全 文 ：植物科学学报　 ２０１５ꎬ ３３(３): ３４６~３５４
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５－０８３７􀆰 ２０１５􀆰 ３０３４６
葡萄ＣＯＲ２７基因的克隆与抗寒功能研究
范高韬１ꎬ２ꎬ 孙小明２ꎬ 任小蝶３ꎬ 李绍华２ꎬ 辛海平２∗ꎬ 王万军１∗
(１. 西南交通大学生命科学与工程学院ꎬ 成都 ６１００３１ꎻ ２. 中国科学院植物种质创新与特色农业
重点实验室ꎬ 中国科学院武汉植物园ꎬ 武汉 ４３００７４ꎻ ３. 中国地质大学环境学院ꎬ 武汉 ４３００７４)
摘　 要: 冬季低温是制约我国葡萄和葡萄酒产业发展的主要因素之一ꎬ 揭示葡萄在冷胁迫下的信号转导通路、 挖
掘抗寒相关基因并解析其功能ꎬ 对高耐寒品种的培育具有重要的理论和应用价值ꎮ 本研究在欧亚种‘玫瑰香’葡
萄(Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ. ‘Ｍｕｓｃａｔ Ｈａｍｂｕｒｇ’)冷胁迫相关转录组分析的基础上ꎬ 鉴定了一个抗寒候选基因ꎬ 通过同源
性分析将其命名为 ＶｖＣＯＲ２７ꎮ ＶｖＣＯＲ２７基因的 ｃＤＮＡ序列(１０８２ ｂｐ)中ꎬ 其开放阅读框(ＯＲＦ)为 ９０９ ｂｐꎬ 编
码 ３０２个氨基酸ꎮ 同源性分析显示ꎬ １３个物种的 ＣＯＲ２７ 蛋白均具有 ３ 个特有的保守结构域ꎮ 定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 分
析表明ꎬ ＶｖＣＯＲ２７在 ４℃低温处理 ２４ ｈ后大量表达ꎮ 基于基因组序列的启动子基序分析表明ꎬ ＶｖＣＯＲ２７ 启动
子区均只含有 １个 ＥＥ、 ＥＥＬ、 Ｇ￣ｂｏｘ、 ＡＢＲＥＬ元件ꎬ 其数量少于 ＡｔＣＯＲ２７ꎬ 这可能是 ＶｖＣＯＲ２７ 响应冷胁迫较
ＡｔＣＯＲ２７滞后的原因ꎮ 对 ３个超表达 ＶｖＣＯＲ２７转基因拟南芥株系的抗寒性鉴定表明ꎬ ＶｖＣＯＲ２７参与了植株对
冷胁迫的应答并作为正调控因子增强了植株对冷胁迫的耐受能力ꎮ
关键词: 葡萄ꎻ ＣＯＲ２７基因ꎻ 冷处理ꎻ 抗寒性ꎻ 转基因拟南芥
中图分类号: Ｑ９４３􀆰２ꎻ Ｓ６６３􀆰１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１５)０３￣０３４６￣０９
　 　 　 收稿日期: ２０１５￣０１￣２０ꎬ 退修日期: ２０１５￣０２￣１４ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金重点项目(３１１３００４７)ꎻ 国家科技支撑计划(２０１３ＢＡＤ０２Ｂ０４)ꎮ
　 作者简介: 范高韬(１９８９－)ꎬ 男ꎬ 硕士ꎬ 研究方向为葡萄抗逆机理(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｆａｎｇａｏｔａｏ＠１２６􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｘｉｎｈａｉｐｉｎｇ２１５＠ｈｏｔｍａｉｌ􀆰 ｃｏｍꎻ ｗａｎｊｕｎｗａｎｇ＠ｈｏｍｅ􀆰 ｓｗｊｔｕ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ)ꎮ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＯＲ２７ ｆｒｏｍ Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ
ＦＡＮ Ｇａｏ￣Ｔａｏ１ꎬ２ꎬ ＳＵＮ Ｘｉａｏ￣Ｍｉｎｇ２ꎬ ＲＥＮ Ｘｉａｏ￣Ｄｉｅ３ꎬ ＬＩ Ｓｈａｏ￣Ｈｕａ２ꎬ
ＸＩＮ Ｈａｉ￣Ｐｉｎｇ２∗ꎬ ＷＡＮＧ Ｗａｎ￣Ｊｕｎ１∗
(１. Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｊｉａｏｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００３１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
２. Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｗｕｈａｎ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎꎬ
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３. Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓꎬ
Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７４ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｌｏｗ ｗｉｎｔｅｒ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ
ｇｒａｐｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｗｉｎｅ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｉｎ Ｃｈｉｎａ. Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｄｕｒｉｎｇ
ｃｏｌｄ ｓｔｒｅｓｓ ｗｉｌｌ ｈｅｌｐ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｈｉｇｈ ｃｏｌｄ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｏｕｒ ｐｒｅｖｉｏｕｓ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ａ ｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｓｈｏｗｅｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｉｎ Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ.
