全 文 ：植物科学学报　 ２０１５ꎬ ３３(４): ５６４~５７１
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５－０８３７􀆰 ２０１５􀆰 ４０５６４
快速筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因的方法
黄 洁ꎬ 李鑫波ꎬ 严海龙ꎬ 陈 丹ꎬ 孙蒙祥ꎬ 彭雄波∗
(武汉大学生命科学学院ꎬ 杂交水稻国家重点实验室ꎬ 武汉 ４３００７２)
摘　 要: 阐明拟南芥受精和早期胚胎发生过程对理解被子植物生殖发育有着重要的指导意义ꎬ 而利用正向遗传
学方法研究拟南芥突变体的表型及其分子机理是探究植物基因功能最常用的一种方法ꎮ 基于常规的插入突变
(包括 Ｔ￣ＤＮＡ和转座子)、 化学诱变(如 ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅꎬ ＥＭＳ)和高能射线方法构建的突变体库中假
阳性突变体多ꎬ 难以高效筛选到受精和早期胚胎发生相关基因的突变体ꎮ 为解决这一难题ꎬ 本研究建立了一
种构建 Ｔ￣ＤＮＡ插入突变体文库的新方法ꎮ 即在载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２的 Ｔ￣ＤＮＡ元件上增加花粉特异荧光标记基因
(ｐＬＡＴ５２∷ＥＧＦＰ)ꎬ 并遗传转化具有四分体花粉的 Ｃｏｌｕｍｂｉａ野生型拟南芥突变体 ｑｒｔ１￣２ꎻ 对获得的突变体库可
利用花粉荧光快速排除假阳性突变体ꎬ 并采用反向 ＰＣＲ ( ｉｎｖｅｒｓｅ￣ＰＣＲ)扩增技术确定突变位点ꎮ 此方法在筛选
拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因突变体上的成功应用表明ꎬ 其是一种效率高、 针对性强、 操作相对快捷方
便的拟南芥突变体筛选方法ꎮ
关键词: 拟南芥ꎻ Ｔ￣ＤＮＡꎻ 受精ꎻ 早期胚胎发生ꎻ 突变体筛选
中图分类号: ９４４􀆰４　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１５)０４￣０５６４￣０８
　 　 　 收稿日期: ２０１５￣０２￣１１ꎬ 退修日期: ２０１５￣０３￣１３ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金面上项目(３１０７０２８０)ꎮ
　 作者简介: 黄洁(１９９０－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为植物发育生物学(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｈｕａｎｇｊｉｅ＠ｗｈｕ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｂｏｂｏｐｘ＠ｗｈｕ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ)ꎮ
Ａ Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ＨＵＡＮＧ Ｊｉｅꎬ ＬＩ Ｘｉｎ￣Ｂｏꎬ ＹＡＮ Ｈａｉ￣Ｌｏｎｇꎬ ＣＨＥＮ Ｄａｎꎬ ＳＵＮ Ｍｅｎｇ￣Ｘｉａｎｇꎬ ＰＥＮＧ Ｘｉｏｎｇ￣Ｂｏ∗
(Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄ Ｒｉｃｅꎬ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７２)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｃｅｎｔｒａｌ ｉｓｓｕｅ ｆｏｒ
ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｓｅｘｕａｌ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ. Ｔｈｅ ｆｏｒｗａｒｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｅ􀆰 ｇ.
ｍｕｔａｔｉｏｎꎬ ｉｓ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ.
Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｉｎ ｍｕｔａｎｔ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｅｇｕｌａｒ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｍｅｔｈｏｄｓꎬ ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎꎬ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎꎬ ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ￣ｅｎｅｒｇｙ
ｒａｙｓꎬ ｒｅｔａｒｄ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ. Ｔｏ ｓｏｌｖｅ
ｔｈｉｓ ｐｒｏｂｌｅｍꎬ ｗｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｏｃｋ. Ｗｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａ ｐｏｌｌｅｎ￣
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍａｒｋｅｒ ( ｐＬＡＴ５２∷ＥＧＦＰ ) ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｔ￣ＤＮＡ ｅｌｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ
ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ꎬ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｑｒｔ１￣２ ｍｕｔａｎｔꎬ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ
ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｒｅｍａｉｎｅｄ ｆｕｓｅｄ ａｎｄ ｐｏｌｌｅｎ ｇｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｒｅｌｅａｓｅｄ ａｓ ｔｅｔｒａｄｓꎬ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ
Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｌｉｂｒａｒｙ. Ｔｈｉｓ ａｌｌｏｗｅｄ ｕｓ ｔｏ ｄｉｓｃａｒｄ ｔｈｅ ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｂｙ
ｓｉｍｐｌｙ ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｐｏｌｌｅｎ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｗｅ ｃｏｕｌｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｅｄ
ｇｅｎｅ ｌｏｃｕｓ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｖｅｒｓｅ￣ＰＣＲ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ
ｈｅｌｐ ｓｃｒｅｅｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｒａｐｉｄｌｙ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ
ｔｈｅ ｍｕｔａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｌｏｃｕｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓꎻ Ｔ￣ＤＮＡꎻ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎꎻ Ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓꎻ Ｍｕｔａｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
　 　 拟南芥 (Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ)是十字花科
(Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ)的模式植物ꎬ 具有生长周期短、 易于
遗传转化、 基因组小、 重复序列少、 生物信息学资
源丰富等优点[１]ꎬ 也是第一个基因组被完整测序
的高等植物ꎬ 其基因组物理图谱已于 ２０００ 年 １２
月公布[２]ꎬ 因此对拟南芥的分子生物学研究对于
阐明植物的生长和发育过程具有重大意义[３]ꎮ 通
过分析拟南芥突变体的表型性状定位到控制这一性
状的基因ꎬ 并对该基因表达的蛋白进行功能分析ꎬ
从而解析其在植物体内的具体信号调控途径ꎬ 是目
前正向遗传学研究中最常用、 最有效的手段ꎮ
构建突变体库常采用物理诱变(射线)、 化学
诱变如 ＥＭＳ(Ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎａｔｅ) [４－６]和传统
意义上的 Ｔ￣ＤＮＡ 插入突变[７－９] 等ꎮ 物理诱变和
ＥＭＳ化学诱变都具有操作简单、 突变频率高、 多
效性等优点[１０]ꎮ 但物理辐射突变为非特异性ꎬ 存
在突变方向难以掌握、 突变体后代鉴定的工作量大
等缺点ꎻ ＥＭＳ化学诱变的优点虽具有突变专一性ꎬ
但会对植株造成损伤且确定突变位点比较困难ꎬ 同
时用此方法筛选突变体要求诱变群体样本容量大ꎬ
也导致突变体表型分析与突变位点确认等检测工作
量大大增加ꎬ 十分耗时费力ꎮ 传统的 Ｔ￣ＤＮＡ 插入
突变因易于进行正向和反向遗传学研究受到重
视[１１]ꎬ 但不能高效定向筛选受精及早期胚胎发
生[１２]相关突变体ꎮ 在总结前人筛选突变体经验的
基础上ꎬ 我们经过长时间的摸索与比较建立了快速
筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因突变体的
方法ꎮ 即在载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ 的 Ｔ￣ＤＮＡ 元件上
增加花粉特异启动子驱动绿色荧光蛋白(ｅｎｈａｎｃｅｄ
ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ＥＧＦＰ ) 表达元件
(ｐＬＡＴ５２∷ＥＧＦＰ)ꎬ 并转化具有四分体花粉的 Ｃｏ￣
ｌｕｍｂｉａ野生型拟南芥突变体 ｑｒｔ１￣２ (ＣＳ８８４６) [１３]ꎬ
构建适合筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因
的 Ｔ￣ＤＮＡ插入突变体文库ꎮ 此方法相较于物理诱
变、 ＥＭＳ化学诱变和传统的 Ｔ￣ＤＮＡ 插入突变方法
更省时、 高效ꎬ 且可以快速鉴定 Ｔ￣ＤＮＡ插入位点ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料的种植与培养
Ｔ￣ＤＮＡ突变体文库筛选的背景材料是拟南芥
突变体 ｑｒｔ１￣２ꎮ 将 ｑｒｔ１￣２的种子放入消毒液(次氯
酸钠 ∶水 ＝ ２ ∶ １ꎬ 每 １ ｍＬ 消毒液含 １０ μＬ １０％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ￣１００)中浸泡 １５ ｍｉｎꎬ 再以无菌水冲洗 ４
次ꎬ 铺于 １ / ２ ＭＳ 固体培养基[１４]上ꎬ 并置于拟南
芥恒温培养箱中培养ꎬ 约 １ 周后移苗至温室栽培ꎮ
栽培基质为营养土 ∶蛭石 ＝ ３ ∶１ꎻ 浇灌营养液(配
方详见附录)至浸透ꎻ 光照周期为 １６ ｈ 光照 / ８ ｈ
黑暗ꎬ 照明光源为日光灯ꎻ 温度 ２２℃ꎮ 在拟南芥
生长过程中ꎬ 应及时喷洒农药除虫和浇灌营养液ꎬ
并剪除侧枝以保证主枝的良好生长ꎮ 同时ꎬ 根据需
要选取生长旺盛的拟南芥营养器官或生殖器官进行
实验ꎮ
１􀆰 ２　 植株的转化
构建拟南芥 Ｔ￣ＤＮＡ 突变体文库: 在双元载体
ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２的插入元件上增加花粉特异荧光筛
选标记基因(ｐＬＡＴ５２∷ＥＧＦＰ)ꎬ 并利用农杆菌菌株
ＧＶ３１０１进行转化ꎻ 采用拟南芥浸花法[１５]将已开
花 １ ~ ２ ｄ的拟南芥突变体 ｑｒｔ１￣２的花序浸入农杆
菌转化菌液(含 ５％蔗糖、 ０􀆰０２％ ~ ０􀆰０５％ ＳｉｌｗｅｔＬ￣
７７)中ꎬ 停留 ３０ ｓ取出ꎬ 加盖保湿过夜ꎻ 第二天移
除盖子后继续栽植培养ꎬ 待转基因植株荚果充分成
