全 文 ：第 5 卷
V o l
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5 N o
第 2 期
2
草 地 学 报
A C T A A G R ES T IA S IN CA
1 99 7 年
1 9 97
内蒙古草原羊草根际联合固氮菌的分离鉴定
及其生理生化特性研究 ’
关秀清 杜千有 于井朝
(中国科学院植物研究所 , 北京 1 0 0 0 9 3)
摘要 :作者从内蒙古锡林郭勒草原优质牧草一羊草(扮脚. u , th 认en si : )根际分离筛选出两株根际
联合固氮菌。 根据形态特征和生理生化特性 , 菌株 A 一 1 属催娩克雷伯 氏菌 (K 及洒s纪l阮 。炙外“口 ), 菌
株 B 一 18 属肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种 (K ‘亡‘诃认 如。~ tae su b
s p
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n沁 )。 对其进行生理生
化特性 、培养特性、固氮酶活性 、氧浓度对固氮酶活性影响等方面的研究。 结果表明 , 菌株均在微好
氧条件下固氮活性最高 , 在 H ill无氮培养基上 30 ℃恒温培养 , 其固氮酶活性分别在 18 和 16 小时左
右达到最高峰。
关扭词 : 根际 ; 联合固氮菌 ; 固氮酶活性 ; 内蒙古草原 ; 氮循环
1 前言
本世纪七十年代以来 , 禾本科植物根际联合固氮引起科学家们极大的关注 , 并且已做了大
量研究工作 。 (何福恒等 , 1 9 8 6 ;尤崇构等 , 19 91 ;林敏等 , 1 994 , H el , 1 9 9 2 )。 目前已有很多关
于水稻 、小麦 、玉米 、甘蔗 、谷子等作物联合固氮作用的报导 (致〕d dcy 等 , 1 9 88 ; H ar is 等 , 1 989 )。
热带 、亚热带牧草的根际和根表 , 有的甚至在根的皮层细胞中都有联合固氮菌的存在 (王子芳
等 , 1 9 8 2 ) 。 但对我国北方干旱半干旱地区禾本科牧草根际联合固氮菌的研究却很少 , 迄今为
止 , 尚未见有关草原牧草分离到根际联合固氮菌的报导 。 作者在 1 9 9 1 年从内蒙古锡林郭勒不
同类型羊草草原取样 , 用富集法和平板划线取单菌落法分离到二十余株具有固氮酶活性的固
氮菌 , 其中固氮菌活性高的有 6 株 , 经鉴定其中一株为催娩克雷伯氏杆菌 , 其余为肺炎克雷伯
氏杆菌肺炎亚种的不同生物型 。 从中选出 A 一 1 和 B 一 18 两株菌 , 进行生理生化特性和固氮
特性等项研究。
2 材料与方法
2
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1 材料来源
19 1 年 7 月从内蒙古锡林郭勒草原不同类型草场采集羊草的须根 。
2
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2 培养基
采用 : ¹ As hb y ‘s 无氮培养基 , º 伪be ri ne r’s 无氮培养基 , » Hi n 无氮培养基 , ¼ B u 无氮培
养基 。
2
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3 菌种分离
取羊草新鲜须根 , 冲洗 4 小时后 , 浸 70 %酒精片刻 , 用 0 . 1% H g CI 灭菌 5 分钟 , 剪碎后置
入 A sh by + 伪b e r e in e : 和 H ill+ o ko n 无氮液体培养基 , 30℃恒温 , 静置培养 45 小时 。 密封 、抽
国家自然科学基金资助项 目
菌株由中国科学院微生物研究所周慧玲教授鉴定 , 仅此致感谢
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2 4 小时后 , 形成的菌落较粘稠 、 白色 、不流动 。 两天后分泌出棕色素扩散到培养基中 , 而菌落
颜色 不变 。 另一种在 A sh by 培养基上同样条件下培养 , 形成白色较稀的菌落 , 能流动 。 两类
菌在苹果酸源培养基上固氮活性很低 , 而在蔗糖碳源培养基上培养 , 其固氮活性增加 3 一 4 倍 。
乙炔还原活性最高可达约 60 毫微克分子 q 氏 /毫升 / 小时 。
A- 1 为短杆 , 近球形 , 单个 , 成对 , 成链 。 大
单个 , 成对排列 。 细胞大小 0 . 5 二 0 . 7 x 0 . 8
/ 匡团
1 . ⋯ ⋯8 10 12 14 16 18 2 ‘卜 22 24时间 (’J 、时) Tl 眼 (h 川卜〕
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3
.