‘Ｍｕｓｃａｔ Ｈａｍｂｕｒｇ’ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｌｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｎａｍｅｄ ＶｖＣＯＲ２７ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ
ｈｏｍｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ. Ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＶｖＣＯＲ２７ ｃＤＮＡ ｗａｓ １０８２ ｂｐꎬ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ａ
９０９ ｂｐ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ (ＯＲＦ) ａｎｄ ｅｎｃｏｄｅｄ ３０２ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ. Ｈｏｍｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ＣＯＲ２７ｓ ｆｒｏｍ ｔｈｉｒｔｅｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｙ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｅｅ ＣＯＲ２７￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ
ｄｏｍａｉｎｓ. Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ ＶｖＣＯＲ２７ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ
ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｔ ２４ ｈ ａｆｔｅｒ ｃｏｌｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ. Ｆｏｕｒ ｍｏｔｉｆｓꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＥＥꎬ ＥＥＬꎬ Ｇ￣ｂｏｘ ａｎｄ ＡＢＲＥＬꎬ
ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎｓ ( ｆｒｏｍ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ) ｏｆ
ＶｖＣＯＲ２７ ｂｕｔ ａｔ ｌｅｓｓ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ＡｔＣＯＲ２７. Ｔｈｉｓ ｍａｙ ｂｅ ｗｈｙ
ＡｔＣＯＲ２７ ｓｈｏｗｅｄ ｍｏｒｅ ｔｉｍｅｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｃｏｌｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｈａｎ ｄｉｄ ＶｖＣＯＲ２７. Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｎｅｓ ｕｎｄｅｒ ｃｏｌｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＶｖＣＯＲ２７ ｗａｓ
ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｃｏｌｄ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｏｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ＣＯＲ２７ꎻ Ｃｏｌｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔꎻ Ｃｏｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅꎻ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
　 　 中国葡萄主栽区主要分布在北纬 ４５° ~ ２５°范
围内[１ꎬ２]ꎬ 冬季低温是影响我国葡萄及葡萄酒产业
发展的重要环境因子之一ꎮ 而目前主栽的欧亚种
(Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ.)和欧美杂交种(ｈｙｂｒｉｄ ｂｅｔｗｅｅｎ
Ｖ. ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ. ａｎｄ Ｖ. ｌａｂｒｕｓｃａ Ｌ.)品种抗寒能力
差ꎬ 冬季需在植株基部覆土防寒ꎬ 否则在温度低于
－１５℃时会发生严重冻害ꎬ 严重影响葡萄生产ꎬ 甚
至会导致树体死亡ꎬ 因此提高葡萄的抗寒性是我国
葡萄产业中亟待解决的重要课题ꎮ 选育并推广高抗
寒葡萄品种能够大幅度地降低生产成本(如覆土及
去土成本)ꎬ 提高我国葡萄产业在国内外市场上的
竞争力ꎬ 对实现我国葡萄产业的可持续发展具有十
分重要的意义ꎮ
我国于 ２０ 世纪 ５０ 年代开始进行葡萄抗寒育
种[３－５]ꎮ 山葡萄(Ｖ. ａｍｕｒｅｎｓｉｓ Ｒｕｐｒ.)是葡萄属中
最抗寒的品种ꎬ 可耐受－４０℃ ~ －５０℃的极端低
温[６]ꎬ 因此被广泛作为杂交亲本ꎬ 并从山欧杂种
中选育出了数个抗寒优良酿酒品种[２ꎬ３]ꎮ 但由于杂
交育种工作量大、 周期长、 调控植株耐寒性和果实
品质性状的基因间存在连锁等原因[５]ꎬ 选育的抗
寒品种无论在数量上或综合性状上都远远不能满足
我国葡萄产业的需求ꎮ 通过揭示葡萄对冷胁迫的响
应机制ꎬ 深入挖掘冷胁迫下信号转导通路中的关键
基因ꎬ 利用转基因技术改良其抗寒性ꎬ 在葡萄抗寒
育种中具有极大的优势与广阔的应用前景[７ꎬ８]ꎮ
植物响应冷信号的机理在模式植物拟南芥中研
究最为集中ꎮ 目前已经确立了以 ＣＢＦｓ(ＣＲＴ / ＤＲＥ
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ ) 转录因子为核心ꎬ 以 ＨＯＳ１
( Ｈｉｇｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ
Ｇｅｎｅｓ １)、 ＩＣＥ１( Ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ＣＢＦ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ)等
基因为 ＣＢＦｓ 上游调控信号ꎬ 以 ＲＤ２９Ａ ( Ｒｅ￣
ｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ２９Ａ)、 ＣＯＲ１５Ａ ( Ｃｏｌｄ￣
Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ １５Ａ)等为 ＣＢＦｓ下游调控信号的
基因调控网络[９]ꎻ 同时也发现存在其他调控途径ꎬ
并共同在冷驯化过程中起作用[１０]ꎮ 而葡萄耐寒机
制的研究基本上处于起步阶段ꎬ Ｘｉａｏ 等[１１ꎬ１２]分离