熟后收获 Ｔ０代种子ꎮ
１􀆰 ３　 突变体的筛选和鉴定
突变体的筛选与鉴定过程详见图 １ꎮ 将 Ｔ０代转
基因种子消毒后均匀铺于 １ / ２ ＭＳ 潮霉素(浓度为
５０ ｍｇ / Ｌ)抗性培养基上ꎬ ４℃避光培养 ２ ｄꎻ 然后
转移到温室培养 ７~１０ ｄꎬ 再选取出现绿色真叶的
Ｔ１代阳性拟南芥突变体幼苗移栽到蛭石基质中ꎻ 当
阳性植株开花时用荧光显微镜(型号为 ＦＶ１０００)对
花粉进行荧光筛选ꎬ 并保留四分体花粉中仅有 ２个
具 ＧＦＰ荧光花粉粒的植株ꎬ 待其成熟时解剖角果
分析种子的败育情况ꎮ 针对有种子败育表型的 Ｔ１
代杂合突变体植株(部分败育ꎬ 自交结实)ꎬ 自交
并收取 Ｔ１代种子后ꎬ 均匀铺于 １ / ２ ＭＳ潮霉素抗性
培养基上筛选ꎬ 开花时通过观察花粉荧光判断 Ｔ２
代转基因植株是纯合子还是杂合子ꎻ 针对没有产生
种子败育表型的 Ｔ１代植株ꎬ 自交后收取种子直接
播种于蛭石基质中ꎬ 开花时通过观察花粉荧光判断
Ｔ２代植株是否为纯合子ꎮ 若 Ｔ２代植株全部为杂合
子ꎬ自交并进行Ｔ３代突变体植株的筛选ꎬ判断在
５６５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 黄 洁等: 快速筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因的方法
!"#$%&()*+
,-./01，3456
+78)*+
9:;<=>?@ABC( )!"HYG
D.E,-./01
FGHI JKGHI
9L=>，MN EO7PQR
S#$%&()*+
FGHI
D.E,-./01
9:;<=>?T=UVWX
9L=>，MN
YFGHI
Z - [\]^_ X`a)*+bT DNA qrt1-2
图 １　 拟南芥转基因突变体的筛选步骤
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｓｔｅｐｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃ ｍｕｔａｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ
纯合突变的情况下能否出现败育表型(纯合突变表
型可能为种子不萌发或幼苗期死亡)ꎮ
１􀆰 ４　 Ｔ￣ＤＮＡ插入位点的确定
采用反向 ＰＣＲ扩增技术确定 Ｔ￣ＤＮＡ的插入位
点: (１)采用 ＣＴＡＢ法提取拟南芥突变体植株新鲜
叶片(４０ ｍｇ)的基因组 ＤＮＡꎬ 并溶于 １００ μＬ 双蒸
水中ꎻ (２)采用单酶切基因组 ＤＮＡ(图 ２: Ａ)ꎮ 内
切酶常常用 ＥｃｏＲⅠ和 ＨｉｎｄⅢ(ＮＥＢ 公司)ꎬ 也可
选用 ＳａｃⅠ、 ＫｐｎⅠ、 ＢａｍＨⅠ、 ＸｂａⅠ、 ＰｓｔⅠ等ꎬ
酶切体系为 ５０ μＬꎬ ３７℃反应过夜ꎻ (３)连接ꎮ 用
普通回收试剂盒回收酶切产物后用 ３０ μＬ双蒸水洗
脱ꎬ 连接体系为 ５０ μＬꎬ ４℃连接过夜ꎻ (４)以每份
连接产物为模板进行巢式 ＰＣＲ 扩增ꎬ 其反应体系
为 ５０ μＬ (图 ２: Ｂ)ꎮ 巢式 ＰＣＲ第一轮扩增引物为
ＡＰ１(５′￣ＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣ￣３′)和
ＡＰ２ ( ５′￣ＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＴＧ￣３′)ꎻ
将第一轮扩增产物稀释 ４０倍作为第二轮 ＰＣＲ反应
的模板ꎬ 扩增引物为 ＡＰ３(５′￣ＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴ￣
ＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧ￣３′) 和 ＡＰ４ ( ５′￣ＴＣＴＡＡＴＴＣＣＴＡ￣
ＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＡＧＴＡＣ￣３′)ꎻ 第二轮 ＰＣＲ 扩增
产物经割胶回收后使用引物 ＬＢ￣Ｓ(５′￣ＣＣＡＡＡＡＴＣ￣
ＣＡＧＴＡＣＴＡＡＡＡＴＣＣＡＧ￣３′)测序ꎮ
A
B
C
()
LB HYG 35S MCS LAT52 EGFP RB
T DNA-
*+，PDR AP3
AP1 AP2 AP4
T DNA-
AP = anchor primer Genomic DNA
-./0123456789
:;<=.>89%
!"#$%& primer T DNA primer$%&-
Genomic DNA T-DNA
Ａ: 提取突变体的基因组(带有 Ｔ￣ＤＮＡ 元件插入)后进行单
酶切处理ꎻ Ｂ: 酶切产物自连接后 ＰＣＲ 确定插入位点(具体
见材料与方法)ꎻ Ｃ: 验证插入位点的正确性ꎮ
Ａ: Ｓｉｎｇｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ (ｗｉｔｈ Ｔ￣ＤＮＡ
ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ)ꎻ Ｂ: ＰＣＲ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅ
ａｆｔｅｒ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎꎻ Ｃ: Ｖｅｒｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｃｔｎｅｓｓ ｏｆ
Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅ.
图 ２　 反向 ＰＣＲ确定 Ｔ￣ＤＮＡ插入位点和验证
Ｔ￣ＤＮＡ插入位点结果的正确性
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｂｙ
ｉｎｖｅｒｓｅ￣ＰＣＲ ａｎｄ ｖｅｒｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅ
６６５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
１􀆰 ５　 验证 Ｔ￣ＤＮＡ插入位点的正确性
将反向 ＰＣＲ扩增产物的测序结果与拟南芥基
因组序列进行 ＢＬＡＳＴ 比对ꎬ 并根据相符的(序列
一致性 > ９０％)拟南芥基因组序列设计特异引物ꎬ
并与 Ｔ￣ＤＮＡ元件序列引物 ＬＢＶＳ (５′￣ＣＣＡＡＡＡＴＣ￣
ＣＡＧＴＡＣＴＡＡＡＡＴＣＣＡＧ￣３′)ＰＣＲ 扩增对应的突变
体基因组ꎬ 验证筛选到的突变体植株 Ｔ￣ＤＮＡ 插入
位点的正确性(图 ２: Ｃ)ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 背景材料的确定