2 形态特征
培养 24 小时后的菌体在光学显微镜下观察 。
小 0 . 7 一 1 . o X O . 8 一 1 . 8拜。 B 一 15 为短杆 , 近球形 ,
一 1 . 5 拌。 见图 1
3
.
3 培养特性
两株菌在含糖及有机酸碳源培养基上均能良
好生长 。 在蔗糖碳源培养基上培养则产酸产气 ,
在 30 ℃ 下培养 24 小时后 pH 为 6 . 0 以下 , pH 终
值为 9 . 0 。 A 一 l 菌株在苹果酸碳源 固体培养基
上产生棕色素释放到培养基中 。 在牛肉汁培养基
上 , 菌落均呈白色 , 圆形 , 表面光滑 , 低凸 , 边缘整
齐 , 培养 24 小时直径 1 . 0 一 2 . om m 。 A 一 1 菌株
在培养过程中能产生叫噪 。
在 B u 培养基上半固体培养均形成带状生长
物 , 在无氧条件下不长 。
3
.
4 生理生化特性
图 2 菌浓度和培养时间的关系
Fi g
.
2 T im e of e ul ture course
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co n
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lo n o f s ta in
表 I A 一 1 和 B一 18 菌的生理生化特性
T a ble 1 Ph邓io lo g ie al a n d b ioc henu
e al fea t
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of s trai ns A 一 1 a n d B 一 1 8
特性 C ha r ae t e rs A 一 1 B 一 1 8
革兰氏染色
产生叫噪
甲基红
V
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P
.
从三糖铁产生 H Zs
利用柠檬酸钠
脉 酶
苯丙氨酸脱氨酶
赖氨酸脱淡酶
鸟胺酸脱梭酶
精氨酸脱淡酶
精氨酸双水解酶
淀粉水解
明胶液化
氧化酶
接触酶
水解七叶昔
H & L 葡萄糖氧化发酵
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5℃乳糖产酸 Ac 记
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5℃
+
产酸并产气
A e i d a n d g a s P r闭u e ed
+
十
产酸并产气
A e id a n d g as P r以lu e ed
+
1 0 4 草 地 学 报 1 9 97 年
特性 Ch a r a ete rs A 一 1 B 一 1 8
1 0℃ 生长
硝酸盐还原
石蕊牛奶
利用碳水化合物产酸 :
葡萄糖
甘露糖
木 糖
阿拉伯糖
1 0℃ G ro w th
R ed
u e tio n of ni tra te
L a tim u s m ilk
十
+
产酸 , 酸凝 , 还原
A e id Pr司u eed R ed u e tion
十
+
产酸 , 酸凝 , 还原
Ac id p r 沼u e己 R 曰 u etio n
+十+十+
糖乳蔗
麦芽糖
海藻糖
鼠李糖
棉子糖
蜜二糖
纤维二糖
山梨糖
山梨醇
粘液酸
甘露醇
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5 碳源利用
碳源
表 2 菌株 A 一 1 和 B一 18 对碳派的利用
T a b le 2 U til iza ti
o n of ea r肠n sou rse by A 一 1 a n d B 一 1 8
〔治r加 n so u r ces A 一 1 B 一 18
+十+
苯甲酸钠
乙酸纳
柠檬酸
甲 酸
谷氨酸
半胧氨酸
肌 醇
中性酒石酸钠
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淀 粉
葡萄糖
甘露醇
海藻胶
甘 油
纤维素
苹果酸
柠檬酸钠
麦芽糖
丙 酮
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糖酸蔗乳
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注 : “ 一 ”不能生长 , “ 十 ”微弱生长 , “ + + ”中度生长 , “ + + + ”长得好
N o te :
“ 一 ” n o g r o u th , “ + ”w ea k g ro wt h
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第 2 期 关秀清等 : 内蒙古草原羊草根际联合固氮菌的分离鉴定及其生理生化特性研究
3
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6 菌株 固氮活性的周期变化
从图 (3) 中可见 , 菌株 A 一 1 和 B 一 18 在 30 ℃ 恒温下培养 16 小时后 , 即达到固氮活性的高
峰期 , 对数期的固氮酶活性直线上升 , 20 小时
后 , 固氮酶活性下降 , 而 A 一 1 固氮活性始终
比 B 一 1 8 低 。 到 18 . 小时后 固氮活性即开始
下降。 但 24 小时后均能测到固氮活性 。
观察菌体在 H il 培养基中培养 12 小时
后 , 菌悬液变浓 , 呈微黄色 。 此时固氮活性并
不很高 。 因为培养基 中由接种的菌悬液带来
的有机氮及配制培养基加入少量氨基酸 , 以
维持氮需要 。 至对数期后期 , 菌体利 用空气
中的氮 , 16 一 2 0 小时固氮活性达到最高峰 。 Fi g. 3
户户于卫、分Jl.巴幽J卜葱.、恋,行七,1“脚犯肠暇岌曰 圈 3 固掩醉活性与培养时间的关系
T im e of cul ture ~
a n d n it找准e n nase
a e tivi ty
对数生长是迫于营养限制而停止的 。 固氮活性随之下降 。 因为固定 lmo l的氮 , 将消耗
12 一 2 4 mo l的 A T P ( B r ill, 1 9 7 7 ) 。
3
.