了河岸葡萄 ( Ｖ. ｒｉｐａｒｉａ)和欧亚种葡萄的 ＣＢＦ /
ＤＲＥＢ１￣ｌｉｋｅ基因 ＣＢＦ１￣４ꎬ 发现低温处理后 ＣＺＢＦ４
上调表达且能够维持一定的表达水平ꎬ 据此推测
ＣＢＦ４可能和葡萄越冬相关ꎻ Ｌｉ等[１３ꎬ１４]从欧亚种葡
萄‘玫瑰香’中克隆了 ＩＣＥ１和 ＨＯＳ１基因ꎬ 并通过
拟南芥转基因系统验证了其在冷胁迫响应中的功
能ꎻ Ｔｉｌｌｅｔｔ等[８]利用过表达 ＶｖＣＢＦ４ 的葡萄植株ꎬ
通过转录组分析对 ＶｖＣＢＦ４的下游基因进行了初步
鉴定ꎮ 此外ꎬ 由于山葡萄抗寒性极强ꎬ 近年来对其
耐寒机理的研究也成为了热点[１５]ꎬ 目前已完成了
山葡萄中 ＣＢＦｓ 和 ＩＣＥ１ 基因的克隆和功能验
证[１６－２０]ꎮ 但整体而言ꎬ 我们对葡萄冷胁迫下相关
基因的功能及响应冷胁迫的信号转导通路了解甚
少ꎮ
笔者所在课题组分析‘玫瑰香’葡萄(Ｖ. ｖｉｎｉ￣
ｆｅｒａ Ｌ. ‘Ｍｕｓｃａｔ Ｈａｎｂｕｒｇ’)的转录组数据时发现
了一个在冷处理后期显著上调表达的基因ꎬ 通过在
ＮＣＢＩ数据库中比对发现其序列与 ＣＯＲ２７(Ｃｏｌｄ￣
Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ ２７)基因具有较高的同源性ꎬ 因
此将其命名为 ＶｖＣＯＲ２７ꎮ ＣＯＲ２７为植物中发现的
受冷胁迫诱导的小分子量蛋白[２１－２２]ꎮ Ｍｉｋｋｅｌ￣
ｓｅｎ[２１]基于芯片数据的分析结果对 ＡｔＣＯＲ２７(Ａｒａ￣
ｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ)基因的表达模式进行了研究ꎬ
发现其在拟南芥中只对冷胁迫有响应ꎻ ＣＯＲ２７ 基
因启动子区域含有 ＥＥ(Ｅｖｅｎｉｎｇ Ｅｌｅｍｅｎｔꎬ 序列为
ＡＡＡＡＴＡＴＣＴ)顺式作用元件ꎬ 其表达受昼夜节律
调控信号的影响ꎮ 目前还未见 ＣＯＲ２７ 可以增加植
物抗寒性的报道ꎮ
为深入了解 ＶｖＣＯＲ２７ 基因编码区结构特点ꎬ
本研究拟从‘玫瑰香’葡萄中克隆其编码序列ꎬ 并
与已公布的‘黑比诺’葡萄(ＰＮ４００２４)基因组注释
信息进行比较ꎻ 对 ＶｖＣＯＲ２７可能编码的氨基酸序
列进行分析ꎬ 并与其他物种中已经报道的 ＣＯＲ２７
基因序列进行同源比对ꎻ 同时收集‘玫瑰香’葡萄
４℃低温下不同处理时间点的叶片ꎬ 检测ＶｖＣＯＲ２７
在表达水平上对冷胁迫的响应ꎻ 利用 ＶｖＣＯＲ２７ 编
码区核苷酸序列构建 ３５Ｓ 启动子驱动的过表达载
体转化拟南芥ꎬ 并对阳性植株的抗寒能力进行评
７４３　 第 ３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 范高韬等: 葡萄ＣＯＲ２７基因的克隆与抗寒功能研究
估ꎬ 以验证 ＶｖＣＯＲ２７基因在葡萄响应冷胁迫中的
作用ꎬ 同时也为揭示葡萄响应冷胁迫的信号通路提
供依据ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料
‘玫瑰香’葡萄为中国科学院武汉植物园园艺作
物生物学课题组保存的组培苗ꎬ 其培养基为 １ / ２ Ｂ５
培养基 ＋ ３０ ｇ / Ｌ 蔗糖ꎬ 光周期为 １６ ｈ 光照 / ８ ｈ黑
暗ꎬ 光照强度为 １００ μｍｏｌ􀅰ｍ－２􀅰ｓ－１ꎬ 培养温度为
２６℃ꎮ 培养 ３０ ｄ后以茎段作为外植体继代一次ꎮ
转化材料拟南芥为 Ｃｏｌｕｍｂｉａ￣０ 野生型ꎮ 将拟
南芥种子置于 ４℃冰箱中 ２ ~ ３ ｄ 完成春化处理ꎬ
然后播种在装有泥炭土的塑料盆中(口径 １０ ｃｍ)ꎬ
２５℃条件下暗培养 ２ ｄ 后再置于湿度为 ４０％ ~
６０％的人工气候室中培养(１６ ｈ光照 / ８ ｈ黑暗)ꎮ
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 低温处理
将‘玫瑰香’葡萄组培苗(具有 ５片展开的功能
叶)放入光周期为 １６ ｈ 光照 / ８ ｈ 黑暗、 光强为
１００ μｍｏｌ􀅰ｍ－２􀅰ｓ－１的 ４℃低温光照培养箱中进行冷
处理ꎬ 并在 ０、 ２、 ４、 ８、 ２４、 ４８ ｈ 时收集植株顶
芽及第一片展开叶(每一处理时间点取 ３ 个重复样
品)ꎬ 液氮速冻后－７０°Ｃ超低温冰箱保存、 备用ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 总 ＲＮＡ提取和 ｃＤＮＡ合成
分别取冷处理 ０、 ２、 ４、 ８、 ２４、 ４８ ｈ 时的
‘玫瑰香’葡萄样品ꎬ 用北京天恩泽柱式植物总
ＲＮＡＯＵＴ ２􀆰 ０试剂盒分别提取每一处理时间点 ３
个样品的总 ＲＮＡꎻ 采用 ＲＱ１ Ｒｎａｓｅ￣ｆｒｅｅ Ｄｎａｓｅ Ⅰ
(Ｐｒｏｍｅｇａꎬ ＵＳＡ)去除基因组 ＤＮＡ 后ꎬ 再用 Ｓｕ￣
ｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ⅲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎꎬ
ＵＳＡ)将 ＲＮＡ反转录成 ｃＤＮＡꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３　 ＶｖＣＯＲ２７基因的克隆
以‘玫瑰香’ 葡萄转录组数据库中得到的
ＶｖＣＯＲ２７ 序列片段为基础ꎬ 结合已公布的‘黑比
诺’葡萄基因组注释信息ꎬ 运用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ
５􀆰 ０软件设计扩增 ＶｖＣＯＲ２７ 编码区全长的引物
(ＶｖＣＯＲ２７Ｆ￣ＳａｃⅠ和 ＶｖＣＯＲ２７Ｒ￣ＫｐｎⅠꎬ 表 １)ꎮ
引物由武汉擎科创新生物科技有限公司合成(下
同)ꎮ 以冷处理 ２４ ｈ 时的‘玫瑰香’葡萄 ｃＤＮＡ 为
模版进行编码区扩增ꎻ 利用 ＴＩＡＮｇｅｌ Ｍｉｄｉ Ｐｕｒｉｆｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ｋｉｔ ＤＰ２０９试剂盒对得到的 ＰＣＲ扩增产物进行
割胶回收ꎻ 将回收产物连接到 ｐＧＥＭ￣Ｔ￣ｅａｓｙ 载体
上并利用 Ｔ７和 ＳＰ６引物进行测序ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４　 生物信息学分析
利用 ＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒ 程序(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ. ｎｌｍ.
ｎｉｈ.ｇｏｖ / ｇｏｒｆ / ｇｏｒｆ.ｈｔｍｌ)预测 ＶｖＣＯＲ２７ 的编码区
序列(开放阅读框)ꎮ 使用 Ｐｒｏｔｐａｒａｍ 程序(ｈｔｔｐ: / /
ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / )对蛋白质的
基本理化性质进行分析ꎮ 在 ＮＣＢＩ 数据库中利用
ｂｌａｓｔｐ搜索 ＶｖＣＯＲ２７的同源蛋白后ꎬ 使用 ＭＥＭＥ
软件(ｈｔｔｐ: / / ｍｅｍｅ.ｎｂｃｒ.ｎｅｔ / ｍｅｍｅ / )对其氨基酸
序列进行相似性比对和保守结构域预测ꎻ 并采用
ＭＥＧＡ ５􀆰１软件对不同物种中 ＣＯＲ２７ 蛋白进行系
统发育分析ꎮ 基于葡萄基因组数据库的序列信息ꎬ
利用 ＰｌａｎｔＣａｒｅ在线分析 ＶｖＣＯＲ２７ 基因的启动子
区域顺式作用元件 ( ｈｔｔｐ: / / ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ｐｓｂ.
