全 文 ：武 汉植物学研究 2004，22(1)：33～38
Journal of Wahan Botanical Research
钙调素激酶在玉米体内的免疫组织化学定位
杨万年h。，梁述平 ，吕应堂
(1．武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室。武汉 430072；2．华中师范大学生命科学学院。武汉 430079)
摘 要：应用免疫组织化学定位方法研究了玉米体内钙调素激酶(CaM kinase，CaMK)的表达模式。结果表明
CaMK广泛分布于玉米体内，但表达水平存在着明显时空差异。在营养器官中钙调素激酶主要分布于叶的维管柬
鞘细胞、侧根原基和根尖等部位，而其它部位没有检测到明显的分布。在生殖器官中，有大量钙调素激酶分布于幼
胚及花药小孢子母细胞、四分体及绒毡层细胞中；在成熟胚囊的卵细胞、中央细胞以及二者的分界面上也有少量分
布。这些结果为进一步探索钙调素激酶在植物体内的生理功能提供了重要线索。
关键词：钙调素激酶；免疫组织化学定位；胚；花药；玉米
中图分类号：Q945．45 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2004)01—0033—06
Imm unohistochemical Localization of Calmodulin Kinase in M aize
YANG Wan—Nian ，LIANG Shu—Ping ，LU Ying—Tang 。
(】．Key Laboratory of MOE for Plant Developmental Biology，Wuhan University，Wuhan 430072，Chinal
2．Colege of Life Sciences，Central China Normal University，Wuhan 430079，China)
Abstract：The expression patterns of a maize calmodulin kinase (CaM kinase，CaMK)by im—
munohistochemical localization were studied． The results indicated that while the CaM K was
widely distributed in maize，from vegetative to reproductive organs，its expression was highly re—
gulated spatially and temporally．CaM K was mainly accumulated in vascular bundle sheath ceils of
leaves and highly expressed in lateral root primordia and root tips．But the kinase was under de．
tectable in other regions．In reproductive organs，much CaM K was found in young embryos and
some anther cells such as microspore mother cells，tetrads and tapetum．In mature embryo sacs，
significant amounts of CaM kinase was also observed in the egg cel1．central cell and at the inter—
face of these two cells．All these findings provided clues for biological functions of thes CaM ki—
nase in maize．
Key words：Calmodulin kinase；Immunohistochemical localization；Embryo；Anther；M aize
钙是真核细胞中重要的第二信使。各种胞外刺
激如光、触摸、病源激发子和植物激素等均能引起胞
质钙浓度的变化[1]。在植物生长和发育过程中，细胞
内钙浓度复杂的时空变化是由钙的靶蛋白如钙调素
所感受的。钙调素非常保守并广泛分布于各种真核
生物的细胞中，当钙调素被钙离子激活时，能够可逆
地与其靶蛋白发生结合，从而调节后者的活性，最终
影响各种下游代谢途径的活性L2 ]。
钙调素激酶是钙调素的重要靶蛋白之一，其活
性受钙调素激活，能够可逆地对其底物蛋白进行磷
酸化。目前在哺乳动物中已鉴定出多种钙调素激酶，
这些蛋白激酶具有各自的组织和细胞特异性分布模
式，介导动物体内不同的生理过程，如碳水化合物的
代谢、细胞骨架功能的调节、神经记忆、细胞周期、基
收稿日期：2003—04—21，修回日期：2003—06—12。
基金项目：国家自然科学基金资助项 目(30170449)。
作者简介：杨万年(1968一)，男。湖北长阳人，博士。副教授．从事植物发育及分子生物学方面的研究。
通讯作者。