突变体库构建和筛选体系中ꎬ 我们选用 Ｃｏ￣
ｌｕｍｂｉａ野生型拟南芥 ｑｕａｒｔｅｔ 突变体(ｑｒｔ１￣２)作
为背景材料ꎮ Ｃｏｌｕｍｂｉａ野生型拟南芥的小孢子在
四分体发育至成熟花粉粒阶段会分开(图 ３: Ａ)ꎬ
而 ｑｕａｒｔｅｔ突变体的小孢子在四分体发育至成熟
花粉粒阶段不分开ꎬ 其花粉被称为四分体花粉(图
３ :Ｂ) ꎬ但不影响植株的花粉竞争性与角果育性ꎮ
A B20 mμ20 mμ
图 ３　 Ｃｏｌｕｍｂｉａ野生型拟南芥的花粉(Ａ)
及突变体 ｑｒｔ１￣２的花粉(Ｂ)
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
ｐｏｌｌｅｎ (Ａ) ａｎｄ ｑｒｔ１￣２ ｐｏｌｌｅｎ (Ｂ)
ｑｒｔ１￣２花粉母细胞减数分裂形成的小孢子四分体联
结在一起ꎬ 相比 Ｃｏｌｕｍｂｉａ 野生型拟南芥更有利于
进行遗传分析ꎬ 当转入荧光蛋白后其四分体花粉在
杂合背景下表现为 ２个花粉有荧光、 ２ 个花粉无荧
光ꎮ 因为 Ｔ￣ＤＮＡ 插入位点与荧光标记连锁ꎬ 在
ｑｒｔ１￣２突变体库中可以轻易排除多位点插入突变
体ꎮ 如果突变体含有多拷贝 Ｔ￣ＤＮＡ 插入ꎬ 则 Ｔ１代
转基因植株的四分体花粉中有 ３个或 ４个花粉粒具
荧光ꎬ 该突变体植株将会被丢弃ꎮ 如果采用 Ｃｏ￣
ｌｕｍｂｉａ野生型拟南芥作为突变体库筛选的背景材
料则需要统计荧光花粉的比例才能确定是否为单拷
贝插入突变体ꎬ 拟南芥突变体 ｑｒｔ１￣２ 作为背景材
料则大大提高了我们定向筛选突变体的效率ꎮ
２􀆰 ２　 Ｔ￣ＤＮＡ载体元件的改造
在载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ 的基础上ꎬ 我们对其
Ｔ ￣ＤＮＡ元件进行了一些改造 (图４ ) ꎮ即在载体
CAMV 3UTR
PolyA signal PolyA signal
Left Border
HY
G
CAMV
35S LAT52
MCS
EGFP
NOS 3UTR
Right BorderpCAMBIAL-1302- -LAT52 EGFP
10366 bp
Kan
Ori2
Ori1
EcoR 377Ⅰ( )
Sac 387Ⅰ( )
Kpn 393Ⅰ( )
BamH 398Ⅰ( )
Xba 404Ⅰ( )
Pst 420Ⅰ( )
Hind 428Ⅲ( )
Avr 437Ⅱ( )
ＨＹＧ: Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎꎻ ＣＡＭＶ ３５Ｓ: ＣＡＭＶ ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎻ ＭＣＳ: Ｍｕｌ￣
ｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓꎻ ＥＧＦＰ: Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎꎻ
Ｋａｎ: Ｋａｎａｍｙｃｉｎ.
图 ４　 ｐＣＡＭＢＩＡＬ￣１３０２￣ＬＡＴ５２￣ＥＧＦＰ质粒图谱
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｐｌａｓｍｉｄ ｍａｐ ｏｆ ｐＣＡＭＢＩＡＬ￣１３０２￣ＬＡＴ５２￣ＥＧＦＰ
ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２的 Ｔ￣ＤＮＡ 元件上引入一个在花粉
中大量表达的启动子 ｐＬＡＴ５２驱动的 ＥＧＦＰ 花粉荧
光标记ꎬ 使载体 Ｔ￣ＤＮＡ 与花粉荧光连锁ꎬ 这样就
可在不确定插入位点位置的情况下ꎬ 通过观察花粉
荧光快速鉴定突变体植株是纯合还是杂合ꎮ 另外ꎬ
在多克隆位点(ＭＣＳ)处预留足够的单酶切位点ꎬ
以利于后续 Ｔ￣ＤＮＡ位点的确定ꎮ
２􀆰 ３　 杂合植株与纯合植株的筛选
为了定向筛选受精及早期胚胎发生相关突变
体ꎬ 需要快速确定转基因植株是否为纯合突变体
(有可能出现纯合致死现象)ꎮ 花粉启动子 ｐＬＡＴ５２
驱动的 ＥＧＦＰ 的表达会使突变体花粉发出绿色荧
光ꎬ 我们可以根据四分体花粉的荧光区分 Ｔ２代转
基因植株是纯合突变体还是杂合突变体(图 ５)ꎮ 在
Ｔ１代拟南芥转基因植株中ꎬ 如果突变体含有单拷贝
Ｔ￣ＤＮＡ插入ꎬ 则其四分体花粉中会出现 ２ 个具有
ＧＦＰ 荧光的花粉粒ꎬ 说明其基因组中含有 Ｔ￣ＤＮＡ
插入片段ꎬ 而另外 ２个观察不到荧光的花粉粒是野
７６５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 黄 洁等: 快速筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因的方法
50 mμ
A B C
D E F
Ａ、 Ｂ、 Ｃ: 杂合突变体植株ꎬ 四分体花粉中仅有两个花粉具绿色荧光ꎻ Ｄ、 Ｅ、 Ｆ: Ｔ２代纯合突变体植株ꎬ 四分体
花粉中 ４个花粉粒都具有绿色荧光ꎻ Ａꎬ Ｄ: 明场通道ꎻ Ｂꎬ Ｅ: 绿色荧光通道ꎻ Ｃꎬ Ｆ: 叠加ꎮ
Ａꎬ Ｂꎬ Ｃ: Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｎｔ. Ｔｗｏ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｍａｔｕｒｅ ｐｏｌｌｅｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍｅｉｏｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ ｈａｖｅ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓ￣
ｃｅｎｃｅꎻ Ｄꎬ Ｅꎬ Ｆ: Ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｎｔ ｐｌａｎｔｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｉｎ Ｔ２ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ. Ａｌｌ ｆｏｕｒ ｍａｔｕｒｅ ｐｏｌｌｅｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｅ
ｍｅｉｏｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｈｏｗ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅꎻ Ａꎬ Ｄ: Ｂｒｉｇｈｔ ｉｍａｇｅｓꎻ Ｂꎬ Ｅ: ＧＦＰ ｉｍａｇｅｓꎻ Ｃꎬ Ｆ: Ｏｖｅｒｌａｙ ｉｍａｇｅｓ.