ｕｇｅｎｔ.ｂｅ / ｗｅｂｔｏｏｌｓ / ｐｌａｎｔｃａｒｅ / ｈｔｍｌ / )ꎮ
表 １　 ＶｖＣＯＲ２７基因序列及定量 ＲＴ￣ＰＣＲ扩增引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ＶｖＣＯＲ２７ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′– ３′)
产物长度(ｂｐ)
Ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ＶｖＣＯＲ２７ Ｆ￣ＳａｃⅠ ＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＧＴＣＣＧ
ＶｖＣＯＲ２７Ｒ￣ＫｐｎⅠ ＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＣＡＡＡＣ
９２１
ＶｖＣＯＲ２７ Ｆ￣ＲＴ ＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＧＧＡＧＴＧＣＧ
ＶｖＣＯＲ２７Ｒ￣ＲＴ ＡＡＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＴＣＣＡＴ
１３９
ＶｖＡｃｔｉｎ￣Ｆ ＣＴＴＧＣＡＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴ
ＶｖＡｃｔｉｎ￣Ｒ ＴＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡ
６３
ＡｔＡＣＴ２ ￣Ｆ ＴＴＡＣＣＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡ
ＡｔＡＣＴ２ ￣Ｒ ＡＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡ
７５
ｈｐｔＩＩ￣Ｆ ＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＴ
ｈｐｔＩＩ￣Ｒ ＧＣＣＧＴＧＧＴＴＧＧＣＴＴＧＴＡＴＧ
２１３
８４３ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
１􀆰 ２􀆰 ５　 定量 ＲＴ￣ＰＣＲ分析
依据克隆得到的 ＶｖＣＯＲ２７基因序列信息设计
定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 引物 (ＶｖＣＯＲ２７ Ｆ￣ＲＴ 和 ＶｖＣＯＲ２７
Ｒ￣ＲＴꎬ 表 １)ꎮ 以 ＶｖＡｃｔｉｎ 基因(引物为 ＶｖＡｃｔｉｎ￣Ｆ
和 ＶｖＡｃｔｉｎ￣Ｒꎬ 表 １)为内参ꎬ 参照 ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉ￣
ｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ(Ｒｏｘ)试剂盒说明书ꎬ
运用 ＡＢＩ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＴＭ实时荧光定量 ＰＣＲ 仪检
测 ＶｖＣＯＲ２７基因在‘玫瑰香’葡萄分别冷处理 ０、
２、 ４、 ８、 ２４、 ４８ ｈ时的表达水平ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ６　 超表达ＶｖＣＯＲ２７转基因拟南芥的获得
利用扩增基因片段的 ＰＣＲ 引物(ＶｖＣＯＲ２７ Ｆ￣
ＳａｃⅠ和 ＶｖＣＯＲ２７Ｒ￣ＫｐｎⅠꎬ 表 １)上的酶切位点
(ＳａｃⅠ和 ＫｐｎⅠ)ꎬ 将 ＶｖＣＯＲ２７ 编码区序列连接
到 ｐＣａｍｂｉａ１３０１ｓ 载体中ꎬ 构建超表达载体
ｐＣａｍｂｉａ１３０１ｓ∷ＶｖＣＯＲ２７ꎻ 采用电击法将质粒转
化到农杆菌菌株 ＧＶ３１０１中ꎬ 再用浸花法将超表达
载体导入拟南芥中ꎻ 收取 Ｔ０代种子ꎬ 播种后利用
潮霉素筛选出 Ｔ１代转基因拟南芥株系ꎮ 提取野生
型和 ３个超表达 ＶｖＣＯＲ２７转基因拟南芥株系的基
因组 ＤＮＡꎬ 利用 ＰＣＲ 扩增 ＶｖＣＯＲ２７(引物为 Ｖｖ￣
ＣＯＲ２７ Ｆ￣ＳａｃⅠ和 ＶｖＣＯＲ２７ Ｒ￣ＫｐｎⅠꎬ 表 １)和
潮霉素基因(引物为 ｈｐｔⅡ￣Ｆ 和 ｈｐｔⅡ￣Ｒꎬ 表 １)ꎬ
则潮霉素基因和 ＶｖＣＯＲ２７基因扩增均为阳性的植
株是成功转化植株ꎮ 当阳性植株成熟后收取 Ｔ２代
种子ꎬ 继续播种、 筛选获得 Ｔ３代转基因株系纯合
植株ꎮ
提取野生型和 ３个超表达 ＶｖＣＯＲ２７转基因拟
南芥株系新鲜叶片的总 ＲＮＡꎬ 用 ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ⅲ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎꎬ ＵＳＡ)将其反
转录成 ｃＤＮＡ(方法同 １􀆰 ２􀆰 ２)后ꎬ 以 Ａｃｔｉｎ 基因为
内参进行 ＲＴ￣ＰＣＲ扩增(引物为 ＶｖＣＯＲ２７ Ｆ￣ＲＴ 和
ＶｖＣＯＲ２７ Ｒ￣ＲＴꎬ 表 １)ꎬ 检测 Ｔ３转基因拟南芥株
系中 ＶｖＣＯＲ２７基因的表达水平ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ７　 转基因拟南芥植株的抗寒表型鉴定
将野生型和 ３个超表达 ＶｖＣＯＲ２７转基因拟南
芥株系的 Ｔ３种子置于 ４℃春化 ２ ｄ后ꎬ 播种在装有
泥炭土的塑料盆(口径 １０ ｃｍ)中ꎬ 每盆留苗 ７ 株ꎻ
２１ ｄ后将拟南芥植株置于低温光照培养箱中进行
梯度冷处理ꎬ 即: －１℃ ８ ｈ、 －３℃ ３ ｈ、 －５℃ ３ ｈ、
－７℃ ３ ｈ、 －９℃ ２ ｈꎻ 然后将拟南芥植株置于 ４°Ｃ
低温条件下避光放置 ８ ｈꎬ 再移至温室观察其生长
情况ꎬ 并统计存活率ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 ＶｖＣＯＲ２７的 ｃＤＮＡ克隆及同源比对分析
根据‘玫瑰香’葡萄转录组测序得到的 ＣＯＲ２７
序列片段设计特异引物ꎬ 通过同源克隆扩增出该基
因全长ꎮ 其序列与‘黑比诺’葡萄基因组上编号为
ＧＳＶＩＶＴ０１０３１７３４００１的编码区序列完全一致ꎻ 再
通过在 ＮＣＢＩ数据库中利用 ｂｌａｓｔｐ 进行同源比对ꎬ
发现其蛋白序列与 ＴｃＣＯＲ２７(ＸＰ＿ ００７０４２４３４􀆰１)
基因具有 ４０％的一致性ꎬ 故命名为 ＶｖＣＯＲ２７ꎮ 该
基因的 ｃＤＮＡ序列全长为 １０８２ ｂｐꎬ 其开放阅读框
(ＯＲＦꎬ 图 １)为 ９０９ ｂｐꎬ 编码 ３０２ 个氨基酸ꎮ 通
过对 ＧＳＶＩＶＴ０１０３１７３４００１的 ＤＮＡ序列分析发现ꎬ
ＶｖＣＯＲ２７由 ５个外显子(ｅｘｏｎ)和 ４ 个内含子( ｉｎ￣
ｔｒｏｎ)构成(图 １)ꎬ 其中第 １个内含子的序列最长ꎬ
mRNA 5
DNA 5
bp
Untranslated region(UTR) Coding sequence(CDS) Intron
3
3
120 159 5044 180 82 295 2199 116 128 159 173
图 １　 ＶｖＣＯＲ２７基因结构
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＶｖＣＯＲ２７
为 ５０４４ ｂｐꎮ Ｐｒｏｔｐａｒａｍ分析结果显示ꎬ ＶｖＣＯＲ２７
编码的蛋白质分子量为 ３３ ｋＤꎬ 理论 ｐＩ为 ６􀆰８ꎻ 氨
基酸组成上以丝氨酸 ( Ｓｅｒ ) 含量为最高ꎬ 达
１４􀆰 ２％ꎬ 其次为亮氨酸(Ｌｅｕ)和丙氨酸(Ａｌａ)ꎬ 分
别为 ８􀆰 ３％和 ７􀆰 ０％ꎻ 不稳定系数( ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘꎬ
ＩＩ)为 ５２􀆰 ２４ꎬ 表明其稳定性较差ꎻ 平均疏水性系数
(ｇｒａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙꎬ ＧＲＡＶＹ ) 为
－０􀆰 ７４７ꎬ 表明其为亲水性蛋白ꎮ 对 ＶｖＣＯＲ２７的氨
基酸序列进行的亚细胞定位分析 ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.
ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ / ＴａｒｇｅｔＰ / )表明ꎬ 未发现定位
到细胞器的功能元件ꎮ
利用推测的 ＶｖＣＯＲ２７ 氨基酸序列在 ＮＣＢＩ 数
据库中进行 ｂｌａｓｔｐ 搜索ꎬ 并从其序列比对结果中
挑选相似性较高的 １２ 条 ＣＯＲ２７ 蛋白序列ꎬ 进一
９４３　 第 ３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 范高韬等: 葡萄ＣＯＲ２７基因的克隆与抗寒功能研究
步与 ＶｖＣＯＲ２７ 进行同源比对和保守结构域分析
(图 ２)ꎮ 结果显示ꎬ １３条 ＣＯＲ２７蛋白共有 ３个结
构域ꎬ 其中第 １、 ２个结构域存在于所有分析成员
中ꎬ 而第 ３个结构域在 ＰｐＣＯＲ２７中缺失ꎻ 这 ３个
保守的结构域可能与 ＣＯＲ２７ 的功能密切相关ꎮ 利
用 ＭＥＧＡ ５􀆰１ 软件对 １３ 条 ＣＯＲ２７ 蛋白序列进行
系统发育分析ꎬ 发现 ＣＯＲ２７ 蛋白可被分为 ２ 大类
(图 ３)ꎬ 其中 ＰｍＣＯＲ２７、 ＶｖＣＯＲ２７、 ＣｓＣＯＲ２７、
ＣｃＣＯＲ２７和 ＴｃＣＯＲ２７聚为一枝ꎬ 其余 ＣＯＲ２７ 蛋
白聚为一枝ꎻ ＶｖＣＯＲ２７与梅的 ＰｍＣＯＲ２７(Ｐｒｕｎｕｓ
ｍｕｍｅ)同源性最高ꎮ
２􀆰 ２　 冷处理下ＶｖＣＯＲ２７基因的表达分析
‘玫瑰香’葡萄 ＶｖＣＯＲ２７ 基因在 ４℃低温下不
同冷处理时间点的定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 分析(图 ４)表明ꎬ
冷处理早期(０ ~ ８ ｈ)ꎬ ＶｖＣＯＲ２７基因的表达量并
没有发生明显变化ꎻ 至冷处理 ２４ ｈ和 ４８ ｈ时ꎬ 其
Motif Location
VvCOR27
TcCOR27
NnCOR27
PmCOR27
MdCOR27
CsCOR27
FvCOR27
PtCOR27
AtCOR27
PpCOR27
CcCOR27
RcCOR27
PdCOR27
Combined
Name p-value
2 82e-60.
1 88e-51.
9 63e-64.
4 09e-57.
1 20e-76.
4 96e-51.
2 35e-75.
5 98e-65.
1 90e-47.
1.13e-59
6.85e-44
2.98e-67
2.31e-53
0 50 100 150 200 250 300
Motif 1
Motif 1
Motif 2
Motif 2
Motif 3
Motif 3
4
4
4
3
3
3
2
2
2
1
1
1
0
0
0
2 0e-199.
13 sites
2 1e-114.
13 sites
3 8e-079.
11 sites
bi
ts
bi
ts
bi
ts
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
ＴｃＣＯＲ２７: Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ (ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.: ＸＰ＿ ００７０４２４３４)ꎻ ＰｍＣＯＲ２７: Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ (ＸＰ＿
００８２３６５８６)ꎻ ＮｎＣＯＲ２７: Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ ( ＸＰ ＿ ０１０２６９８６５ )ꎻ ＭｄＣＯＲ２７: Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ ( ＸＰ ＿
００８３７８０４５)ꎻ ＣｓＣＯＲ２７: Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ (ＸＰ＿ ００６４８７１０９)ꎻ ＦｖＣＯＲ２７: Ｆｒａｇａｒｉａ ｖｅｓｃａ ｓｕｂｓｐ. ｖｅｓｃａ (ＸＰ＿
００４２９１１０４)ꎻ ＰｔＣＯＲ２７: Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ ( ＸＰ ＿ ００６３７４９３６ )ꎻ ＡｔＣＯＲ２７: Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ( ＮＰ ＿
８５１１２１)ꎻ ＰｐＣＯＲ２７: Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ ( ＸＰ＿ ００７２２７５４７)ꎻ ＣｃＣＯＲ２７: Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ (ＣＤＯ９７１８０)ꎻ Ｒｃ￣
ＣＯＲ２７: Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ (ＸＰ＿ ００２５１０２１２)ꎻ ＰｄＣＯＲ２７: Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ (ＸＰ＿ ００８８０５２７４) . Ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
图 ２　 不同植物 ＣＯＲ２７蛋白氨基酸序列的保守结构域分析
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＯＲ２７ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｉｒｔｅｅｎ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
０５３ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
VvCOR27
TcCOR27
NnCOR27
PmCOR27
MdCOR27
CsCOR27
FvCOR27
PtCOR27
AtCOR27
PpCOR27
CcCOR27
RcCOR27
PdCOR27
51
45
100
82 66
31
95
50
81
61
0 1.