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因转录等 ]。1 993年 Watilon等首先从苹果中分
离了植物钙调素激酶的 cDNA[7]，随后 Lu等从玉米
中分离了另一种动物蛋白激酶的同源基因MCK1，
并分析了其蛋白质产物的结构。MCK1蛋白与报道
的动物体内的蛋白激酶基因类似，含有 1个激酶催
化区和 1个钙调素结合结构域[8 ]。另外 Poovaiah
实验室还分离和鉴定了一种特殊类型的蛋白激酶，
这类激酶活性依赖于钙调素，但同时具有与钙结合
的能力。从结构上看好象是一类特殊的CDPK，因为
其结构中含有 3个结合钙离子的EF手型结构，而
过去报道的 CDPK都含有 4个 EF手型结构~lO,1]。
Poovaiah等将这类激酶称为嵌合的钙调素激酶，研究
者认为该酶参与了植物细胞内的游离钙浓度变化的
感受(Chimeric calmodulin kinase，CCaMK)[1Z-14]。
尽管前人已从植物中克隆了一些钙调素激酶基
因，并认为这些激酶参与了植物体内钙、钙调素介导
的信号转导过程，但关于钙调素激酶在植物体内功
能的知识还是非常有限的。我们应用免疫组织化学
定位方法研究了玉米生长发育过程中MCK1的分
布规律，这将有助于我们进一步了解植物体内钙调
素激酶的功能。
1 材料和方法
1．1 材料
在玉蜀黍(Zea mays L．)的自然生长季节，将玉
米种子进行室外播种和常规化管理。当玉米苗长至
三叶期时取其根和叶进行固定，在开花前后取花序、
花药和雌蕊子房进行固定处理。固定液为 4 多聚
甲醛，4℃下固定时间 12 h。然后用叔丁醇七步系列
脱水[1引，石蜡包埋，Leica RM 2145切片机进行切
片，切片厚度 7 m。将切片置于用多聚赖氨酸处理
过的玻片上，在 42℃下烘干备用。
1．2 抗体制备和免疫分析
玉米钙调素激酶 MCK1抗体的制备、纯化及抗
体的免疫印迹鉴定按文献[16]的方法进行。
1．3 免疫组织化学定位
参考Lin等的方法[1 。组织切片经脱蜡和复水
后放入 0．3 H O 中10 rain，以除去内源过氧化物
酶活性；取出玻片，用 PBS洗 3次(每次 15 min)后，
在玻片上滴加封闭剂(PBS稀释的 10 正常羊血
清)，然后置于 37~C湿盒中温育 30 rain；倾去玻片上
的封 闭剂后，直接在玻 片上加1：500稀释 的一抗
(MCK1兔抗血清抗体)，于 37℃湿盒中温育 1 h；再
将玻片转入 PBS中洗 3次共 15 rain，在玻片上加
1：1 000稀释的过氧化物酶标记羊抗兔抗体，置于
37~C湿盒中反应 30 rain；最后用 PBS洗玻片3次共
15 rain，在玻片上加显色液显色 10 rain，显色液为
0．5 mg／mL 3，3一二氨基 联苯胺 盐 酸盐，0．03
Hz0z；水洗终止反应，脱水，封片。以正常兔血清代
替一抗为阴性对照。
2 结果
2．1 玉米钙调素激酶 MCK1抗体的鉴定
为了测试 MCK1抗体的特异性，将三叶期苗的
根尖和叶片匀浆离心，将上清液用于 MCK1抗体的
免疫印迹分析。结果所检测的样品均在 66 kD处出
现一条清析的免疫反应带(图 1)。分子量大小与根
据 MCK1氨基酸组成预测的一致[9]。这说明所制备
的抗体能够特异性地识别玉米钙调素激酶 MCK1。
A B
66kD一 ●謦
A．叶样品 ；B．茎样品 。二者在 66 kD都有
一 条明显的带出现
The reaction band emerged at 66 kD position for
both leaf(A)and root(B)samples
图 1 玉米钙调素激酶抗体的免疫印j蠢分析
Fig．1 Western blot with the antibody against
Ca ／CaM—dependent protein kinase MCK 1
2．2 MCK1在营养器官中的表达
我们应用免疫组织化学定位方法首先研究了
MCK1在玉米营养器官中的分布。结果表明，在生
长和发育过程中MCK1的表达受到严格的调节。在
根中钙调素激酶在根尖中很丰富，特别是在侧根原
基中表达量非常多，而在侧根原基周围的其它成熟
区域没有检测到激酶的分布(图版 I：A)。在叶片中
钙调素激酶在维管束鞘细胞中分布量很多(图版 I：
B)，但在其它的细胞如叶肉细胞、泡状细胞、表皮细
胞和维管束细胞中却没有检测到其分布 (结果未显
示)。在茎的成熟区域没有发现钙调素激酶的分布，
但芽中有少量分布 (结果未显示)。
2．3 MCK1在雌性生殖器官和胚中的表达
在花序发育的早期，有一定量的钙调素激酶在
小穗原基和小花原基中积累 (图版 I：C，D)。在幼嫩
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第 1期 饧万年等：钙调素激酶在玉米体内的免疫组织化学定位
的子房和胚珠中，MCK1比较均一地分布在子房和
胚珠的细胞内 (图版 I：E)。当胚囊发育成熟时，则
只有中央细胞和卵细胞中可以检测到一些钙调素激
酶，有趣的是在胚囊的中央细胞和卵细胞的交界处
有一个激酶分布带(图版 I：F)。MCK1在胚的发育
过程中也随着发育时期的改变而出现分布的变化。
在原胚时期，MCK1在原胚的头部有更多的分布