7 氮浓度对菌体 固氮晦活性的影响
从图 ( 4) 看 出 , 菌株均能在有氧或微氧环境中进行固氮作用 。 但随着氧浓度的增加 , 对固
氮活性有明显的抑制作用 。 纯培养中两菌株固氮最适氧分压在 3 %左右 。
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图 4 权浓度对固氮酶活性的影响
Fig
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4 E ffe e t o f v面o us Q2 co n e e n t r a t ion s o n n i tro g e n n as e a e ti v ity
4 讨论
4
.
1 关于羊草根际联合固氮菌及其特征
从内蒙古锡林郭勒草原优质羊草根际分离出的两株根际联合固氮菌 , 对其生理生化特性 ,
固氮酶活性 、氧浓度对固氮酶活性影响等方面进行研究 。 属我国首次从内蒙古半干早典型草
原的羊草中分离而得的菌种 。 锡林郭勒草原是我 国温带草原最有代表性的典型地区 , 位于 内
蒙古草原的中东部 , 海拔 1 00 米以上 , 年均降水量 350 m m 左右 , 年均气温 一 0 . 4 ℃ , 土壤以栗
钙土为主 , pH 值在 8 . 5 以上 , 属强碱性反应 , 有机质含量为 4 % 。 土壤水分变化表现出典型的
草 地 学 报 19 97 年
季节性 , 6 月中旬最干旱 , 含水量变化于 2 % 左右 。 在如此严酷的条件下从羊草根际分离出的
联合固氮菌 , 和其它根际联合固氮菌相 比 , 具有如下特征 : 在培养过程中 , 温度和 pH 等条件要
求不严格 , 生长快 , 而且固氮酶活性范围较宽 。
肺炎克氏杆菌在全国各地均能发现 , 但肺炎亚种实属少见 , 而在内蒙半干旱草原地区 自生
固氮则更属罕见 。 催娩克 氏杆菌在培养过程中能分泌叫噪 , 说明在内蒙草原特殊的生态环境
中存活的固氮菌则有其耐严酷条件的特点 。
4
.
2 关于羊草联合 固氮 菌的利用
内蒙古锡林郭勒草原约 由 629 种植物组成 , 其中豆科植物 46 种 , 占 7 . 4 % (刘书润等 ,
1 9 88) 这些豆科植物 , 由于 自然条件的严酷 , 其根瘤的发育都不 旺盛 (王芳玖 , 19 8 5 ) , 因而豆科
根瘤共生 固氮量十分有限 , 这对于依赖生物固氮维持草地生态系统氮素平衡十分不利 。 而禾
本科植物根际联合固氮资源的开发和利用对维持草地生态系统的氮素平衡就有着十分重要的
价值 。 作者首次从羊草根际分离出的这两种联合固氮菌 , 如能用于土壤以增加氮素 , 对于增加
草地生态系统的氮素供应 , 是很有意义的 。 对此 , 则有待进一步研究 。
参 考 文 献
1 王子芳 , 1 9 82 , 细菌 一 植物联合固氮研究进展 , 微生物学通报 , 9( 4) : 175 一 181
2 王芳玖 , 1 9 85 , 野生豆科牧草结瘤情况的初步调查 , 草原生态系统研究 , 5 : 123 一 1 34( 内部资料 )
3 尤崇构 , 1 9 91 ;水稻根际联合固氮 , 北京 :农业出版社 , 39 一 47
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学通报 , 6 : 2 4 7 一 2 4 9
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第 2 期 关秀清等 : 内蒙古草原羊草根际联合固氮菌的分离鉴定及其生理生化特性研究 1 07
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