图 ３　 不同植物 ＣＯＲ２７ ＮＪ进化树分析
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ
ＣＯＲ２７ ｆｒｏｍ ｔｈｉｒｔｅｅｎ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 2 4 8 24 48
!"#$ ( )h
Treatment time
%
&

(
)
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
图 ４　 ｑＲＴ￣ＰＣＲ分析低温诱导下 ＶｖＣＯＲ２７的表达
Ｆｉｇ􀆰 ４　 ｑＲＴ￣ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ＶｖＣＯＲ２７ ｕｎｄｅｒ ｃｏｌｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
相对表达量分别上调约 ５０ 倍和 １４０ 倍ꎬ 说明 Ｖｖ￣
ＣＯＲ２７能够响应冷胁迫ꎬ 且其表达受到其他冷胁
迫相关基因的诱导ꎬ 即在冷处理后期才开始大量
表达ꎮ
２􀆰 ３　 ＶｖＣＯＲ２７启动子调控元件分析
基于 ＶｖＣＯＲ２７在冷胁迫(４℃低温)下的表达
量变化ꎬ 和‘黑比诺’葡萄基因组上ＧＳＶＩＶＴ０１０３１７
３４００１ 序列翻译起始位点 ＡＴＧ 前面的一段
１２００ ｂｐ序列ꎬ 并结合 ＡｔＣＯＲ２７(Ａｔ５ｇ４２９００)的
启动子序列分析结果[２１]ꎬ 我们对 ＶｖＣＯＲ２７ 的启
动子序列进行了分析(图 ５)ꎮ 就 ＥＥ、 ＥＥＬ(Ｅｖｅ￣
ｎｉｎｇ Ｅｌｅｍｅｎｔ￣ｌｉｋｅ)、 Ｇ￣ｂｏｘ 和 ＡＢＲＥＬ (ＡＢＡ Ｒｅ￣
ｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ￣ｌｉｋｅ)４ 种基序而言ꎬ ＡｔＣＯＲ２７ 和
ＶｖＣＯＲ２７ 的启动子序列间存在明显差异ꎮ Ａｔ￣
ＣＯＲ２７启动子区含有 ２ 个 ＥＥ、 ２ 个 ＥＥＬ 和 ２ 个
Ｇ￣ｂｏｘ元件ꎬ 而 ＶｖＣＯＲ２７启动子区均只含有一个
ＥＥ、 ＥＥＬ 和 Ｇ￣ｂｏｘ 元件ꎻ 与 ＡｔＣＯＲ２７ 启动子序
列相比ꎬ ＶｖＣＯＲ２７启动子区 ＥＥＬ元件的位置更靠
近翻译起始位点ꎮ ＡｔＣＯＲ２７ 和 ＶｖＣＯＲ２７ 在启动
子区的序列差别可能是其响应冷胁迫表达模式不同
的原因ꎬ 其中拟南芥 ＡｔＣＯＲ２７ 对冷胁迫的响应较
早ꎬ ４℃低温处理 １ ｈ 时其表达量迅速上调并随处
理时间的延长而持续增加[２１]ꎮ
２􀆰 ４　 超表达ＶｖＣＯＲ２７ 转基因拟南芥株系的抗寒
性鉴定
为了进一步验证 ＶｖＣＯＲ２７ 的基因功能ꎬ 我们
构建了 ３５Ｓ启动子驱动的 ＶｖＣＯＲ２７ 超表达载体ꎬ
并采用浸花法将其导入拟南芥ꎻ 以野生型和 Ｔ１代
转基因拟南芥株系的基因组 ＤＮＡ 为模版分别对
ＶｖＣＯＲ２７ 和潮霉素抗性基因进行扩增(图 ６: Ａꎬ
Ｂ)ꎬ 结果表明所选择的 ３ 个株系(图 ６: Ｌｉｎｅ １ ~
３)均含有转基因序列ꎮ 以拟南芥 ＡＣＴ２ 为内参基
因ꎬ 对 Ｌｉｎｅ １ ~ ３的 Ｔ３代植株 ＶｖＣＯＲ２７基因表达
水平的 ＲＴ￣ＰＣＲ 分析表明 (图 ６: Ｃꎬ Ｄ)ꎬ Ｖｖ￣
ＣＯＲ２７在 ３个株系的 Ｔ３代植株中表达正常ꎮ
　 　 将野生型和 Ｔ３代转基因拟南芥株系 Ｌｉｎｅ １ ~ ３
的纯合植株进行梯度低温处理并统计存活率(图
７)ꎬ 发现野生型拟南芥叶片均出现水渍状伤害ꎬ
而超表达 ＶｖＣＯＲ２７转基因拟南芥株系受伤害程度
小于野生型ꎻ 结束低温胁迫恢复正常生长后ꎬ 野生
-1200 -1069 -758 -377 -254 -162 -1
AtCOR27
VvCOR27
AAAATATCT AATATCT CACGTG ACGTG
EE EEL G-box ABREL
图 ５　 ＡｔＣＯＲ２７和 ＶｖＣＯＲ２７启动子区的基序比较分析
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＡｔＣＯＲ２７ ａｎｄ ＶｖＣＯＲ２７
１５３　 第 ３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 范高韬等: 葡萄ＣＯＲ２７基因的克隆与抗寒功能研究
WT WTLine 1 Line 1Line 2 Line 2Line 3 Line 3
A
B
C
D
ＷＴ: 野生型拟南芥ꎻ Ｌｉｎｅ １~３: 超表达 ＶｖＣＯＲ２７转基因拟南芥株系ꎮ Ａ: ＶｖＣＯＲ２７插入片段在野生型和 Ｔ１
代转基因拟南芥株系 ＤＮＡ中的扩增ꎻ Ｂ: 潮霉素 Ｂ抗性基因 ｈｐｔ Ⅱ在野生型和 Ｔ１代转基因拟南芥株系 ＤＮＡ
中的扩增ꎻ Ｃ: ＶｖＣＯＲ２７在野生型和 Ｔ３代转基因拟南芥株系中的表达水平检测ꎻ Ｄ: 拟南芥 ＡＣＴ２ 作为内参
基因ꎮ
ＷＴ: Ｗｉｌｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｙｐｅꎻ Ｌｉｎｅ １ － ３: Ｏｖｅｒ￣ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ＶｖＣＯＲ２７ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｌａｎｔ. Ａ: Ａｍｐｌｉｆｉ￣
ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＶｖＣＯＲ２７ ｉｎ ｗｉｌｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｏｖｅｒ￣ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｌａｎｔꎻ Ｂ: Ａｍｐｌｉｆｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｐｔ Ⅱｇｅｎｅ ｉｎ ｗｉｌｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｏｖｅｒ￣ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐ￣
ｓｉｓ ｐｌａｎｔꎻ Ｃ: Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＶｖＣＯＲ２７ ｉｎ ｗｉｌｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｏｖｅｒ￣ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
Ｔ３ ｐｌａｎｔꎻ Ｄ: ＡＣＴ２ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ.
图 ６　 超表达ＶｖＣＯＲ２７拟南芥株系的 ＰＣＲ扩增鉴定及转基因表达检测
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ＶｖＣＯＲ２７ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｌａｎｔ
A
B
WT Line 1 Line 2 Line 3
C
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
WT Line 1 Line 2 Line 3
!
"
#
(%
)
Su
rv
iv
al
ra
te
Ａ: 对照ꎻ Ｂ: 冷处理ꎻ Ｃ: 成活率ꎮ
Ａ: ＣＫꎻ Ｂ: Ｃｏｌｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔꎻ Ｃ: Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ.