(图版 I：G)，而在分化胚中，MCK1更多地分布在分
生组织如胚芽等部分 (图版 I：H)。
2．4 MCKI在花药中的表达
钙调素激酶在花药中的分布随着发育时期的变
化而变化。在造孢细胞时期，MCK1在花药中表达，
但在造孢细胞和药隔维管柬中分布量更多(图版 Ⅱ：
A)。在小孢子母细胞形成期，MCK1广泛分布于花
药的各个部分如小孢子母细胞和花药壁各层细胞中
(图版 I：B)。在小孢子母细胞时期，大量激酶出现在
绒毡层和小孢子母细胞中，而在花药壁的其它部分
分布较少(图版 I：C)。而且随着减数分裂的进行，在
小孢子母细胞、四分体和绒毡层细胞中始终保持有
较高的表达量(图版 I：D，E)。在游离小孢子时期和
单核小孢子时期，绒毡层细胞中激酶水平仍然很高，
此时绒毡层已开始解体，在小孢子的细胞核中也检
测到 MCK1的存在(图版 I：F，G)。当花药发育到二
胞花粉和三胞花粉时期时，无论是花药壁还是花粉
粒中都已检测不到激酶的分布(图版 I：H)。值得注
意的是在花药的发育过程中，始终有较高水平的
MCK1分布在药隔维管束的薄壁细胞中(图版 I：
I)
3 讨论
多种信号引起的胞质钙浓度变化是启动细胞内
不同过程的关键，而细胞内蛋白质的磷酸化则在起
着放大和完成信号转导过程的作用[I-3]。在钙、钙调
素信号系统中，钙调素激酶一直被认为是钙调素下
游的关键因素。我们的研究结果表明，钙调素激酶广
泛分布于玉米体内，但其分布量随着发育过程而变
化。总体上看MCK1在玉米体内的分布规律与前人
报道的有关钙调素的分布规律是一致的[1 1 。因此
我们认为，在植物体内钙调素激酶介导的钙、钙调素
信号转导途径是普遍存在的。
动物方面的研究表明，钙调素激酶参与细胞周
期的调控[2。。在我们的研究中也发现MCK1广泛分
布于分裂活跃的细胞和组织中，如侧根原基、幼穗原
基、幼嫩子房与幼胚、幼嫩的花药细胞等。说明钙调
素激酶在植物体内可能也参与细胞周期的调节。我
们注意到在绒毡层细胞中始终分布有较高水平的钙
调素激酶，而且绒毡层中高水平激酶分布似乎与药
室内细胞的激酶分布是相对应的，即当绒毡层存在
时，药室内的细胞中就有较高水平的钙调素激酶分
布。在花药中绒毡层是药室内细胞与外界环境交流
的惟一中介组织，一直被认为是花粉发育和成熟的
重要结构。在绒毡层存在的时期，药室内细胞相继进
行 3次细胞分裂：①初生造孢细胞分裂产生小孢子
母细胞；②小孢子母细胞减数分裂产生四分体；③单
胞花粉分裂形成营养细胞和生殖细胞。当花粉发育
到二胞时期，绒毡层已解体消失，但玉米二胞花粉中
的生殖细胞还会进行一次分裂形成 2个精子。但从
二胞花粉到成 熟花粉过程 中我 们没有检 测到
MCK1在花粉中的分布。我们的结果暗示绒毡层细
胞内的MCK1可能与药室内的前 3次细胞分裂存
在着某些联系。这是一个值得深入研究的问题。
钙调素激酶在叶中有分布，但只存在于维管柬
鞘细胞中。玉米属于C 植物，其维管束鞘是卡尔文
循环发生的部位。我们在C。植物水稻的研究结果正
好与玉米中的情况相反，钙调素激酶只存在于水稻
叶片的叶肉细胞内，维管束鞘等细胞中没有分布，而
水稻叶片中卡尔文循环正是在其叶肉细胞内进行
的[2¨。前人曾有过关于钙、钙调素系统参与植物光
合作用调节的报道，但其机理并不清楚[2。 引。我们
的研究结果说明钙调素激酶介导的钙、钙调素信号
转导途径可能在植物光合作用的碳同化中起着重要
调节作用。
蛋白质在组织和细胞内的定位将为了解其功能
提供重要线索。动物方面有证据表明，钙调素激酶定
位于细胞核中，并且在基因转录调节中起着重要作
用[s,z4,zs]。在我们检测过的有激酶分布的多数细胞
中，其激酶是否分布在核中还有待于作深入的电
镜分析，但钙调素激酶在胚囊的极核、单核花粉和卵
细胞的细胞核中的分布却是肯定的 (图版 I：F)。但
蛋白质如果最终定位于细胞核中，其序列中应存
在 着 核 定 位 信 号 (Nuclear localization signal，
NLS)[z4,zs]，但从 MCK1的 cDNA分析，其蛋 白序
列中没有经典的NLS存在，这方面还有待于深入的
研究和分析。
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第 1期 杨万年等：钙调素激酶在玉米体内的免疫组织化学定位 37
杨万年等 ：图版 I YANG Wan—Nian et a1．：Plate I
图版 I：MCK1在玉米营养器官和雌性生殖器官中的定位。A．根横切．短箭头示侧根原基；B．叶维管柬部分的放大，箭头示
MCK1在维管柬鞘细胞内分布；C．雌花序横切，箭头示 MCK1分布于小穗原基中；D．雌花序横切，箭头示 MCK1分布于小花
原基中；E．幼嫩子房纵切示 MCK1在子房、胚珠等细胞中的分布；F．成熟胚囊纵切示极核、卵细胞中的分布(it意：在中央细
胞和卵细胞的界面上有明显的分布带)；G．原胚纵切示 MCK1在原胚头部分布；H．分化胚纵切后胚芽部分的放大，示 MCK1
更多地分布在分生区；I．小孢子母细胞时期花药横切，示对照。图中所有标尺一2O m
Plate I：Immunohistochemical localization of MCK1 in vegetative organs and female reproductive organs．A．Transverse see—