图 ５　 通过花粉荧光快速鉴定杂合或纯合突变体植株
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ａｎｄ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｏｌｌｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
生型花粉 (图 ５: Ｃ)ꎮ 含有单拷贝 Ｔ￣ＤＮＡ 插入的
Ｔ２代转基因突变体植株中ꎬ 如果四分体花粉中 ４个
花粉粒都具有荧光ꎬ 则表明该植株是纯合突变体
(图 ５: Ｅ、 Ｆ)ꎮ 如果所有 Ｔ２代转基因突变体植株
的四分体花粉中都只有两个花粉具有荧光ꎬ 表明该
Ｔ２代突变体植株中无纯合突变体ꎮ
２􀆰 ４　 假阳性败育突变体的排除
Ｔ￣ＤＮＡ 插入突变的花粉可以发出绿色荧光ꎬ
且花粉的表型与花粉所发出的 ＥＧＦＰ荧光连锁ꎬ 若
所有具荧光的花粉表型都具有相似缺陷ꎬ 则可判断
为该表型缺陷是由 Ｔ￣ＤＮＡ 插入突变引起的ꎬ 反之
则不是ꎮ Ｔ￣ＤＮＡ 插入常导致很高频率的染色体易
位[１６]ꎬ 从而使 ５０％的配子体败育ꎬ 呈现典型的配
子体突变体表型ꎬ 但这是一种由染色体的不对称引
起的假阳性ꎬ 不是由于 Ｔ￣ＤＮＡ 插入导致的单基因
突变引起[１７]ꎬ 因此在筛选受精及早期胚胎发生相
关突变体的过程中必须将假阳性突变体排除ꎮ 本实
验中不具有荧光的花粉是野生型花粉ꎬ 其发育应该
是正常的ꎬ 但在染色体易位突变体中不具有荧光的
花粉发生了败育 (图 ６)ꎬ 显示败育与荧光 ( Ｔ￣
ＤＮＡ)并不连锁ꎬ 且败育也不是由于 Ｔ￣ＤＮＡ 插入
导致的单基因突变引起的ꎮ 染色体易位具体表现为
四分体花粉中无荧光的花粉粒皱缩ꎬ 而且败育是随
机的ꎬ 花粉群体中四分体花粉败育 １ ~ ４个花粉的
情况均存在(图 ６: Ａ ~ Ｄ)ꎬ 并以 ２个花粉败育的
比例最高ꎮ Ｔ￣ＤＮＡ 单拷贝插入的突变体花粉表型
(图 ６: Ｅ)是我们需要筛选的理想表型ꎮ
由表 １可见ꎬ 突变体库中染色体易位突变的频
率非常高ꎬ 达到 ９４６ 个ꎬ 占突变体总数的 １２􀆰５％ꎮ
染色体易位突变体都具有败育表型ꎬ 而真正的受精
和早期胚胎发生相关突变体数只有 ３８ 个ꎬ 仅占突
变体总数的 ０􀆰５０％ꎮ 如果用传统的方法从众多的
突变体中筛选出真正的受精和早期胚胎发生相关突
变体会非常的困难ꎬ 而利用本研究建立的筛选新方
法会大大加速这一进程ꎬ 并节省大量的人力、 物力
和时间ꎮ
８６５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
DIC
GFP
Merge
A B C D E
25 mμ
Ａ ~ Ｄ: 染色体易位导致的假阳性败育突变体ꎬ 但具有绿色荧光的花粉没有败育ꎻ Ｅ: Ｔ￣ＤＮＡ 单拷贝插入
的突变体对照ꎮ
Ａ － Ｄ: Ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｂｏｒｔｅｄ ｐｏｌｌｅｎ. Ｐｏｌｌｅｎ ｗｉｔｈ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓ ｓｈｏｗ
ｎｏ ａｂｏｒｔｉｏｎꎻ Ｅ: Ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｕｔａｎｔ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎｏ ｅｖｉｄｅｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｐｏｌｌｅｎ.
图 ６　 染色体易位导致的假阳性败育突变体
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｍｕｔａｎｔｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ
表 １　 突变体库数据统计
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｌｉｂｒａｒｙ
突变体
总数
Ｎｏ. ｔｏｔａｌ
ｍｕｔａｎｔｓ
双插入突
变体数
Ｎｏ. ｄｏｕｂｌｅ
ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ
ｍｕｔａｎｔｓ
染色体易位
突变体数
Ｎｏ. ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ
ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ
ｍｕｔａｎｔｓ
候选受精和早
期胚胎发生相
关突变体数
Ｎｏ. ｃａｎｄｉｄａｔｅ
ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ
ｍｕｔａｎｔｓ
７５８３ ８４４ ９４６ ３８
２􀆰 ５　 Ｔ￣ＤＮＡ插入位点的确定
获得目标突变体后ꎬ 需进一步确认突变的位
点ꎮ 与诱变突变体相比ꎬ Ｔ￣ＤＮＡ 插入突变体的优
势在于其 Ｔ￣ＤＮＡ 插入位点可以快速确定ꎮ 基于改
造的载体序列ꎬ 利用反向 ＰＣＲ 能够快速批量得到