图 ７　 转基因拟南芥植株的抗寒性鉴定
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｃｏｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｌａｎｔｓ
型拟南芥的存活率为 ４３􀆰 ８８％ꎬ 而超表达 Ｖｖ￣
ＣＯＲ２７转基因拟南芥株系(Ｌｉｎｅ １~ ３)的存活率显
著高于野生型ꎬ 分别为 ７９􀆰５５％、 ８２􀆰８６％和 ７８􀆰２５％
(图 ７: Ｃ)ꎮ 这说明超表达 ＶｖＣＯＲ２７ 增强了拟南
芥的抗寒能力ꎬ 即 ＶｖＣＯＲ２７参与了植株对冷胁迫
的应答并作为正调控因子增强了植株对冷胁迫的耐
２５３ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
受能力ꎮ
３　 讨论
植物对低温的响应是一个复杂的过程ꎬ 包括低
温感受和早期信号转导、 基因表达水平变化、 蛋白
质修饰和代谢、 初生和次生代谢产物的变化、 植物
细胞结构的改变等[９ꎬ１０]ꎮ 从目前报道的拟南芥转录
组水平的分析来看ꎬ 冷胁迫下至少有上千种基因的
表达水平发生了变化ꎬ 并且其表达谱随着冷处理时
间的延长而持续变化[２２]ꎮ 葡萄响应冷胁迫的转录
组数据分析也得到了类似的结果[２３ꎬ２４]ꎬ 但这些基
因是如何参与植物响应冷胁迫的过程我们仍知之甚
少ꎬ 因此冷胁迫相关基因的克隆和功能分析对解析
植物应对低温的反应机制具有重要作用ꎮ
ＣＯＲ２７基因是根据其蛋白质分子量及对冷胁
迫的响应而命名的[２１]ꎮ 本实验克隆的 ＶｖＣＯＲ２７
基因编码 ３０２ 个氨基酸ꎬ 其蛋白预测分子量
(３３ ｋＤ)大于 ＡｔＣＯＲ２７ꎬ 但它和已报道或者推测
的 ＣＯＲ２７ 基因成员具有相同的保守结构域 (图
２)ꎮ 在这 ３个保守结构域序列在 ＮＣＢＩ等数据库中
进行的检索结果中ꎬ 未找到相关的注释ꎬ 我们初步
预测这 ３ 个保守结构域和 ＣＯＲ２７ 的功能密切相
关ꎬ 但需进一步的实验来验证ꎮ 启动子区域顺式作
用元件的分析结果表明ꎬ ＶｖＣＯＲ２７ 与 ＡｔＣＯＲ２７
启动子序列之间存在部分共线性关系(图 ５)ꎻ 与
ＡｔＣＯＲ２７启动子序列相比ꎬ ＶｖＣＯＲ２７ 启动子区均
只含有一个 ＥＥ、 ＥＥＬ和 Ｇ￣ｂｏｘ元件ꎬ 且其 ＥＥＬ元
件的位置更靠近翻译起始位点ꎬ 两者在启动子区的
序列差别可能是拟南芥和葡萄对冷胁迫响应速度不
同的原因ꎮ 作为植物低温响应过程中重要的转录因
子ꎬ ＣＢＦ 通过结合下游基因启动子 ＣＲＴ / ＤＲＥ 作
用元件来调控其表达水平[９ꎬ１０]ꎮ 而对 ＶｖＣＯＲ２７ 启
动子区域调控元件的分析发现ꎬ 其启动子区不存在
ＣＢＦ 基因可以结合的 ＣＲＴ / ＤＲＥ 作用元件ꎬ 表明
ＶｖＣＯＲ２７在冷胁迫下的表达不受 ＣＢＦ基因的直接
调控ꎮ 此外ꎬ 对 ＶｖＣＯＲ２７启动子区域反式作用因
子的鉴定和顺式作用元件的缺失、 增加以及相应的
转录活性测定ꎬ 有助于解释其在冷胁迫下的基因表
达模式成因ꎮ
‘玫瑰香’属于欧亚种葡萄ꎬ 果实香味浓郁ꎬ
可鲜食、 制汁和酿酒ꎬ 但其枝条和休眠芽在冬季温
度低于－１５℃时将会发生严重冻害ꎮ 山葡萄是葡萄
属中最抗寒的品种ꎬ 可抵御冬季－４０℃低温而不影
响翌年的丰产[１－６]ꎬ 因此研究山葡萄的高抗寒性机
理将为进一步定向改良优质、 低抗寒性的欧亚种葡
萄提供重要理论依据ꎮ 作为响应冷胁迫且能够增加
植株抗寒性的 ＶｖＣＯＲ２７基因ꎬ 在山葡萄中的编码
序列特征和表达模式还未见报道ꎬ 故克隆山葡萄的
ＣＯＲ２７基因并检测其在冷胁迫下的响应模式ꎬ 比
较其编码区和启动子区与 ＶｖＣＯＲ２７之间的序列差
别ꎬ 也将为揭示山葡萄的高抗寒机理提供支持ꎮ
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Ｃ￣ｒｅｐｅａｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４ ( ＶｖＣＢＦ４) ｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣
ｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｗｉｎｅ
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ｇｉｎｅｅｒ ｓａｌｔꎬ ｃｏｌｄꎬ ａｎｄ ｄｒｏｕｇｈｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｃｒｏｐｓ
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３５３　 第 ３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 范高韬等: 葡萄ＣＯＲ２７基因的克隆与抗寒功能研究
ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ: ａ ｋｅｙ ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ ｔｏ
ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ[Ｊ] . Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏ￣
ｔｅｃｈｎｏｌꎬ ２０１１ꎬ ３１(２): １８６－９２.
[１１] 　 Ｘｉａｏ Ｈꎬ Ｓｉｄｄｉｑｕａ Ｍꎬ Ｂｒａｙｂｒｏｏｋ Ｓꎬ Ｎａｓｓｕｔｈ Ａ.
Ｔｈｒｅｅ ｇｒａｐｅ ＣＢＦ / ＤＲＥＢ１ ｇｅｎｅｓ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｌｏｗ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅꎬ ｄｒｏｕｇｈｔ ａｎｄ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎꎬ ２００６ꎬ ２９(７): １４１０－１４２１.
[１２] 　 Ｘｉａｏ Ｈꎬ Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ ＥＡꎬ Ｓｉｄｄｉｑｕａ ＭＫꎬ Ｃｒａｍｅｒ ＧＲꎬ
Ｎａｓｓｕｔｈ Ａ. ＣＢＦ４ ｉｓ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＣＢＦ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ａｎｄ Ｖｉｔｉｓ
ｒｉｐａｒｉａ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎꎬ ２００８ꎬ ３１(１): １－
１０.
[１３] 　 Ｌｉ ＪＴꎬ Ｗａｎｇ ＬＮꎬ Ｚｈｕ Ｗꎬ Ｗａｎｇ Ｎꎬ Ｘｉｎ ＨＰꎬ Ｌｉ ＳＨ.
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ＶｖＩＣＥ１ ｇｅｎｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ
‘Ｍｕｓｃａｔ Ｈａｍｂｕｒｇ’ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ
ｔｈｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓｅｓ [ Ｊ] . Ｓｃｉ Ｈｏｒｔｉｃꎬ
２０１４ａꎬ １６５(２２): ２６６－２７３.
