 2 A ) , 以 P1 和 P2为引物对这两个
cDNA 片段进行 PCR 扩增,结果表明, 900bp 片段
为所需目的片段(图2 B)。重组DNA 经过限制性图
谱和 PCR 分析(图 2 C) ,得到的阳性克隆,命名为
pGEMOT L-3’。
2. 1. 3　OT L 基因 5’端的扩增及克隆　根据已测
得的OT L 的 N 端氨基酸序列设计简并核苷酸引物
P3, 其 5’端加入了起始密码子 AT G; 根据 pGE-
MOT L-3’的核苷酸序列设计了一对嵌套引物 P4、
P5。以 P3和 P4为引物先进行一轮 PCR反应, 接着
用第一轮PCR反应混合液直接作为第二轮 PCR的
模板。第二轮 PCR以 P3 和 P5为引物, 扩增出约
800bp 的特异带(图 3 A) , PCR 分析表明该特异带
为所需目的片段 (图 3 B)。酶切、PCR 鉴定重组
DNA(图 3C) ,阳性克隆命名为 pGEMOT L-5’。
2. 2　序列分析
2. 2. 1　DNA 测序　对重组质粒 pGEMOTL-M、
pGEMOT L-3’、pGEMOTL-5’序列分析表明, pGE-
MOTL-M 大小为 499bp, pGEMOT L-3’大小为
879bp, pGEMOT L-5大小为 789bp。
将 3次克隆的基因序列拼接在一起,得到顿河
红豆草凝集素基因编码区的全长序列及 3’端非编
码区,共 919bp,含一个编码 251个氨基酸的开放阅
读框和 163bp的 3’端非编码区(图 4)。
223第 3期 赵素容:顿河红豆草凝集素 cDNA 克隆与序列分析
图 2　3’RACE法扩增 OTL基因的 3’端
Fig. 2　Amplification and cloning o f the 3end of OTL cDNA by 3RACE
1　100bp DNA Ladder　2　3RACE扩增片段( 3’RACE products )　3　100bp DNA L adder　4　650bp片段 PCR 产物( PCR prod-
ucts of 650bp f ragmen t )　5　900bp 片段 PCR 产物( PCR produ cts of 900bp f ragm ent )　6　Neg at ive cont rol/ H2O　7　Posit ive con-
tr ol / pGEMOT L-M　8　100bp DNA Ladder　9～11　pGEM OTL-3’/E coRI　12～ 14　pGEM OT L-3’/ PCR　 15　Negat ive con-
tr ol / H2O　16　Posi tive cont rol/ pGEMOT L-M
图 3　RT-PCR 扩增 OTL基因的 5’端编码区
F ig . 3　Amplification and cloning of the 5end of OTL cDNA by RT -PCR
1　100bp DNA Ladder　2　T he products of RT -PCR 3　Lambd a DNA/ EcoRI+ H indIII　4　目的片段以 p1、p2为引物的 PCR产物
( PCR products of the am plif ied fragment by primers p 1、p2)　5　Posit ive cont rol / pGEMOTL -M　6　目的片段以 p1、AUAP 为引物
的PCR 产物 ( PCR products of the am plif ied fr agment by primers p 1、AUAP )　 7　Posit ive cont rol / pGEM OTL-3’　 8　Lambda
DNA/ E coRI+ HindIII　9～12　pGEMOTL -5’/E coRI　13～16　PCR products of pGEMOT L-5　17　-Negat ive con tr ol / H2O
18　Pos it ive cont rol/ pGEM OT L-M
224 草　地　学　报 第 10卷
　　　　　ATGGCGGAAAACTACGTTT GCT TCGATT TT AGCAAGTT TCTATCT GGCCAAGAGAAT TT A
　　　　　　M 　A 　E 　N 　I 　V 　C 　F 　D 　F 　S 　K 　F 　L 　S 　G 　Q 　E 　N 　L
　　　　　ATCCTT CAGGGTGAT ACGGTTACAGATGATT CAAACCGCTGTTT AGT ACT AACCCGTGAA
　　　　　 I L Q G D T V T D D S N R C L V L T R E
　　　　　AATAACGGGCGT CCAGTCCAAGACT CTGT TGGACGAGTCCTATAT CAAACCCCTAT CCAT