Ｔ￣ＤＮＡ插入位点(图 ２)ꎮ 反向 ＰＣＲ 主要是用限制
性内切酶对突变体基因组 ＤＮＡ 进行酶切ꎬ 并将酶
切片段自连接形成环状 ＤＮＡ 分子[１８ꎬ１９]ꎬ 然后利用
特异引物对环形 ＤＮＡ 分子进行 ＰＣＲ 扩增[２０]ꎮ 由
于两轮 ＰＣＲ采用的都是特异引物ꎬ 因此扩增效率
非常高ꎮ
３　 讨论
被子植物的受精是世代交替的一个转折点ꎬ 也
是新一代孢子体发育的起点ꎬ 受精与早期胚胎发生
的进程对植物有性生殖繁育具有决定作用ꎮ 为了深
入研究受精与早期胚胎发生的分子调控机制ꎬ 需要
构建突变体库并进行筛选以获得相关重要基因的突
变体ꎮ 模式植物拟南芥受精和早期胚胎发生相关基
因突变体的筛选是一个工作量大、 耗时长、 获得有
效突变体植株少的艰难过程ꎮ 笔者所在课题组经过
优化改良的筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基
因突变体的新方法ꎬ 相较于物理辐射诱变、 化学诱
变及常规的插入突变凸显出如下优势:
(１)突变位点与荧光标记连锁ꎬ 可在不确定插
入位点位置的情况下快速鉴定 Ｔ２代拟南芥突变体
植株是纯合还是杂合ꎮ 而传统意义上的 Ｔ￣ＤＮＡ 插
入突变必须在 Ｔ￣ＤＮＡ 插入位点已知的前提下ꎬ 才
能通过 ＰＣＲ 扩增方法确定 Ｔ２代植株是否为纯合
体ꎬ 或者在 Ｔ３代植株中通过抗性筛选确定是否为
纯合突变体植株ꎬ 因此鉴定常规的插入诱变产生
的突变体是否为纯合突变植株显得较为困难ꎮ 本
研究建立的鉴定拟南芥受精与早期胚胎发生相关
基因的新方法能够简单、 快速、 准确地鉴定突变
体植株是否为纯合体ꎬ 这对于定向筛选与受精和
早期胚胎发生相关的重要基因有特殊的意义ꎬ 因
９６５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 黄 洁等: 快速筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因的方法
为与配子发育、 受精等重要过程相关的基因突变常
常纯合致死ꎮ
(２)突变位点与花粉荧光连锁ꎬ 可在 ｑｕａｒｔｅｔ
突变体背景材料中轻易排除多位点插入突变ꎮ 传统
意义上的插入突变需要确定插入元件是否为单拷
贝ꎬ 才能明确插入位点位置ꎮ 如 Ｃｈｅｎ等用农杆菌
介导 Ｄｓ转座因子转化拟南芥植株ꎬ 得到了一个突
变体 ＣＣＧ[２１]ꎬ 但在突变体筛选过程中ꎬ 为了确定
Ｄｓ转座子插入的拷贝数ꎬ 需要设计一段与其互补
的探针并和待筛选材料进行 ＤＮＡ 杂交ꎬ 此实验操
作步骤繁琐、 工作量大ꎮ 本研究建立的鉴定拟南芥
受精与早期胚胎发生相关基因的新方法能够通过检
测花粉荧光快速鉴定突变体植株是否具有多拷贝的
Ｔ￣ＤＮＡ插入ꎬ 如果突变体含有多拷贝 Ｔ￣ＤＮＡ 插
入ꎬ 则 Ｔ１代转基因植株四分体花粉中有 ３ 个或 ４
个花粉粒具荧光ꎬ 该突变体植株将被丢弃ꎮ
(３)易于排除染色体交换和染色体易位导致的
假阳性败育突变体ꎮ 染色体易位会导致 ５０％配子
体的败育ꎬ 呈现典型的配子体突变体表型ꎮ 将染色
体易位突变体当成配子体败育突变体进行研究会浪
费研究者的时间与精力ꎮ 传统的突变体构建方法很
难将染色体易位这种突变与真正的配子体突变体区
分开ꎬ 但本研究建立的鉴定拟南芥受精与早期胚胎
发生相关基因的新方法可通过检测花粉荧光ꎬ 在
ｑｕａｒｔｅｔ突变体背景中轻易排除染色体易位导致的
假阳性败育突变体ꎮ
(４)易于扩增 Ｔ￣ＤＮＡ 侧翼序列ꎬ 确认突变基
因ꎮ 获得目标配子体突变体后ꎬ 需进一步确认突变
的位点ꎮ 化学诱变突变的位点确认需要进行图位克
隆ꎬ 实验花费时间较长(约 ６ 个月) [２２]ꎬ 而本研究
基于改造的 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２ 载体序列ꎬ 利用反向
ＰＣＲ扩增技术能够快速批量确定 Ｔ￣ＤＮＡ 插入位
点ꎮ
我们探索出的新方法已在筛选拟南芥受精和早
期胚胎发生相关基因突变体上得到了成功应用ꎬ 并
得到了一系列受精过程发生障碍以及早期胚胎败育
的拟南芥突变体ꎬ 如表现为卵细胞不成熟、 中央细
胞极核不融合的 ＧＣＤ１ 突变体[２３]ꎮ 因此ꎬ 本研究
建立的鉴定拟南芥受精与早期胚胎发生相关基因的
新方法是一种效率高、 针对性强、 操作相对快捷方
便的拟南芥突变体筛选方法ꎮ
参考文献:
[ １ ] 　 曹冬梅ꎬ 范喜英ꎬ 王云山ꎬ 唐黎芳. 拟南芥激活标
签突变体库的构建及突变体表型的分析[Ｊ] . 农业
生物技术学报ꎬ ２００８ꎬ １６(２): ２９２－２９８.
[ ２ ] 　 Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ. Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｐｌａｎｔ Ａｒａｂｉｄｏｐ￣
ｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ] . Ｎａｔｕｒｅꎬ ２０００ꎬ ４０８(６８１４): ７９６－
８１５.
[ ３ ] 　 孙万刚. 拟南芥突变体构建方法及目的基因分离鉴
定技术[Ｊ] . 安徽农业科学ꎬ ２０１０ꎬ ３８(１８): ９４３３－
９４３４.