[１４] 　 Ｌｉ ＪＴꎬ Ｗａｎｇ Ｎꎬ Ｗａｎｇ ＬＮꎬ Ｘｉｎ ＨＰꎬ Ｌｉ ＳＨ. Ｍｏｌｅｃｕ￣
ｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＯＳ１ ｇｅｎｅ
ｆｒｏｍ ‘Ｍｕｓｃａｔ Ｈａｍｂｕｒｇ’ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ[Ｊ] . Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ
Ｈｏｒｔｉｃ Ｓｃｉꎬ ２０１４ｂꎬ １３９(１): ５４－６２.
[１５] 　 Ｌｉｕ ＬＹꎬ Ｌｉ Ｈ. Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ａｍｕｒ ｇｒａｐｅꎬ
Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ Ｒｕｐｒ. [Ｊ] . Ｃａｎ Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉꎬ ２０１３ꎬ
９３(４): ５６５－５７５.
[１６] 　 Ｄｏｎｇ Ｃꎬ Ｔａｏ ＪＭꎬ Ｚｈａｎｇ Ｍꎬ Ｑｉｎ Ｙꎬ Ｙｕ ＺＹꎬ Ｗａｎｇ
ＢＬꎬ Ｃａｉ ＢＨꎬ Ｚｈａｎｇ Ｚ. Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＢＦ２ ｉｎ Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ ｗｉｔｈ
ｓｔｒｅｓｓ[Ｊ] . Ａｇｒ Ｓｃｉꎬ ２０１３ａꎬ ４(９): ４６６－４７２.
[１７] 　 Ｄｏｎｇ Ｃꎬ Ｚｈａｎｇ Ｍꎬ Ｙｕ ＺＹꎬ Ｒｅｎ ＪＰꎬ Ｑｉｎ Ｙꎬ Ｗａｎｇ
ＢＬꎬ Ｘｉａｏ ＬＺꎬ Ｚｈａｎｇ Ｚꎬ Ｔａｏ ＪＭ. Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＢＦ４ ｆｒｏｍ Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ ａｓ￣
ｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔｒｅｓｓ[ Ｊ] . Ａｇｒ Ｓｃｉꎬ ２０１３ｂꎬ ４(５):
２２４－２２９.
[１８] 　 Ｄｏｎｇ Ｃꎬ Ｚｈａｎｇ Ｚꎬ Ｑｉｎ Ｙꎬ Ｒｅｎ ＪＰꎬ Ｈｕａｎｇ ＪＦꎬ
Ｗａｎｇ ＢＬꎬ Ｌｕ ＨＬꎬ Ｃａｉ ＢＨꎬ Ｔａｏ ＪＭ. ＶａＣＢＦ１ ｆｒｏｍ
Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｌｄ ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｏｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔꎬ ２０１３ｃꎬ
３５(１０): ２９７５－２９８４.
[１９] 　 Ｄｏｎｇ Ｃꎬ Ｚｈａｎｇ Ｚꎬ Ｒｅｎ ＪＰꎬ Ｑｉｎ Ｙꎬ Ｈｕａｎｇ ＪＦꎬ
Ｗａｎｇ Ｙꎬ Ｃａｉ ＢＨꎬ Ｗａｎｇ ＢＬꎬ Ｔａｏ ＪＭ. Ｓｔｒｅｓｓ￣ｒｅ￣
ｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ ＩＣＥ１ ｆｒｏｍ Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ
ｃｏｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈꎬ
２０１３ｄꎬ ７１(２０１３): ２１２－２１７.
[２０] 　 Ｌｉ ＪＴꎬ Ｗａｎｇ Ｎꎬ Ｘｉｎ ＨＰꎬ Ｌｉ ＳＨ. Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ＶａＣＢＦ４ꎬ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎ￣
ｓｉｓꎬ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃｏｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ ｉｎ￣
ｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｄｒｏｕｇｈｔ ａｎｄ ｓａｌｉｎｉｔｙ ｉｎ Ａｒａｂｉ￣
ｄｏｐｓｉｓ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐꎬ ２０１３ꎬ ３１ ( ６):
１５１８－１５２８.
[２１] 　 Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ ＭＤꎬ Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ ＭＦ. Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｃｉｒｃａ￣
ｄｉａｎ ｅｖｅｎｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｃｏｌｄ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｊꎬ ２００９ꎬ ６０
(２): ３２８－３３９.
[２２] 　 Ｋｉｌｉａｎ Ｊꎬ Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｄꎬ Ｈｏｒａｋ Ｊꎬ Ｗａｎｋｅ Ｄꎬ Ｗｅｉｎｌ
Ｓꎬ Ｂａｔｉｓｔｉｃ Ｏꎬ Ｄ′Ａｎｇｅｌｏ Ｃꎬ Ｂｏｒｎｂｅｒｇ￣Ｂａｕｅｒ Ｅꎬ
Ｋｕｄｌａ Ｊꎬ Ｈａｒｔｅｒ Ｋ. Ｔｈｅ ＡｔＧｅｎＥｘｐｒｅｓｓ ｇｌｏｂａｌ ｓｔｒｅｓｓ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｓｅｔ: ｐｒｏｔｏｃｏｌｓꎬ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｍｏｄｅｌ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＵＶ￣Ｂ ｌｉｇｈｔꎬ ｄｒｏｕｇｈｔ ａｎｄ
ｃｏｌｄ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｊꎬ ２００７ꎬ ５０(２):
３４７－３６３.
[２３] 　 Ｘｉｎ ＨＰꎬ Ｚｈｕ Ｗꎬ Ｗａｎｇ ＬＮꎬ Ｘｉａｎｇ Ｙꎬ Ｆａｎｇ ＬＣꎬ Ｌｉ
ＪＴꎬ Ｓｕｎ ＸＭꎬ Ｗａｎｇ Ｎꎬ Ｌｏｎｄｏ Ｊꎬ Ｌｉ ＳＨ. Ｇｅｎｏｍｅ
ｗｉｄｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎ￣
ｓｉｓ ａｎｄ Ｖ. ｖｉｎｉｆｅｒａ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃｏｌｄ ｓｔｒｅｓｓ[Ｊ] .
ＰＬｏＳ Ｏｎｅꎬ ２０１３ꎬ ８(３): ｅ５８７４０.
[２４] 　 Ｘｕ Ｗꎬ Ｌｉ Ｒꎬ Ｚｈａｎｇ Ｎꎬ Ｍａ Ｆꎬ Ｊｉａｏ Ｙꎬ Ｗａｎｇ Ｚ.
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓꎬ ａｎ ｅｘ￣
ｔｒｅｍｅｌｙ ｃｏｌｄ￣ｔｏｌｅｒａｎｔ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｗｉｌｄ Ｖｉｔｉｓ ｓｐｅｃｉｅｓꎬ
ｒｅｖｅａｌｓ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｅｖｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ￣
ｌｙ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｔｏ ｃｏｌｄ ｓｔｒｅｓｓ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌꎬ
２０１４ꎬ ８６(４－５): ５２７－５４１.
(责任编辑: 刘艳玲)
４５３ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