N N G R P V Q D S V G R V L Y Q T P I H
　　　　　CTT TGGGAT AAGCAAATAGACAAAGAAGCT AGCTTT GAAACTAGT TTCACCTT TTT CAT C
L W D K Q I D K E A S F E T S F T F F I
　　　　　TAT AGGGAGAACAT TAATAGAGGAGGAGAT GGCAT TACCT TT TTCCT TGCCCCTACTGAT
Y R E N I N R G G D G I T F F L A P T D
　　　　　ACTCAACCGAAATCCGGTGGAGGATAT CT GGGAATT TT CAAGGACGCTGAAT CCAACGAA
T Q P K S G G G Y L G I F K D A E S N E
　　　　　ACTGTTGTT GCAGT CGAATTT GACACTTT CTCAAACAGGTGGGAT CCAGCAAATT CCCAT
T V V A V E F D T F S N R W D P A N S H
　　　　　ATCGGAATCAAT GT TAATT CCGTT AAGTCGACGAT TACTAAGCCATGGAGT TTGAAGAAT
I G I N V N S V K S T I T K P W S L K N
　　　　　GAT TATT TCACAGTCACTATAACCTATGAT GCT CCGGCCCGT TCCTTAAGTGT TT CAT CT
D Y F T V T I T Y D A P A R S L S V S S
　　　　　TT TT AT CGT AACAAACCAGATGATATT TT TACCGTAAAGGCGAGT GT GCATT TGAGGGAT
F Y R N K P D D I F T V K A S V H L R D
　　　　　GCT CTTCCACAAT GGGT AAGGATT GGTT TATCAGCTGCAACT GGAGACTTAGTGGAACAA
A L P Q W V R I G L S A A T G D L V E Q
　　　　　CATCGT TT AT ATTCATGGT CTTT CAAATCT GT GTT GCCACTAGAT TCTAGCACTACTAAA
H R L Y S W S F K S V L P L D S S T T K
　　　　　GGTT TT AAGAACACCAACTAT AT ACAACAAGCATGAGCTACTAGCTAGCTACCCT CAT GT
G F K N T N Y I Q Q A *
　　　　　CTCGAT CGT TGCATGGAT AT ATATT AT CTAAGAAAGAAAGCTACGCTAAGAAT GTAATAA
　　　　　ATAAAGCTT TCCTATT TAAACT TT CAAGCCT GTACTAT AT AGCAATAAAAAACTGT TCT G
　　　　　TT GCT TTT TAAAAAAAAAA
图 4　顿河红豆草凝集素基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
下划线部分为 PCR引物序列, * 代表终止密码
Fig . 4　Nucleo tide sequence and deduced amino acid sequence of the cloned OTL cDNA
Underline indicates the pr imer ssequence, Aster isk repr esents the terminal code
2. 2. 2　同源性分析　在 GenBank 中经同源性分析
表明, 该 cDNA 核苷酸序列与其它豆科植物凝集素
基因的同源性为 26. 1%～50. 5% ,其中与香槐凝集
素的同源性最高,为 50. 5%。所推导的氨基酸与大
多数豆科植物凝集素的氨基酸的同源性为 45%～
55%,其中与红豆草凝集素( OVL)氨基酸序列的同
源性最高, 达到 91. 6%, 而与绝大多数双子叶植物
的其他科以及单子叶植物、细菌等物种中的凝集素
同源性低于21%。该结果与进化上的亲缘关系相一
致。
3　结论
本研究首先克隆了顿河红豆草凝集素 OT L 基
因的编码区3’端非编码区。该序列推导的氨基酸序
列由 251个氨基酸残基组成。与红豆草凝集素OVL
225第 3期 赵素容:顿河红豆草凝集素 cDNA 克隆与序列分析
的氨基酸序列同源性为91. 6%。该基因的表达及其
与顿河红豆草浓缩单宁生物合成的相关性尚需要进
一步研究。
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226 草　地　学　报 第 10卷