[ ４ ] 　 Ｇｒｅｅｎｅ ＥＡꎬ Ｃｏｄｏｍｏ ＣＡꎬ Ｔａｙｌｏｒ ＮＥꎬ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＪＧꎬ
Ｔｉｌｌ ＢＪꎬ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＳＨꎬ Ｅｎｎｓ ＬＣꎬ Ｂｕｒｔｎｅｒ Ｃꎬ Ｊｏｈｎ￣
ｓｏｎ ＪＥꎬ Ｏｄｄｅｎ ＡＲꎬ Ｃｏｍａｉ Ｌꎬ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ. Ｓｐｅｃ￣
ｔｒｕｍ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ａ ｌａｒｇｅ￣
ｓｃａｌｅ ｒｅｖｅｒｓｅ￣ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ [ Ｊ] .
Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ ２００３ꎬ １６４(２): ７３１－７４０.
[ ５ ] 　 Ｐａｒｒｙ ＭＡꎬ Ｍａｄｇｗｉｃｋ ＰＪꎬ Ｂａｙｏｎ Ｃꎬ Ｔｅａｒａｌｌ Ｋꎬ
Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ￣Ｌｏｐｅｚ Ａꎬ Ｂａｕｄｏ Ｍꎬ Ｒａｋｓｚｅｇｉ Ｍꎬ
Ｈａｍａｄａ Ｗꎬ Ａｌ￣Ｙａｓｓｉｎ Ａꎬ Ｏｕａｂｂｏｕ Ｈꎬ Ｌａｂｈｉｌｉｌｉ Ｍꎬ
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＡＬ. Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｆｏｒ ｃｒｏｐ ｉｍｐｒｏｖｅ￣
ｍｅｎｔ[Ｊ] . Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔꎬ ２００９ꎬ ６０(１０): ２８１７－２８２５.
[ ６ ] 　 宋磊ꎬ 杨仲南ꎬ 吴世福ꎬ 崔永兰. 拟南芥网状突变体
Ｅ￣２１０基因精细定位[Ｊ] . 植物科学学报ꎬ ２００８ꎬ ２６
(５): ４３７－４４２.
[ ７ ] 　 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ＰＳ. Ｇｅｎｅ ｔｒａｐｓ: ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐ￣
ｍｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２０００ꎬ １２(７):
１００７－１０２０.
[ ８ ] 　 Ａｎ Ｇꎬ Ｌｅｅ Ｓꎬ Ｋｉｍ ＳＨꎬ Ｋｉｍ ＳＲ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅ￣
ｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎ ｒｉｃｅ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ
２００５ꎬ ４６(１): １４－２２.
[ ９ ] 　 Ｓｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒ ＲＧꎬ Ｚｈａｎｇ Ｋꎬ Ｔａｔａｒｉｎｏｖａ Ｔꎬ
Ｔｒｏｕｋｈａｎ Ｍꎬ Ｋｗｏｋ ＳＦꎬ Ｄｒａｉｓ Ｊꎬ Ｋｌｉｎｇｅｒ Ｋꎬ Ｏｒｅｊｕ￣
ｄｏｓ Ｆꎬ Ｍａｃｙ Ｋꎬ Ｂｈａｋｔａ Ａꎬ Ｂｕｒｎｓ Ｊꎬ Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ
Ｇꎬ Ｄｏｎｓｏｎ Ｊꎬ Ｆｌａｖｅｌｌ Ｒꎬ Ｆｅｌｄｍａｎｎ ＫＡ. Ａｇｒｏｂａｃｔｅ￣
ｒｉｕｍ Ｔ￣ＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ
ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｏｃｃｕｒ ｆｒｅ￣
ｑｕｅｎｔｌｙ ｉｎ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎｓ[Ｊ] . Ｆｕｎｃｔ Ｉｎｔｅｇｒ
Ｇｅｎｏｍｉｃｓꎬ ２００５ꎬ ５(４): ２４０－２５３.
[１０] 　 崔清志ꎬ 刘晓红ꎬ 陈惠明. ＥＭＳ 诱变技术研究进展
[Ｊ] . 湖南农业科学ꎬ ２０１３ꎬ １３(５): ７－９.
[１１] 　 阎双勇ꎬ 谭振波ꎬ 李仕贵. 水稻插入突变体库构建
研究进展[Ｊ] . 中国生物工程杂志ꎬ ２００４ꎬ ２４(６):
４８－５３.
[１２] 　 Ｂｒｉｎｋ ＲＡꎬ Ｃｏｏｐｅｒ ＤＣ. Ｄｏｕｂｌｅ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅ￣
０７５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｉｎ ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ[Ｊ] . Ｂｏｔａｎｉ￣
ｃａｌ Ｇａｚｅｔｔｅꎬ １９４０ꎬ １０２(１): １－２５.
[１３] 　 Ｐｒｅｕｓｓ Ｄꎬ Ｒｈｅｅ ＳＹꎬ Ｄａｖｉｓ ＲＷ. Ｔｅｔｒａｄ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＱＵＡＲ￣
ＴＥＴ ( ＱＲＴ ) ｇｅｎｅｓ [ Ｊ ] . Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ １９９４ꎬ ２６４
(５１６４): １４５８－１４６０.
[１４] 　 Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｔꎬ Ｓｋｏｏｇ Ｆ. Ａ ｒｅｖｉｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｂｉｏ ａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ ｔｏｂａｃｃｏ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ
[Ｊ] . Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍꎬ １９６２ꎬ １５(３): ４７３－
４９７.
[１５] 　 Ｃｌｏｕｇｈ ＳＪꎬ Ｂｅｎｔ ＡＦ. Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ: ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａ￣
ｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｊꎬ １９９８ꎬ １６(６): ７３５－
７４３.
[１６] 　 曾凡锁ꎬ 詹亚光. 转基因植物中外源基因的整合特
性及其研究策略[Ｊ] . 植物学通报ꎬ ２００４ꎬ ２１(５):
５６５－５７７.
[１７] 　 梁春莉ꎬ 刘孟军ꎬ 赵锦. 植物种子败育研究进展
[Ｊ] . 分子植物育种ꎬ ２００５ꎬ ３(１): １１７－１２２.