tion of root shows MCK1 in lateral root primordium (arrowheads)；B．The magnification of a leaf vascular bundle shows
MCK1 in sheath cells(arrows)；C．Female inflorescence transverse section shows MCK1 in spikelet primordia(arrowheads)；
D．Female inflorescence transverse section shows M CK1 in floret primordia(arrowheads)；E．Young ovary longitudinal section
shows that MCK 1 distributed in various cells widely；F．I ongitudinal section of mature embryo sac shows MCK 1 in the polar
nuclear(1arge arrowhead)，egg cell(arrow)and the interface between the central cell and egg cell(1ittle arrowheads)；G．Lon—
gitudinal section of proembryo shows more MCK1 in the proembryo head (arrowhead)；H．Amplification of embryo bud of dif—
ferentiating embryo shows MCK1 in the meristem (arrowhead)；I．Transverse section of the anther at microspore mother cel
stage shows the negative contro1．Bar=2O“m
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38 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
杨万年等：图版 Ⅱ YANG Wan—Nian et a1．：Plate I
图版 I：MCK1在玉米花药中的定位(所有图片均为横切)。A．造孢细胞时期，箭头示 MCK1分布于造孢细胞中；B．小孢子母
细胞形成时期，MCK1广泛分布于花药的各个部分，箭头示花药壁；C～E．减数分裂时期，大量 MCK1分布于绒毡层、小孢子
母细胞和四分体细胞中；F，G．游离小孢时期到单核小孢时期，仍有 MCK1分布于小孢子和正在解体的绒毡层细胞中；H．成熟
花粉时期，花粉和花药壁中都检测不到 MCK1的存在 ；1．成熟花粉时期药隔维管束的放大，示 MCK1在该区域部分细胞中的
分布。图中所有标尺一20／zm
Plate I：Immunohistochemical localization of M CK1 in anthers．Al photographs were from transverse sections．A．At sporoge—
nous stage，much MCK1 distributed in sporogenous cels(arrow)；B．At microspore mother cel forming stage，MCK1 dis—
tributed ubiquitously in al parts of anthers including microspore mother cells and anther walls．The arrowheads show the an—
ther wall；C—E．At meiosis stage，high level of MCK1 distributed in Tapetum (arrow)and microspore mother cels and te—
trads(arrowheads)；F，G．From free microspore stage til unicellular pollen stage，much MCK1 still distributed in microspores
(arrowheads)and disaggregating tapetum (arrows)；H．At mature pollen stage，no MCK1 is detected in pollens or anther wall
cells；I．Amplification of a connective vascular bundle at premature polen stage shows much MCK 1 can stil be detected in
some regions．Bar一 20／zm．
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