[１８] 　 Ｍａｔｈｕｒ Ｊꎬ Ｓｚａｂａｄｏｓ Ｌꎬ Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ｓꎬ Ｇｒｕｎｅｎｂｅｒｇ
Ｂꎬ Ｌｏｓｓｏｗ Ａꎬ Ｊｏｎａｓ￣Ｓｔｒａｕｂｅ Ｅꎬ Ｓｃｈｅｌｌ Ｊꎬ Ｋｏｎｃｚ
Ｃꎬ Ｋｏｎｃｚ￣Ｋａｌｍａｎ Ｚ. Ｇｅｎｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｅｄ Ｔ￣ＤＮＡ ｔａｇｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｊꎬ １９９８ꎬ
１３(５): ７０７－７１６.
[１９] 　 Ｓｏｕｅｒ Ｅꎬ Ｑｕａｔｔｒｏｃｃｈｉｏ Ｆꎬ ｄｅ Ｖｅｔｔｅｎ Ｎꎬ Ｍｏｌ Ｊꎬ
Ｋｏｅｓ Ｒ. Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ｇｅｎｅｓ ｔａｇｇｅｄ
ｂｙ ａ ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ[Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ Ｊꎬ １９９５ꎬ ７(４): ６７７－６８５
[２０] 　 赵霞ꎬ 周波ꎬ 李玉花. Ｔ￣ＤＮＡ 插入突变在植物功能
基因组学中的应用[ Ｊ] . 生物技术通讯ꎬ ２００９ꎬ ６
(２０): ８８０－８８５.
[２１] 　 Ｃｈｅｎ ＹＨꎬ Ｌｉ ＨＪꎬ Ｓｈｉ ＤＱꎬ Ｙｕａｎ Ｌꎬ Ｌｉｕ Ｊꎬ Ｓｒｅｅｎｉ￣
ｖａｓａｎ Ｒꎬ Ｂａｓｋａｒ Ｒꎬ Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ Ｕꎬ Ｙａｎｇ ＷＣ.
Ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｃｅｌｌ ｐｌａｙｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｏｌｌｅｎ ｔｕｂｅ
ｇｕｉｄａｎｃｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２００７ꎬ １９
(１１): ３５６３－３５７７.
[２２] 　 Ｇｒｏｓｓ￣Ｈａｒｄｔ Ｒꎬ Ｋａｇｉ Ｃꎬ Ｂａｕｍａｎｎ Ｎꎬ Ｍｏｏｒｅ ＪＭꎬ
Ｂａｓｋａｒ Ｒꎬ Ｇａｇｌｉａｎｏ ＷＢꎬ Ｊｕｒｇｅｎｓ Ｇꎬ Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ
Ｕ. ＬＡＣＨＥＳＩＳ ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ ｇａｍｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅ￣
ｍａｌｅ ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ] . ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌꎬ
２００７ꎬ ５(３): ４９４－５００.
[２３] 　 Ｗｕ ＪＪꎬ Ｐｅｎｇ ＸＢꎬ Ｌｉ ＷＷꎬ Ｈｅ Ｒꎬ Ｘｉｎ ＨＰꎬ Ｓｕｎ ＭＸ.
Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＧＣＤ１ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｓ ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ
ｃｅｌｌ￣ｔｏ￣ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉ￣
ｄｏｐｓｉｓ ｆｅｍａｌｅ ｇａｍｅｔｅｓ [ Ｊ] . Ｄｅｖ Ｃｅｌｌꎬ ２０１２ꎬ ２３
(５): １０４３－１０５８.
附录: 浇灌拟南芥的营养液配方
５０倍浓度的大量元素母液:
　 　 硝酸钾 ＫＮＯ３ ９５ ｇ / Ｌ
　 　 硝酸铵 ＮＨ４ＮＯ３ ８２.５ ｇ / Ｌ
　 　 七水硫酸镁 ＭｇＳＯ４􀅰Ｈ２Ｏ １８.５ ｇ / Ｌ
　 　 磷酸二氢钾 ＫＨ２ＰＯ４ ８.５ ｇ / Ｌ
１００倍微量元素母液:
　 　 硼酸 Ｈ３ＢＯ３ ０.６２ ｇ / Ｌ
　 　 碘化钾 ＫＩ ０.０８３ ｇ / Ｌ
　 　 四水硫酸锰 ＭｎＳＯ４􀅰４Ｈ２Ｏ ２.２３ ｇ / Ｌ
　 　 二水钼酸钠 Ｎａ２ＭｏＯ４􀅰２Ｈ２Ｏ ０.０２５ ｇ / Ｌ
　 　 七水硫酸锌 ＺｎＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ ０.８６ ｇ / Ｌ
　 　 五水硫酸铜 ＣｕＳＯ４􀅰５Ｈ２Ｏ ０.００２５ ｇ / Ｌ
　 　 六水氯化钴 Ｃｌ２Ｃｏ􀅰６Ｈ２Ｏ ０.００２５ ｇ / Ｌ
１００倍铁盐母液:
　 　 七水硫酸亚铁 ＦｅＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ ５.５６ ｇ / Ｌ
　 　 乙二胺四乙酸二钠 ＥＤＴＡ ７.４６ ｇ / Ｌ
１００倍钙盐母液:
　 　 二水氯化钙 ＣａＣｌ２􀅰２Ｈ２Ｏ ４４ ｇ / Ｌ
注: 以上营养液配方是在 １ / ２ ＭＳ 培养基的基础上改良
的ꎮ 浇灌营养液时ꎬ 将以上 ４种母液按大量元素溶液 ∶微
量元素溶液 ∶钙盐溶液 ∶铁盐溶液 ＝ ４ ∶ ２ ∶ ２ ∶ １ 的比例混
合ꎬ 再加水稀释成 ０􀆰５倍浓度溶液即可ꎮ
(责任编辑: 刘艳玲)
１７５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 黄 洁等: 快速筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因的方法